用FPLC系统提纯可溶型Ⅱ型胶原蛋白

目的 采用FPLC系统提取纯化可溶型Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）。方法 采用鸡剑突软骨。经胃蛋白酶消化离心,再使用FPLC系统进行DEAESepharoseFF高效液相镦子交换层析和脱盐柱脱盐,得到纯化的CⅡ。结果 自提的CⅡ纯品与CⅡ标准品电泳结果带型一致。结论 本法提纯蛋白效率高。重复性好,快速简便。     

一种白血病小鼠自分泌T细胞抑制因子的部分纯化及性质研究

我们前文报道在L7811腹水型白血病小鼠的腹水中存在一种白血病相关自身抑制因子(LAI—615),本文用Sephadex G—150凝胶层析,DEAE纤维素离子交换层析和FPLC快速蛋白液相层析三步纯化,将LAI—615纯化了1306倍。研究发现其分泌产生与Lyt2~+ T细胞的出现有关。LAI—615可能是T细胞抑制因子(TsF)一类的物质。     

一种用于实体瘤诊断的磁共振成像(MRI)生物大分子对比增强剂的合成与鉴别

通过二步法成功地合成一系列N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物-Proxyl接合物，以紫外可见分光光度法测定聚合物中Proxyl的含量，电子自旋共振图谱仪测定接合物的电子自旋共振图谱(ESR)，快速蛋白液相色谱仪(FPLC)测定分子大小分离图谱(Size exclusion chromatography)。结果表明，对比剂Proxyl确已连接于聚合物上，伴以HPMA大分子聚合物对实体瘤的靶向特性，说明此聚合物用于MRI具有一定的可行性。     

抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2半成品的制备与质量控制

目的制备符合人用标准的抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2 片段。方法用胃蛋白酶消化经硫酸铵盐析的腹水抗体 ,然后在快速蛋白液相色谱(FPLC)上用Phenyl SepharoseHP疏水柱纯化并进行质检。结果经Phenyl SepharoseHP疏水柱纯化后 ,F(ab′)2 片段的纯度可达98.8% ;回收率大于50 % ;免疫活性为1∶8000;细菌、热原质检测均呈阴性。结论本制备工艺周期短、易于质控 ,适宜进行中试放大及半成品生产。     

白血病细胞膜相关的降低红细胞滤过率因子的初步分离

粒单型人白血病细胞系J6-1的培养液、冻化液可明显降低正常红细胞滤过率,J6-1细胞冻化液及膜冻化液经Sephadex G-100凝胶过滤及快速蛋白液相层析(FPLC)Mono Q,初步分离J6-1细胞膜上存在的降低红细胞溶过率的活性物质,分子量为13 KD～19KD,具糖结合蛋白性质。此物质对红细胞滤过率的改变是由其变形性改变所致。     

刺激人γδ+T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的纯化与活性鉴定

目的：纯化可刺激人γδ^ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原。方法：采用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）S-100分子筛层析柱，对结核杆菌耐热抗原（Mtb-Ag)初步分离，将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原（Mtb-LW-Ag)洗脱峰，分别再经FPLCMonoQ离子交换层析柱进一步纯化，并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ^ T细胞增殖活性的测定。结果：Mtb-Ag经FPLCS-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰（B，C，D），Mr低的多肽峰分别糨MonoQ柱层析，鉴定出B峰含有6个主峰，C峰含有1个主峰，D峰含有8个主峰，对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测，发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ^ T细胞扩增。结论：利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽，而且其中的B-Ⅲ多肽的C-主肽可能是促进γδ^ T细胞活化增殖的主要多肽。     

可激活人γδT细胞的结核杆菌耐热多肽抗原的初步纯化与活性鉴定

目的：对结核杆菌耐热多肽抗原（Mtb-Ag)的蛋白组成进行定性分析。并观察Mtb-Ag及其纯化组分刺激人外周血γδT细胞和αβT细胞增殖反应的量效关系。方法：用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）定性分析Mtb-Ag 的蛋白组成，并用不同剂量的Mtb-Ag及其纯化组分体外刺激健康人外周血PBMC，培养9d后经流式细胞仪检测细胞表型。结果：Mtb-Ag经FPLC Mono Q离子交换柱分析存在20种蛋白成分，Mtb-Ag在合适刺激剂量时对人γδT细胞发挥优势扩增，当剂量过大则对αβT细胞发挥优势扩增，其分离纯化的含大分子蛋白的蛋白峰Ⅰ随着刺激剂量增加而对αβT细胞的扩增表现显著增强趋势；而其分离的含低分子多肽的蛋白峰Ⅱ随着刺激量增加则对γδT细胞扩增表现显著增强趋势，并且其活性明显高于蛋白峰I，同时其对αβT细胞的扩增效应并不明显，并显著低于Mtb-Ag和蛋白峰I。结论：Mtb-Ag刺激γδT细胞扩增时应选择合适的刺激剂量，其所含的低分子多肽抗原能特异性激活γδT细胞，而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活αβT细胞。     

