外源性硫化氢减轻小鼠阻塞性肾损伤

目的:探讨外源性硫化氢(H2S)在小鼠阻塞性肾损伤中的保护作用及可能机制。方法:将8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、手术组和H2S组,每组5只,单侧输尿管结扎(UUO)构建肾阻塞模型,H_2S组小鼠腹腔注射H_2S供体硫氢化钠(Na HS),手术组和假手术组小鼠注射等体积的生理盐水,每天1次。7 d后处死小鼠,取出肾脏,提取RNA行RT-PCR检测3组小鼠肾脏内源性H_2S催化酶mRNA表达的差异;组织HE染色观察3组小鼠肾脏的组织结构的变化;Masson染色检测3组小鼠肾脏纤维化的差异;检测血浆胱抑素C含量来反映肾小球滤过能力;Western blot检测LC3、beclin-1和纤连蛋白(FN)蛋白表达的变化。结果:与假手术组相比,手术组小鼠肾脏中胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)的mRNA表达显著降低,胶原纤维显著增多,而H_2S组小鼠肾组织胶原纤维又比模型组显著减少。与假手术组相比,手术组小鼠肾脏中FN的蛋白表达显著升高,而H_2S组小鼠的FN表达量比手术组小鼠显著降低;与假手术组相比,手术组和H_2S组小鼠肾组织细胞中LC3-II和beclin-1蛋白表达均显著增高,而H_2S组小鼠肾组织细胞中LC3-II和beclin-1蛋白表达又显著高于手术组。结论:外源性H_2S可能通过上调细胞自噬而减轻UUO小鼠的肾纤维化。     

ATG5敲低后抑制人肺癌细胞H1299自噬并增强南蛇藤素诱导的细胞凋亡

目的构建自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)低表达肺癌细胞株,观察肺癌细胞自噬活性,检测南蛇藤素对肺癌细胞凋亡的影响。方法用ATG5 shRNA技术构建ATG5敲低的人肺癌H1299细胞株作为ATG5敲低组,未敲低ATG5的H1299细胞作为对照组;荧光定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中ATG5的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)及死骨片蛋白1的(sequestosome 1,P62)表达,并转染红色荧光标记的LC3质粒观察LC3斑点聚集情况;经南蛇藤素刺激后,以流式细胞术检测细胞凋亡,最后使用Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果慢病毒感染组ATG5较对照组mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);ATG5敲低后LC3-Ⅱ水平下降,P62水平上升,并且转染后RFP-LC3斑点聚集减少(P0.05)。相比对照组,南蛇藤素明显促进ATG5敲低细胞凋亡(P0.01);ATG5敲低组中促凋亡分子Bax、cleaved caspase-3表达比对照组明显增加(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P0.05)。结论 ATG5敲低抑制肺癌细胞自噬后,南蛇藤素能够明显增强人肺癌细胞的凋亡,提示抑制肺癌细胞自噬可能为针对性处理肺癌细胞耐药提供新的思路。     

二氢杨梅素对APP/PS1转基因小鼠学习记忆和脑内自噬的影响

目的:研究二氢杨梅素(DHM)能否通过影响自噬对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠发挥保护作用。方法:实验动物分为3组:7月龄的APP/PS1转基因痴呆模型小鼠随机分为AD组和DHM组,同月龄野生型(WT) C57BL/6J小鼠作为WT组,每组10只。DHM处理DHM组,同浓度DMSO稀释液处理AD组和WT组。采用Morris水迷宫实验检测各组学习记忆功能;免疫组织化学(IHC)、甲硫素S(ThS)染色以及ELISA法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的水平; Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62、Cathepsin D和LAMP1的表达水平;透射电镜检测脑内自噬结构微观变化。结果:与WT组相比,AD组小鼠在水迷宫检测中平均潜伏期、探索路径增长(P 0.01),穿越平台次数减少(P 0.01);脑内Aβ斑块增加(P 0.01),出现较严重的水肿,并发现了深染的晚期自噬体; LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P 0.01),p62、LAMP1和Cathepsin D表达增加(P 0.01); DHM处理后可以改善AD小鼠的学习记忆功能(P 0.05); Aβ斑块减少(P 0.05),水肿现象减轻,并发现了自噬溶酶体的存在; Beclin1表达增加(P 0.01),p62、LAMP1和Cathepsin D表达减少(P 0.01)。结论:DHM能够通过促进Aβ的降解,以减少Aβ沉积形成的老年斑,进而改善AD小鼠的学习记忆能力。     

