载 BMP-2 多肽 P24 的巯基化壳聚糖水凝胶诱导异位成骨的实验研究

目的探讨载 BMP-2 多肽 P24 的巯基化壳聚糖（chitosan-4-thio-butylamidine，CS-TBA）水凝胶的异位成骨能力及体内生物相容性。方法采用壳聚糖、2-亚氨基硫烷盐酸盐、羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）制备 CS-TBA/HA 溶液，进一步加入 P24 多肽制备 CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA 溶液；取上述 3 种溶液，加入 β-甘油磷酸二钠（β-glycerophosphate disodium，β-GP），获得 CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶。取雌性 SD 大鼠 18 只，随机分为 A、B、C 3 组（n=6），制备竖脊肌肌袋后，分别植入 CS-TBA/HA/β-GP 水凝胶（A 组）、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP 水凝胶（B 组）、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝胶（C 组）。术后观察大鼠存活情况，4、8 周取材采用 micro-CT 检测标本骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD），组织学观察（HE、Masson 染色）分析材料的生物降解性及成骨作用。 结果术后各组大鼠均存活至取材时间点。micro-CT 显示，术后随时间延长，各组新生骨逐渐增多；同一时间点 B、C 组较 A 组明显，且随着 P24 浓度的增加，C 组新生骨形成更多。术后各组 Tb.Th、Tb.N、BMD 逐渐增加，除 A 组 Tb.Th 外，其余各指标 4 周与 8 周间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。各时间点，B、C 组 Tb.Th、Tb.N、BMD 明显高于 A 组，C 组高于 B 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。组织学染色观察示，B、C 组材料具有良好的生物降解性，且成骨效果随 P24 浓度升高而增强。 结论P24 多肽有助于提升 CS-TBA 水凝胶的异位成骨作用，且 10% 浓度效果更强。     

墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷表面纳米结构调控及其对成骨细胞作用的研究

目的探索墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）表面纳米结构的制备与调控，以及不同尺寸纳米结构对成骨细胞黏附、增殖以及 ALP 表达的影响。方法取墨鱼骨制备成直径 10 mm、厚 2 mm 的注水骨片后分为 4 组，分别与不同浓度磷源溶液混合，置于水热釜，放入烘箱于 120℃ 反应 24 h 后，组 1～3 样品不作处理，组 4 进一步于 1 200℃ 下烧结 3 h，去除表面结构作为对照。采用 X 射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪、电感耦合等离子体原子发射光谱分析各组 CB-HA 化学成分，扫描电镜、比表面测试仪、孔隙率测试仪分析其物理结构。取第 4 代 MC3T3-E1 细胞分别与 4 组 CB-HA 共培养，培养 1 d 后扫描电镜观察细胞形态，1、3、7 d 后用 MTT 法分析细胞增殖情况，7、14 d 后用 pNPP 法测试细胞 ALP 表达情况。结果4 组 CB-HA X 射线衍射光谱均见羟基磷灰石的峰形，红外线吸收光谱示红外吸收峰与羟基磷灰石一致，电感耦合等离子体原子发射光谱分析显示钙磷比为 1.68～1.76。扫描电镜观察见组 1～3 CB-HA 表面分别为大、中、小尺寸团簇结构，组 4 表面没有明显纳米结构。4 组 CB-HA 比表面积比较差异有统计学意义（P<0.05），孔隙率比较差异无统计学意义（P>0.05）。与组 4 相比，组 1～3 孔径<50 nm 的微孔更多，并且随着纳米团簇结构尺寸的减小，微孔逐渐增多。与细胞共培养后，扫描电镜及 MTT 检测示，与组 1、4 相比，组 2、3 CB-HA 表面细胞黏附及增殖均更好，并且细胞有更多的 ALP 表达（P<0.05）。 结论通过控制磷源溶液中铵根离子浓度能够调控 CB-HA 表面纳米团簇结构的尺寸，并且在 CB-HA 表面引入小尺寸团簇纳米结构能够改善材料的细胞黏附、增殖以及 ALP 表达，这种作用可能与纳米结构引起比表面积增加有关。     