单克隆抗体对体外培养恶性疟原虫的保护性抑制作用

采自非洲恶性疟患者的带虫血、用EBY转化方法培养出五株人恶性疟原虫单克隆抗体:11_n13 (IgG)、CE22-14 D10(IgM)、38.16(IgM)39.53Ⅱ(IgM)及HOO_(2-2)G_9(IgG)、经过FPLC纯化、Amicon膜浓缩、ELSA或FSPC测定含量。含量在15～100g/ml。 以~3H-次黄瞟呤渗入疟原虫DNA方法,放射活性的高低表示症原虫生长或受抑制、用不同浓度的上述单克隆抗体与症原虫共同培养,同时加入~3H-次黄嘌呤,48小时后测定放射活     

促肝细胞生长素及其S4组份对人PBMC表型的影响

本文采用生物素 链霉亲和素 (BSA )免疫细胞化学法及流式细胞仪技术检测CD3+、CD4+、CD8+、HLA DR+及CD2 5 +细胞百分率 ,藉以研究促肝细胞生长素 (pHGF )及其组分S4对免疫活性细胞的作用。结果表明 ,pHGF可使脐血中CD4+、CD8+及HLA DR+细胞数有明显增长 ;对正常人及肿瘤患者PBMC的HLA DR+细胞数亦有促进作用 ,与PHA的刺激作用相近似。用FPLC及HPLC等方法分离的单一成分S4对成人PBMC表面CD2 5抗原表达有明显促进作用。     

经点突变的花生主要过敏原Ara h2低致敏原的制备与鉴定

目的构建经点突变的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。方法将Ara h 2基因进行点突变,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的过敏原性。结果测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明经点突变的Ara h 2蛋白(M-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论成功构建了经点突变的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原的潜能。     

花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定

目的 :用重组Bac TRⅡ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF βRⅡ /Fc,并对其进行纯化及鉴定 ;验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF β1的生物学作用。 方法 :采用病毒空斑形成试验测定病毒滴度 ,并对其进行扩增。采用Pro teinG柱和快速蛋白质液相层析法 (FPLC)纯化目的蛋白。采用SDS PAGE分析纯化后的目的蛋白 ,并将蛋白电泳条带进行灰度扫描 ,计算目的蛋白的含量。采用Westernblot和夹心ELISA法 ,鉴定目的蛋白是否表达。采用MTT比色法 ,验证融合蛋白TGF βRⅡ /Fc能否阻断TGF β1对小鼠肺成纤维细胞 (L92 9)生长的作用。采用Westernblot技术 ,验证融合蛋白能否阻断TGF β1对L92 9细胞纤维黏连蛋白 (FN)生成的促进作用。结果 :本实验室构建并保存的重组Bac TRⅡ杆状病毒原液内病毒的滴度为 2× 10 12 pfu/L。蛋白电泳后灰度扫描结果表明 ,目的蛋白约占总蛋白的 10 %。夹心ELISA法和Westernblot分析证明目的蛋白已表达。融合蛋白TGF βRⅡ /Fc能够阻断TGF β1对L92 9细胞生长的抑制作用 ,以及对该细胞FN生成的促进作用。结论 :本室构建的重组Bac TRⅡ杆状病毒表达系统 ,能够表达融合蛋白TGF βRⅡ /Fc ,表达水平为 9mg/L。纯化得到的目的蛋白具有一定的生物学活性 ,可阻断TGF β1对L92 9细胞生长的     

醛酮还原酶AKR7A5蛋白的纯化及其对萘醌类化合物的底物特异性研究

目的:探讨小鼠醛酮还原酶AKR7A5蛋白对萘醌及其衍生物的底物特异性。方法:IPTG(异丙基硫代半乳糖糖苷)诱导BL21pLysS大肠杆菌中His标签的AKR7A5融合蛋白大量表达,利用FPLC系统通过HiTrap亲和柱纯化His-AKR7A5融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化的AKR7A5蛋白。使用AKR酶活性实验检测纯化的重组AKR7A5蛋白对萘醌类化合物的底物特异性。结果:经SDS-PAGE和Western blot验证,成功纯化了His标签的AKR7A5融合蛋白;AKR酶活性实验结果显示,重组AKR7A5蛋白对散沫花醌有中等亲和力,对胡桃醌和维生素K3有较低的亲和力,对1,4-萘醌无亲和力。结论:成功纯化了重组AKR7A5蛋白,并检测了其对萘醌类化合物的底物特异性,结果表明醛酮还原酶很可能选择性地参与萘醌类化合物的代谢。     