突触融合蛋白17通过调节自噬减少阿尔茨海默病细胞模型中淀粉样物质沉积

目的：探究突触融合蛋白17(STX17)对小鼠海马神经元HT22细胞中自噬和淀粉样物质沉积的影响及可能机制。方法：用慢病毒介导HT22细胞内淀粉样前体蛋白（APP）和STX17过表达，RT-qPCR检测慢病毒感染后各组细胞中APP和微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)及STX17的mRNA表达情况。刚果红染色观察HT22细胞中淀粉样物质沉积情况。Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达。免疫荧光观察细胞中STX17定位，以及LC3-II定位和斑点数量。结果：HT22细胞成功过表达APP后，淀粉样物质沉积增多，STX17表达下降，STX17主要定位在细胞质内，LC3-II和P62表达明显增多。过表达STX17后，LC3-II和P62表达下降，淀粉样物质沉积减少。结论：STX17通过调节自噬减少阿尔茨海默病淀粉样物质沉积。     

lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖及自噬的影响

目的研究lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和自噬的影响,探讨lncRNA HOTAIR调控胃癌细胞自噬的机制。方法收集2015年1月—2017年12月于中国医科大学附属肿瘤医院确诊为胃癌的60例癌组织及其配对癌旁组织;实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测HOTAIR表达水平,CCK-8实验检测siHOTAIR及si-ATG3对细胞增殖影响,蛋白免疫印迹实验检测HOTAIR对细胞自噬水平及ATG3表达水平影响,免疫荧光实验检测HOTAIR对胃癌细胞自噬的影响。结果 HOTAIR在胃癌组织及癌细胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901中表达水平显著高于癌旁正常组织及人胃黏膜细胞株GES-1。通过转染si-HOTAIR,构建胃癌HOTAIR干扰细胞株;与空载对照组相比,HOTAIR干扰组胃癌细胞增殖水平降低,胃癌细胞自噬标志蛋白LC3表达水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比例降低,P62表达增高,自噬相关蛋白ATG3表达亦降低。结论胃癌组织中HOTAIR表达上调,抑制HOTAIR促进了胃癌细胞增殖能力;且HOTAIR能够通过ATG3促进自噬水平。     

lncRNA PVT1促进卵巢癌细胞自噬相关机制研究

目的探究长链非编码RNA PVT1对卵巢癌细胞自噬的影响及其调控机制。方法 Real-timePCR检测PVT1在卵巢癌组织样本中表达情况及PVT1在卵巢癌细胞株中的表达;免疫荧光实验和Western blot检测过表达PVT1对卵巢癌细胞自噬水平的影响;Western blot用于研究过表达PVT1对自噬相关蛋白ATG7表达的影响;利用共转染实验验证PVT1通过上调ATG7从而影响自噬水平。结果 Real-time PCR结果表明卵巢癌组织中PVT1的表达水平高于正常组织,各卵巢癌细胞系(ES2、OVCAR3、A2780)中PVT1表达高于正常卵巢细胞系(HOSEpiC)。Western blot和免疫荧光实验结果表明,与对照组相比,过表达PVT1能增加自噬标志蛋白LC3II/LC3I比例,能够显著促进卵巢癌细胞的自噬并通过上调ATG7的表达促进细胞自噬的发生。结论 lncRNA PVT1能够上调ATG7表达,促进卵巢癌细胞自噬的发生,有望成为卵巢癌新的治疗靶点。     

