胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

背景：以往促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究,多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用,而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议,其对骨髓间充质干细胞软骨分化及软骨胶原纤维稳定性的影响尚不清楚。 目的：观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化以及基质金属蛋白酶表达的影响。 方法：构建含有胰岛素样生长因子1基因完整编码区的表达载体,稳定转染至大鼠骨髓间充质干细胞,设为胰岛素样生长因子1稳定转染组,同时设未转染组作对照。 结果与结论：MTT检测结果显示,实验成功筛选得到胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞,转染后4 d,细胞增殖能力显著增强(P < 0.05)。RT-PCR,Western blot法及免疫细胞化学检测结果显示,与未转染组相比,胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞胰岛素样生长因子1,Ⅱ型胶原 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P < 0.01),基质金属蛋白酶1,2,3 mRNA表达显著降低(P < 0.01)。结果证实,单独应用胰岛素样生长因子1能够有效促进骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨分化,并维持软骨胶原纤维的稳定性。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。 目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。 方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹western blot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。 结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

RNA干扰抑制骨髓间充质干细胞中caspase-3基因的表达**

背景：研究发现,骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死区域后易发生凋亡导致移植细胞存活率较低。 目的：构建caspase-3基因的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs,siRNAs)表达质粒,探讨其在体外对骨髓间充质干细胞中caspase-3基因表达的抑制作用。 方法：根据siRNA设计原则,针对caspase-3基因设计并合成siRNAs,构建caspase-3siRNA表达载体并利用脂质体介导方法瞬时转染骨髓间充质干细胞。实验分为正常对照组,阴性序列对照组(si-ncg)和3个干扰组(si-caspase-3-1、si-caspase-3-2和si-caspase-3-3)。 结果与结论：成功构建了caspase-3siRNA表达载体并转染骨髓间充质干细胞。Western blot和RT-PCR检测转染后的骨髓间充质干细胞中caspase-3蛋白和mRNA的表达下降,以转染si-caspase-3-3的骨髓间充质干细胞下降最明显。结果提示构建的caspase-3siRNA表达质粒在体外能抑制骨髓间充质干细胞中caspase-3基因的表达。      

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

上调hHGF促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化

目的探讨人促肝细胞生长因子(hHGF)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向肝样细胞分化的影响。方法克隆hHGF基因,构建携带hHGF基因的真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-hHGF),用脂质体法将pcDNA3.1(+)-hHGF转染hBMSCs,分别通过激光共聚焦、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫蛋白印迹(Western blot)检测hBMSCs中表达hHGF的水平;用酒精性肝硬化患者血清诱导hHGF上调后的hBMSCs,采用Western blot分别检测诱导细胞内甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)的表达变化。结果成功构建pcDNA3.1(+)-hHGF表达质粒;激光共聚焦、RT-PCR、Western blot结果均表明转染后hBMSCs中hHGF分子呈高表达,Western blot结果发现诱导7 d,14 d转染后hBMSCs中AFP、ALB表达明显高于对照组。结论转染pcDNA3.1(+)-hHGF可以明显上调hHGF在hBMSCs中的表达;hBMSCs高表达hHGF后,经酒精性肝硬化血清诱导可明显促进其向肝样细胞分化,为基因治疗终末期肝病提供了一种新方法。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P< 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织

背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用,在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。 目的：观察携带人骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7蛋白及mRNA的表达。 方法：提取并培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过形态学和细胞表面标记进行鉴定;构建携带人骨形态发生蛋白7的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞,提取RNA后采用RT-PCR的方法检测骨形态发生蛋白7 mRNA水平相对表达量的变化,Western blotting检测骨形态发生蛋白7蛋白水平相对表达量的变化。 结果与结论：成功构建了携带骨形态发生蛋白7基因的慢病毒载体PLV-sfGFP(2A)-BMP7,重组载体质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,转染组的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白表达高于空载体组和空白组,差异有显著性意义(P < 0.05),说明外源性骨形态发生蛋白7基因被有效整合到骨髓间充质干细胞并进行表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系

背景：高草酸尿是结石形成的危险因素之一,利用基因工程和干细胞技术构建具有高代谢草酸能力的细胞系,将成为防治草酸钙结石的有效手段。 目的：将产甲酸草酸杆菌的草酸分解基因Frc和Oxc共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,使之获得分解草酸的功能。 方法：PCR法扩增出Frc和Oxc基因的编码序列,构建真核表达载体pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc,将其共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,以转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞作为对照。采用Western blot检测目的基因表达情况;离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度。 结果与结论：酶切鉴定和测序结果显示实验成功扩增了Frc和Oxc基因,并构建了pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc载体。将其转染至正常成人骨髓间充质干细胞后,Western blot检测结果显示其可稳定表达目的蛋白myc-甲酰辅酶A转移酶和flag-草酰辅酶A脱羧酶;离子色谱仪检测结果显示,随着培养时间的延长,转染目的基因的人骨髓间充质干细胞培养液中草酸浓度逐渐下降。而转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞无目的蛋白表达,也无分解草酸能力。说明实验成功构建了可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,该细胞系可稳定表达草酸分解蛋白Frc和Oxc,并具有草酸分解能力。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。 目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7 d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。 结果与结论：慢病毒转染3 d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90%以上,实验组转染效率达85%以上。RT-PCR和Western blot检测结果显示, 环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