梭子蟹变应原的分离、纯化与鉴定

目的：对梭子蟹（Portunus pelogicus（Linnaeus））变应原进行分离,鉴定其主要及次要变应原,采用蛋白纯化技术获取梭子蟹天然的主要变应原并进行鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供理论依据.方法：取常规方法制备梭子蟹浸出液,经SDS-PAGE分离,测定各组分的相对分子量;同时用26例对蟹过敏的病人血清进行Western blot,鉴定其主要及次要变应原;利用快速制备液相色谱（FPLC）纯化技术（凝胶过滤层析和离子交换层析）获取主要变应原并作鉴定.结果：SDS-PAGE显示梭子蟹有19条可辨蛋白带,分子量在13 000～90 000之间,其中主带有9条,分子量是20 900、24 200、27 100、29 200、33 700、38 900、48 700、74 700、89 100;Western blot结果表明,26例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74 400、48 700的是主要变应原,阳性反应率均为100%;纯化后获取了74400、48700的主要变应原;经过免疫鉴定证实其具有免疫活性.结论：梭子蟹74 400和48 700的变应原为主要变应原,层析技术可以对分子量为74400和48700的主要变应原成分进行纯化.     

中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA 分型及与疾病进展分析

目的:分析中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因频率以及HLA 基因分型与疾病进展关系。方法:序列特异性引物的PCR 扩增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)对310 名随机中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因进行分型,采用HIV Molecular Immunology Database 中HLA Analysis Tools 方法计算等位基因频率。结果:在北京男男同性恋艾滋病感染者队列中,HLA-A*1101(34.52%)基因频率最高,其次为HLA-A*0201(31.94%)、HLA-C*0102(27.10%)以及HLA-A*2402(26.45%)。根据艾滋病感染者1 年内CD4 细胞计数变化来判断感染者是否为快速进展者,结果发现快速进展者134 例,非快速进展者176 例。快速进展者中存在低水平的HLA-B*4403(快速进展者1.12%,非快速进展者为4.27%,P = 0.0276),HLA-B*1511(非快速进展者5.98%,快速进展者2.25%,P =0.0282),HLA-B*5701(非快速进展者2.56%,快速进展者0.37%,P =0.0491)表达,而HLA-C*0304 则在快速进展者中高表达(非快速进展者4.56%,快速进展者8.96%,P =0.0319)。结论:本研究获得了中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因的等位基因分布频率数据,并发现HLA-B*4403、HLA-B*1511、HLA-B*5701 与延缓艾滋病疾病进展有关,而HLA-C*0304 则与加速艾滋病疾病进展相关。     

反复快速皮肤扩张可促进皮瓣表皮生长因子及增殖细胞核抗原的表达

背景：针对目前临床常用的常规扩张法与快速扩张法的不足,提出了反复快速皮肤扩张法。 目的：观察反复快速皮肤扩张对皮瓣表皮生长因子、增殖细胞核抗原表达的影响。 方法：雄性新西兰大白兔随机分为3组：反复快速扩张组、快速扩张组、常规扩张组。 结果与结论：扩张维持第2,3周,反复快速扩张组皮瓣表皮生长因子表达显著高于快速扩张组、常规扩张组 (P < 0.05)。除扩张维持第3周外,其余各时间段,反复快速扩张组成纤维细胞增殖细胞核抗原染色阳性率均显著高于其他两组 (P < 0.05)。扩张维持第4周,反复快速扩张组表皮细胞增殖细胞核抗原染色阳性率显著高于其他组(P < 0.05)。提示反复快速皮肤扩张可能通过促进组织细胞合成与分泌皮瓣表皮生长因子,促进了扩张皮肤中成纤维细胞及表皮细胞的增殖。     

一种快速ABC-ELISA

ABC-ELISA具有很高的敏感性和特异性,但因操作较为繁琐,实验时间长,在推广运用中受到一定限制。我们在常规方法(常规法)的基础上进行改良,建立了一种快速ABC-ELISA(快速法)。其操作流程如下(→快速法,…→常规法):     

3例输入性恶性疟病例的快速检测

目的 对3例疑难恶性疟病例进行实验室快速检测,评价快速检测方法的临床应用价值.方法 以2014年6月至2015年5月3例因不明原因发热入院患者为研究对象,采用免疫胶体金快速检测法和显微镜检法分别检测患者血液疟原虫,采用核酸荧光染料和FCM检测白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血色素(Hgb)、血小板计数(PLT)等血常规指标,采用酶法检测患者C反应蛋白(CRP)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)和谷丙转氨酶(ALT)等水平.结果 3例不明原因发热患者以畏寒、发热为主要症状,均出现血小板降低、CRP升高,和不同程度肝功能损害.胶体金快速检测和血涂片疟原虫显微镜检结果相同,均为恶性疟原虫感染.结论 免疫胶体金法快速检测有助于临床快速诊断疟原虫感染.     