髓样细胞表达的触发受体1抑制LPS应激下巨噬细胞的自噬

目的　观察髓样细胞表达的触发受体1（TREM-1）对脂多糖（LPS）应激下巨噬细胞自噬相关基因表达的影响。 方法　观察LPS应激下的巨噬细胞TREM-1蛋白的表达。分别选用TREM-1的激动剂（MAB1187）和TREM-1的拮抗剂（LR12）作用于巨噬细胞,利用qPCR检测巨噬细胞自噬相关基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）mRNA的表达;采用Western Blot检测巨噬细胞TREM-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达;采用免疫荧光检测在LPS应激与TREM-1激活的情况下,巨噬细胞的自噬标志蛋白LC3表达。 结果　LPS（400 ng/mL、1000 ng/mL）应激下巨噬细胞TREM-1蛋白表达明显增加;LPS（1000 ng/mL）作用巨噬细胞24 h,巨噬细胞TREM-1蛋白表达达到峰值。LPS应激的巨噬细胞自噬基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志分子LC3 mRNA表达均降低;当给予TREM-1拮抗剂后,巨噬细胞的ATG7、ATG5、ATG12、LC3 mRNA表达均升高,而采用TREM-1激动剂后,自噬基因表达被抑制。Western Blot检测结果显示,TREM-1可抑制LPS应激下巨噬细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达。免疫荧光检测表明TREM-1激动剂可使巨噬细胞胞内的LC3蛋白表达量减少。 结论　巨噬细胞胞膜上TREM-1激活后,可使巨噬细胞自噬减弱,提示LPS应激下的巨噬细胞TREM-1可能通过抑制巨噬细胞的正常自噬从而发挥炎症放大作用。     

小檗碱对人骨髓增生异常综合征细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制

为探讨小檗碱(Berberine, Ber)对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)细胞MUTZ-1自噬活性的影响及机制,以MTT法检测Ber对MUTZ-1细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC_(50)),并绘制增殖抑制率曲线;免疫荧光法测定细胞中LAMP1表达;Western blotting测定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p-mTOR、Beclin-1、p-Akt、p-ERK、ATG3、ATG4、ATG5、ATG7蛋白表达。结果显示,Ber作用后MUTZ-1细胞增殖抑制水平随时间而增强,Ber对MUTZ-1细胞24、48 h的IC_(50)分别为265.1μmol/L和143.2μmol/L;LAMP1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间而增加;Beclin-1、ATG3、ATG5表达水平增加,p-mTOR、p-Akt表达水平降低,p-ERK、ATG4、ATG7表达水平无明显变化。由此说明Ber可抑制MUTZ-1细胞增殖并诱导其自噬,自噬的诱导与Beclin-1、ATG3、ATG5表达上调和mTOR活性受抑制有关。     

自噬在熊果酸抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用

目的:研究自噬在熊果酸(UA)抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用及机制。方法:应用MTT法和台盼蓝拒染法检测UA对PC9细胞增殖的影响。吖啶橙染色法在荧光显微镜下观察UA对PC9细胞自噬的影响。Western blot检测自噬相关蛋白LC3及ATG5的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)观察UA对PC9细胞增殖的抑制作用。结果:UA可以显著抑制PC9细胞的活力(P0.05或P0.01),随着给药剂量和时间的增加,UA对PC9细胞的生长抑制率显著上升。UA诱导PC9细胞自噬体表达增加,并诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和ATG5表达的增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了UA对PC9细胞的抑制作用(P0.01)。结论:UA抑制PC9细胞的增殖,并诱导细胞发生自噬。UA诱导PC9细胞自噬的机制有可能依赖ATG5细胞自噬途径。自噬抑制剂3-MA能够增强UA对PC9细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

miR-30a通过靶向调控Beclin-1、ATG5影响食管癌细胞自噬及增殖过程北大核心CSCD

目的:探究miR-30a通过靶向调控Beclin-1、ATG5表达对食管癌细胞自噬及增殖过程的影响。方法:靶基因预测、双荧光素酶报告实验验证miR-30a对Beclin-1、ATG5的靶向调控作用。GEO、Human Protein Atlas和GEPIA在线分析TCGA数据库和GTEx项目中食管癌组织及癌旁组织miR-30a、Beclin-1、ATG5表达、患者预后生存期。免疫组化检测45例食管癌及癌旁组织标本Beclin-1、ATG5表达,并分析Beclin-1、ATG5表达与患者临床病理参数的关系。采用脂质体LipofectamineTM3000将靶向Beclin-1、ATG5的miR-30a-mimic转染至Eca-109细胞,体外常规培养并分为3组:未转染组(control组)、转染无义RNA的阴性对照组(mimic NC组)、转染miR-30a-mimic的干扰组(miR-30a组)。MTT和克隆形成实验测定细胞增殖活力;qRT-PCR检测miR-30a、Beclin-1、ATG5 mRNA表达;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测Beclin-1、ATG5、LC3Ⅱ、p62蛋白表达。透射电镜观察细胞自噬泡形成情况。结果:生信分析结果显示,食管癌组织中miR-30a表达高于正常组织,Beclin-1、ATG5表达低于正常组织,且预后生存期与miR-30a表达呈负相关,与Beclin-1、ATG5表达呈正相关(P<0.05)。与control组和mimic NC组相比,miR-30a组细胞增殖、迁移和侵袭能力、p62蛋白表达明显升高,Beclin-1、ATG5、LC3Ⅱ表达、细胞自噬活力明显降低(P<0.05)。而control组与mimic NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-30a靶向调控Beclin-1、ATG5表达;Beclin-1、ATG5在食管癌组织和细胞中表达均降低,具有肿瘤抑制基因作用,可能通过抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭、促进自噬发挥抑癌作用,为通过靶向调控自噬途径治疗食管癌提供了新思路。     