SN50 定向诱导小鼠小胶质细胞分化促进缺氧损伤神经元修复的实验研究

目的探讨 SN50 定向诱导小鼠小胶质细胞分化对缺氧损伤神经元的修复作用及其机制。方法取新生 BALB/c 小鼠脑组织，采用差速贴壁结合震荡方法分离神经元和小胶质细胞。小胶质细胞首先采用免疫荧光染色鉴定特异性表达蛋白诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）和电离钙离子结合调节因子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）表达情况，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测特异性表达基因 iNOS、CD32 和 IL-10；然后采用 SN50 处理后，Western blot 检测 SN50 对小胶质细胞 NF-κB 的调控，qRT-PCR 检测小胶质细胞相关分化基因（iNOS、CD11b、IL-10、CD206）表达，流式细胞术检测 SN50 对小胶质细胞凋亡的影响，以上检测均以蒸馏水处理的小胶质细胞作为对照。神经元首先行缺氧损伤处理，分别于缺氧处理 0、2、6、12、24、48 h 后 MTT 检测神经元活力，另取缺氧处理 12 h 神经元经 Western blot 检测凋亡相关蛋白 Bcl-2 和半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）的表达、流式细胞术检测神经元凋亡情况。最后，将缺氧损伤 12 h 神经元分别与无菌蒸馏水（对照组）和 SN50（实验组）处理的小胶质细胞共培养 24 h，MTT 检测细胞活力、Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Caspase-3）表达、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果免疫荧光染色和 qRT-PCR 鉴定震荡分离的细胞表达小胶质细胞特异性蛋白和基因。与正常小胶质细胞相比，SN50 处理小胶质细胞后 NF-κB 蛋白及指示向 M1 型分化特异性基因 iNOS、CD11b 相对表达量降低（P<0.05），向 M2 型分化特异性基因 IL-10 和 CD206 相对表达量提高（P<0.05），但细胞凋亡率无明显改变（P>0.05）。与正常神经元相比，神经元缺氧处理后活力显著下降，Bcl-2、Caspase-3 蛋白相对表达量降低，而 cleaved-Caspase-3 蛋白相对表达量提高，神经元凋亡率明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。小胶质细胞与神经元共培养后，与对照组相比，实验组细胞活力及 Bcl-2、Caspase-3 蛋白相对表达量明显升高，cleaved-Caspase-3 蛋白相对表达量以及细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论SN50 可以通过 NF-κB 信号通路诱导小胶质细胞向 M2 型分化，使小胶质细胞对缺氧受损神经元发挥修复作用。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质（acellular cartilage extracellular matrix, ACECM）取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织，分离培养关节软骨细胞并传代。取第 3 代软骨细胞行 PKH26 荧光标记，MTT 检测标记对细胞增殖无影响后，分别取标记及未标记的软骨细胞复合 ACECM 取向支架并体外培养后，大体观察支架形态，倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况，扫描电镜观察支架中细胞形态，Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将 PKH26 标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙，术后观察裸鼠一般情况，4 周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况，取材行大体观察以及番红 O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察，评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养 7 d，大体观察呈半透明并具有一定硬度；倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长，并沿支架管道方向生长，分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后，分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活；术后 4 周，大体观察见复合物呈类软骨样组织，组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌，可见“陷窝”样结构形成。结论ACECM 取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构，并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合 BMSCs 移植修复大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的可行性。方法取成年 SD 大鼠胫骨及股骨骨髓，采用全骨髓贴壁培养法分离培养 BMSCs，并传代。取第 3 代细胞行表面抗原 CD29、CD45 鉴定及 BrdU 标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架，并与 BrdU 标记的第 3 代 BMSCs 进行体外共培养；扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT 法检测支架内细胞生长情况。取 50 只成年 SD 大鼠，随机分为 A、B、C、D、E 组（n=10）。A～D 组大鼠采用 Feeney 自由落体打击致伤原理制备 TBI 模型，造模后 72 h 分别移植 BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基；E 组为假手术组。于造模前及造模后 1、7、14、35 d，各组大鼠行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）；造模后进行 Morris 水迷宫测验，包括定位航行测验（造模后 31～35 d 连续 5 d 检测潜伏期）及空间探索测验（造模后 35 d 检测穿越平台次数）；造模后 36 d 取标本行 HE 染色、BrdU 与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及 BrdU 与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色，观察大鼠脑损伤区 BMSCs 的迁移与分化情况。 结果流式细胞仪检测示第 3 代 BMSCs 的 CD29 阳性率为 98.49%，CD45 阳性率仅为 0.85%；扫描电镜示支架-细胞共培养 48 h 后，BMSCs 呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上；MTT 法检测示壳聚糖多孔支架对 BMSCs 的增殖分化无不良影响。TBI 造模后 35 d，A 组大鼠 mNSS 评分、定位航行测验的潜伏期显著低于 B、C、D 组，空间探索测验的穿越平台次数显著高于 B、C、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、E 组间上述指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。HE 染色示 A 组壳聚糖多孔支架已部分降解，其与脑组织融合良好，修复程度优于 B、C、D 组。免疫组织化学双重染色结果示，A 组移植的 BMSCs 存活、分化为神经元和神经胶质细胞，并迁移至正常脑组织内，修复程度优于 B、C、D 组。 结论壳聚糖多孔支架介导的 BMSCs 移植能够明显改善大鼠 TBI 后的神经功能，亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成，并可使 BMSCs 在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