人工股骨头置换术结合快速康复理念治疗高龄不稳定型股骨转子间骨折的临床效果

目的探讨人工股骨头置换术结合快速康复理念治疗高龄不稳定型股骨转子间骨折的疗效。 方法选取赤峰市医院骨关节科2016年4月至2017年9月股骨转子间骨折患者90例,按随机数字表法分为两组,快速康复组46例,遵循围手术期循证医学证据,严格执行快速康复程序;对照组44例,沿袭传统手术管理模式。比较两组患者术后早期疼痛数字分级评分法(NRS)评分,术后输血率,恶心、呕吐发生率,口渴、饥饿、腹胀发生率,住院时间,术后2周的满意度评分,术后3个月髋关节功能Harris评分,术后并发症发生率等。对数据比较采用t检验和χ²检验。 结果术后12、24、48 h,快速康复组患者早期疼痛NRS评分分别为(3.23±1.32)、(2.42±1.51)、(1.53±1.12)分,低于对照组[ (4.40±1.52)、(3.62±1.41)、(2.43±1.22)分],差异均有统计学意义(t＝ 3.9039、3.8924、3.6481,P＝ 0.0002、0.0002、0.0004);快速康复组患者术后输血率15.2%(5/46),低于对照组[47.7%(21/44)],差异有统计学意义(χ²＝9.6251,P＝0.0019);快速康复组患者术后恶心、呕吐发生率为10.9%(5/46),低于对照组[34.1%(15/44)],差异有统计学意义(χ²＝5.7370,P＝0.0166);快速康复组术后口渴、饥饿、腹胀发生率为13.0%(6/46),低于对照组[40.9%(18/44)],差异有统计学意义(χ²＝7.5616,P＝0.0060);快速康复组患者住院时间为(4.3±1.1) d,少于对照组[(6.8±1.7) d],差异有统计学意义(t＝8.3191,P<0.05);快速康复组患者术后2周的满意度评分为(9.6±1.2)分,高于对照组[(8.8±1.6)分],差异有统计学意义(t＝2.6912,P＝0.0085);快速康复组、对照组患者术后3个月髋关节功能Harris评分分别为(89.2±12.3)、(88.5±11.6)分,两组比较差异无统计学意义(t＝0.2775,P＝0.7821);快速康复组患者术后并发症发生率2.2%(1/46),低于对照组[18.2%(8/44)],差异有统计学意义(χ²＝4.7480,P＝0.0293)。 结论采用人工股骨头置换术结合快速康复理念治疗高龄股骨转子间骨折,可缩短患者住院时间,使患者快速恢复日常活动,提高患者满意度,是一种安全可靠的选择。     

快速进展型股骨头坏死患者血清骨代谢生化指标的变化

背景：国外研究认为快速进展型股骨头坏死的发病机制为血清关节软骨代谢及破骨细胞功能的异常。 目的：检测快速进展型股骨头坏死患者血清中骨生化标志物TRACP-5b及CTX-Ⅱ的表达。 方法：利用酶联免疫吸附试剂盒检测普通股骨头坏死患者(n=30,普通组)、快速进展型股骨头坏死患者(n=30,快速进展组)、骨质疏松症患者(n=30,骨质疏松组)、对照患者(n=30,单纯外伤后软组织缺损或单纯腘窝囊肿患者)血清中TRACP-5b及CTX-Ⅱ水平。 结果与结论：快速进展组、骨质疏松组TRACP-5b水平高于普通组、对照组(P < 0.05),普通组TRACP-5b水平稍高于对照组,但差异无显著性意义(P > 0.05)。快速进展组CTX-Ⅱ水平高于其他3组(P < 0.05),普通组、骨质疏松组CTX-Ⅱ水平稍高于对照组,但差异无显著性意义(P > 0.05)。说明：①快速进展型股骨头坏死的可能病理机制之一为TRACP-5b水平上升,破骨细胞活性增强,CTX-Ⅱ水平上升,关节软骨降解过快。②TRACP-5b及CTX-Ⅱ有可能成为诊断快速进展型股骨头坏死的指标之一。