高脂饮食通过p-AMPK/mTOR信号通路下调小鼠肝细胞自噬水平

目的探讨高脂饮食对小鼠肝细胞自噬的影响并分析其可能机制。方法将C57BL小鼠随机分为2组,每组n=15,给予常规饮食(NC)或高脂饮食(HFD)喂养,8、12和16周后每组随机处死5只小鼠,测体质量、肝质量、内脏脂肪质量;油红(Oil-Red-O)染色测肝脂质沉积;Western blot检测肝脏自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和自噬调控信号通路蛋白p-mTOR和p-AMPK的表达。结果 8周时,HFD组小鼠出现腹型肥胖,16周时小鼠体质量、内脏脂肪质量及肝脂滴沉积较NC组明显增加(P<0.01);HFD组8周时肝脏LC3Ⅱ表达较NC组增加(P<0.05);而12及16周肝脏LC3Ⅱ表达较NC组显著降低(P<0.05);P62表达较NC组明显增加(P<0.05)。与NC组相比,HFD组各时间点肝脏p-AMPK表达均减少,而p-mTOR蛋白表达均显著增加。结论高脂饮食初期小鼠肝细胞自噬短暂增加,但长期高脂饮食可导致肝细胞自噬水平显著下调甚至衰竭,肝细胞自噬水平下调与高脂饮食抑制肝细胞p-AMPK表达及增加p-mTOR的活性有关。     

miR-17抑制ATG7介导的自噬促进小鼠肝细胞胰岛素抵抗

目的：探讨细胞自噬在小鼠肝细胞胰岛素抵抗中的作用以及microRNA调控自噬的机制。方法通过高脂饮食诱导小鼠糖尿病模型, Western印迹检测高脂饮食组小鼠肝细胞自噬相关蛋白（ autophagy?re?lated protein 7, ATG7）的表达。生物信息学预测调控ATG7的候选microRNA。借助于双荧光素酶报告基因方法验证miR?17对ATG7的靶向调控作用。采用葡萄糖胺诱导小鼠肝原代细胞的胰岛素抵抗模型,验证miR?17调控自噬对小鼠原代肝细胞胰岛素敏感性的作用。结果高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗模型中肝细胞ATG7蛋白表达显著下调,而miR?17的表达增高。双荧光素酶报告基因检测结果显示, miR?17可以直接结合于ATG7的3′UTR靶向调控ATG7,降低其的表达。小鼠肝原代细胞胰岛素抵抗模型的结果表明,抑制内源性miR?17的水平可以上调ATG7蛋白表达,增强细胞胰岛素敏感性。结论 miR?17通过靶向调控小鼠肝细胞中自噬相关蛋白ATG7的表达,抑制细胞自噬,参与了肝细胞的胰岛素抵抗。     

谷氨酸诱导大鼠胃Cajal间质细胞自噬模型的建立

目的:通过谷氨酸诱导离体大鼠胃Cajal间质细胞(ICCs)建立细胞自噬模型。方法:使用高、中和低浓度(分别为10 mmol/L、5 mmol/L和2.5 mmol/L)的谷氨酸作用于原代培养的ICCs不同时间(3h、6h和24h),然后通过CCK-8法检测不同浓度谷氨酸对ICCs活力的影响;Western blot检测不同浓度谷氨酸在不同作用时点对ICCs自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平的影响;透射电镜观察谷氨酸干预后细胞内自噬体和超微结构的变化;免疫荧光检测谷氨酸诱导后自噬蛋白LC3的荧光表达。结果:与空白对照组相比,谷氨酸显著降低了大鼠胃ICCs活力(P0.01)。中、高浓度谷氨酸作用不同时间均可显著提高自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值(P0.01),其中以中浓度谷氨酸作用3 h的LC3-II/LC3-I比值最高(P0.01)。透射电镜检测中浓度谷氨酸干预3 h发现,细胞内自噬体数量明显增加,线粒体和内质网数量及结构遭到破坏。免疫荧光结果提示,与空白对照组比较,谷氨酸中浓度组平均每个细胞内自噬蛋白LC3荧光表达显著增强(P0.01)。结论:应用谷氨酸可成功诱导大鼠胃ICCs自噬,谷氨酸的最佳诱导条件为5 mmol/L作用3h。     