背景：骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。 目的：构建永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植镇痛提供载体细胞来源。 方法：构建携带人端粒酶反转录酶基因的慢病毒pLV-Puro-EF1α-hTERT并转染第3代骨髓间充质干细胞后进行嘌呤霉素筛选,获得阳性细胞克隆并扩大培养,分别采用RT-PCR和TRAP法检测转染细胞人端粒酶反转录酶的表达和端粒酶活性,同时观察细胞形态、增殖和诱导分化能力、表面分子以及Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达,检测细胞染色体核型和致瘤性。 结果与结论：人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以体外连续培养超过30代。与未转染的细胞和对照病毒转染的细胞相比,慢病毒转染的骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶mRNA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高,细胞周期主要处于G2/M以及S期,增殖指数明显升高;细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%,而CD34、CD45表达阳性率不足5%,胞浆Nestin的表达阳性,而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达,保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力,细胞形态、染色体核型均正常,裸鼠接种无致瘤性。以上结果提示成功构建了人端粒酶反转录酶基因修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植用于镇痛研究提供了生物学性状均一、稳定的安全载体细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

MicroRNA-140靶向组蛋白去乙酰化酶7基因及在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中的表达分析

目的检测组蛋白去乙酰化酶7（HDAC7）是否为MicroRNA（miRNA）-140的靶基因,并研究在大鼠骨髓间充质干细胞（ratMSCs）成软骨诱导分化中miRNA-140和HDAC7表达的相关性。方法利用生物信息学、双荧光素酶报告基因检测以及Western blot法鉴定miRNA-140与HDAC7之间的靶作用关系。选取4周龄Sprague—Dawley（SD）雄性大鼠采用全骨髓贴壁法进行体外分离培养纯化得到大鼠骨髓间充质干细胞并向成软骨方向诱导分化,同时采用实时定量PCR和Western blot法检测miRNA-140和HDAC7的表达水平。结果双荧光素酶活性分析结果提示,miRNA-140靶结合人HDAC7基因的3’UTR。将miRNA-140mimics转染大鼠骨髓间充质干细胞后抑制HDAC7的蛋白表达。在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中,miRNA-140表达上调,而HDAC7表达下降。结论miRNA-140通过靶结合HDAC7基因的3’UTR抑制HDAC7表达,二者在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中表达负相关,提示miRNA-140通过抑制HDAC7蛋白表达保护软骨组织。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞*

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP)转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。 结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

miR-155有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化

背景：近年发现,miRNA是能够对基因表达产生影响的一种新型调控子,miRNA有助于多能干细胞分化增殖以及自我更新。 目的：探讨miR-155对大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控机制。 方法：12周龄健康SD大鼠60只,随机分为研究组与对照组,每组30只。于麻醉状态下将大鼠处死,获取下肢骨髓,进行骨髓间充质干细胞分离、培养,研究组给予miR-155基因模拟物转染,对照组给予阴性对照序列转染,经成软骨诱导分化后进行RT-PCR检测Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因的表达,Western blot检测Sox9、Runx2蛋白的表达。 结果与结论：研究组Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表达高于对照组,Collagen X基因表达低于对照组,差异均有显著性意义(P < 0.05)。研究组Sox9蛋白表达高于对照组,Runx2蛋白表达低于对照组,差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果表明miR-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化,而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓基质干细胞BMP-2和bFGF基因的联合修饰

目的:建立能够稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,优化骨组织工程种子细胞。方法:通过RT-PCR方法获取全长BMP-2及bFGF基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后,经脂质体介导导入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞,G418筛选稳定表达株。利用RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫组织化学染色方法分析转染细胞外源基因表达情况。结果:成功构建了全长BMP-2及bFGF的真核表达载体,转染大鼠骨髓基质干细胞后经G418筛选获得稳定表达株。RT-PCR结果显示稳定转染细胞中具有大量目的基因mRNA转录,ELISA检测培养上清中目的蛋白表达阳性,Westernblot、免疫组化结果显示胞质中有目的蛋白的表达。结论:获得了可以稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,有利于组织工程骨缺损修复中的应用。     

人端粒酶反转录酶转染的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景：人端粒酶反转录酶是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一,具有多重生物学效应。 目的：观察人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的效果。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经反转录病毒PLXSN 为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞,在转染前后用RT-PCR检测骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶基因的表达。60只雌性SD大鼠中随机取15只作为正常对照组,一次性注射生理盐水,余45只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机分为3组,分别通过大鼠尾静脉注射移植人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞0.2 mL、骨髓间充质干细胞0.2 mL、生理盐水0.2 mL。 结果与结论：转染48 h后发现,骨髓间充质干细胞有人端粒酶反转录酶mRNA的表达,且重点集中于胞核内。移植后14 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于正常对照组(P < 0.05);与糖尿病组相比,各移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05);与骨髓间充质干细胞移植组相比,人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05),接近正常对照组水平(P > 0.05)。结果提示人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。 目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠(SD大鼠)骨髓间充质干细胞的影响。 方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。 结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强(P < 0.05)。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达人骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。 结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。