熊果酸通过影响线粒体功能诱导TC-1肿瘤细胞自噬性死亡

目的探讨线粒体失能和线粒体自噬在熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬相关性死亡中的作用。方法同一批TC-1癌细胞分成对照组和熊果酸(UA)处理组,通过透射电镜(TEM)观察以及PI染色标记死细胞;利用流式细胞术检测线粒体膜跨电位(Δψm)及细胞内ATP和ROS水平变化;分光光度法检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性;利用吖啶橙(AO)染色来检测自噬;荧光显微镜下观察线粒体与自噬标志蛋白LC3的位置关系;Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白PINK1和Nix表达;以及检测对照组和UA处理组在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和自噬缺乏(Atg5-/-)的MEFs中ROS水平变化。结果 UA 30μmol/L作用TC-1细胞6 h后,可见大量细胞的线粒体出现了显著异常;UA不仅降低线粒体膜电位和ATP水平(P0.05),而且抑制线粒体复合酶Ⅰ~Ⅳ的活性(P0.05),且均呈现时间与剂量依赖;UA还降低TC-1肿瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)内的ROS水平,但是在自噬缺乏(Atg5-/-)的MEFs中ROS水平未受影响(P0.05);吖啶橙(AO)染色发现UA还可增加自噬溶酶体的数量,并呈剂量依赖;经UA处理的细胞,无论是自噬相关蛋白LC3与线粒体共定位,还是参与损伤线粒体清除的线粒体自噬相关蛋白PINK1和Nix均表达增高。结论 UA通过诱导线粒体自噬清除部分ROS并导致线粒体功能损伤;线粒体失能与线粒体自噬至少部分参与UA诱导的TC-1肿瘤细胞自噬性死亡。     

苦参碱通过 MAPK/mTOR 信号通路诱导 IMCD3 细胞自噬及机制研究

目的:通过观察苦参碱对小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞(IMCD3)自噬的影响,探讨苦参碱诱导细胞自噬可能的分子机制。方法:在小鼠IMCD3中加入不同浓度的苦参碱(0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml),检测苦参碱对细胞活性、细胞的凋亡以及细胞自噬的影响;采用Western blot检测自噬相关的蛋白LC3、ERK、p-ERK、p53、Beclin-1、p70S6K、p-p70S6K、AKT、p-AKT表达水平的变化。结果:当苦参碱浓度为0、0.2、0.4、0.8 mg/ml时,IMCD3活性以及凋亡坏死没有明显变化,当苦参碱浓度为1.6 mg/ml时,细胞凋亡坏死明显增加;苦参碱处理后,细胞中自噬小体的数量明显增加;随着苦参碱处理浓度的增加,细胞中LC3蛋白表达明显升高,p-ERK、p-p70S6K表达明显减弱,ERK、p70S6K、p53、Beclin-1、AKT和p-AKT等蛋白表达无明显变化。结论:苦参碱可通过抑制MAPK/mTOR信号通路的活化促进小鼠IMCD3的自噬。     

法舒地尔对TGF-β诱导尿道成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成的影响

目的探究法舒地尔对TGF-β诱导尿道成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成的影响。方法无菌条件下获得家兔尿道瘢痕组织,采用酶解法提取原代尿道成纤维细胞,用10 ng/m L TGF-β或者联合不同浓度(0,25,50μM)法舒地尔处理后,通过Western blot检测α-SMA、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和自噬以及迁移相关蛋白的表达。采用Transwell实验和MTT实验分别检测成纤维细胞迁移以及增殖能力。结果 Western blot结果显示,TGF-β明显上调了α-SMA蛋白、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ,法舒地尔下调了胞外基质蛋白表达(P 0.05),并且呈浓度依赖性。Transwell实验和MTT实验显示,TGF-β增加了细胞迁移数量和细胞活性(P 0.05),而法舒地尔抑制了细胞迁移数量(P 0.05),下调了细胞活性(P 0.05)。Western blot结果还显示,TGF-β显著下调了p AKT、pm TOR和p62等蛋白表达(P 0.05),上调了ATG7、ATG5、LC3等自噬相关蛋白表达(P 0.05);而法舒地尔上调了p AKT、pm TOR和p62等蛋白表达(P 0.05),抑制了ATG7、ATG5、LC3等自噬相关蛋白表达(P 0.05)。结论法舒地尔可以通过激活细胞自噬从而抑制TGF-β诱导的成纤维细胞增殖、迁移以及胞外基质合成,其作用与促进AKT/m TOR信号通路相关。     

外源性硫化氢对小鼠原代肝细胞内脂质自噬分解的影响

目的:研究硫化氢(H2S)供体GYY4137释放的外源性H2S对小鼠原代肝细胞内脂质自噬分解的影响。方法:采用2步原位灌流法分离C57BL/6小鼠原代肝细胞并分为4组:用正常培养基培养正常组细胞;模型组用含1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养基培养48 h;H2S组和炔丙基甘氨酸(PAG)组则用1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液培养48 h,然后换无血清无酚红的RPMI-1640培养液(同时分别给予1 mmol/L GYY4137和200μmol/L PAG)处理6 h。收集各组细胞做LC3免疫荧光染色,拍摄荧光和相差图片;Western blot检测肝细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ的蛋白表达量;透射电镜观察肝细胞超微结构。结果:和模型组相比,H2S组肝细胞内LC3荧光颗粒和蛋白表达量增加,自噬溶酶体数量增加,细胞内空泡增多。结论:外源性H2S可促进脂肪变性肝细胞内脂质自噬分解。     

下调Notch1基因促进人肝癌细胞系HepG2自噬

目的探讨Notch1基因对人肝癌细胞系HepG2的增殖、凋亡、自噬及Akt/mTOR信号通路的影响。方法选择于新乡医学院第三附属医院行肝癌手术治疗患者的肝癌组织32例,荧光定量PCR检测Notch1 mRNA的表达。构建Notch1 siRNA真核表达载体,经脂质体转染入HepG2细胞中,应用RT-qPCR及Western blot鉴定Notch1的干扰效果,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、cleared-caspase-3,自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达。结果 Notch1基因在原发性肝细胞癌组织中的相对表达量(1.865±0.791)显著高于癌旁组织(0.709±0.414)(P0.001)。Notch1 siRNA转染HepG2细胞后,Notch1 siRNA组中Notch1 mRNA及蛋白的表达均显著低于NC siRNA组和对照组(P0.001)。Notch1 siRNA组24、48、72及96 h的细胞增殖率显著低于NC siRNA组和对照组(P0.001)。转染48 h后,Notch1 shRNA组细胞的凋亡率及Bax水平显著高于NC siRNA和对照组,而Bcl-2、cleaved caspase-3的表达显著低于NC siRNA组和对照组(P0.001)。Notch1 siRNA组细胞中自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5的表达量显著高于NC siRNA组和对照组(P0.001)。而Notch1 siRNA组的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表达量显著低于NC siRNA组和对照组(P0.001)。结论下调Notch1基因的表达可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,提高细胞的自噬水平,其机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路有关。     

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的 探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞，设置小干涉RNA对照(si-NC)组、 si-NC联合BCG组、 Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平，利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果 与si-NC组相比，BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、 LC3和ATG5蛋白表达均升高、 LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加；与BCG组感染的TC-1细胞相比，si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、 LC3、 P62及ATG5蛋白表达均显著降低，LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论 敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。     

氯化锂通过调节自噬通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:研究氯化锂(Li Cl)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)神经分化的影响,并探讨自噬通路在其中的作用。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞分为Li Cl组和对照组,采用β-巯基乙醇诱导MSCs向神经细胞分化,免疫荧光法和Western blot法检测诱导后神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化。进一步采用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预自噬,Western blot法观察NSE和MAP-2的表达变化。结果:诱导分化后,Li Cl组及对照组细胞均有NSE和MAP-2表达,Li Cl组细胞NSE和MAP-2蛋白阳性表达率及表达量均大于对照组(P0.05);此外,Li Cl组细胞LC3阳性荧光点以及LC3-Ⅱ表达量亦多于对照组(P0.05)。加用雷帕霉素可进一步促进Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05),而3-MA则抑制Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05)。结论:氯化锂可能通过调节自噬通路促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。