提高水凝胶机械性能的方法及其在骨组织工程中的研究进展

目的对提高水凝胶机械性能方法及其在骨组织工程中的研究进展进行综述。方法查阅近年国内外水凝胶用于骨组织工程研究的相关文献，并对提高水凝胶机械性能方法及其所制备的水凝胶体内外骨修复效果进行分析和总结。结果水凝胶已被广泛用于骨组织工程的研究，但存在机械性能较差的问题，提高水凝胶的机械性能可以改善其骨修复效果。构建双网络结构、复合无机纳米粒子、引入导电材料及纤维网络增强是目前提高水凝胶机械性能的常用方法，这些方法不同程度地提高了水凝胶机械性能，并表现出促进骨修复的效果。结论通过改变成胶体系、组分以及纤维结构，可以有效改善水凝胶机械性能，并显著促进骨修复。     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡（lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes，LNPs）性能，探讨其负载靶基因后体外诱导 BMSCs 定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成 LNPs，探讨合成时不同 pH（7.5、8.0、8.5、9.0）对 LNPs 及 LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）复合物理化性能的影响；通过体外大鼠 BMSCs 细胞毒性及转染实验，筛选出具低毒高转染效能的 LNPs，再用其负载 pBMP-2-GFP 基因转染大鼠 BMSCs，通过定期观察细胞形态、测定细胞表达 BMP-2 蛋白水平和 ALP 活性、钙结节生成情况来评价 LNPs/pBMP-2-GFP 对 BMSCs 成骨分化的影响。结果pH 为 8.5 时合成的 LNPs 含氮量、粒径及 zeta 电位均低于其余 pH 值组，其细胞毒性最低（细胞成活率 96.5%±1.4%）、转染效率最高（98.8%±0.1%）。BMSCs 经 LNPs/pBMP-2-GFP 转染诱导处理后，在前 4 d 内，其 BMP-2 蛋白表达量均明显高于 Lipofectamine2000（Lipo）/pBMP-2-GFP 组、支链型聚乙烯亚胺 25K/pBMP-2-GFP 组和空白对照组（P<0.05）。诱导后 14 d 其 ALP 活性高于 Lipo/pBMP-2-GFP 组和空白对照组（P<0.05），与成骨诱导液处理组相当（P>0.05）；茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节，而 Lipo/pBMP-2-GFP 组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节；诱导后 21 d 镜下观察见细胞中出现透明块状结节，呈成骨细胞形态特点。 结论pH 为 8.5 时合成的 LNPs 具有低细胞毒性、高转染效率，能高效介导 BMP-2 基因转染大鼠 BMSCs，并成功诱导 BMSCs 成骨定向分化，其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs 介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠 BMSCs 增殖和分化的影响，探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠 BMSCs，取第 5 代细胞制备胶原凝胶-BMSCs 复合体。采用扫描电镜、HE 染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态；MTT 检测该支架对 BMSCs 增殖的影响。取绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）阳性（GFP⁺）BMSCs 于胶原凝胶支架中培养 24 h，通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。 结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示，GFP⁺BMSCs 均匀分布于胶原凝胶支架内，大部分 GFP⁺BMSCs 呈梭形，部分细胞伸出突起，部分细胞间形成连接，提示 BMSCs 在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构，BMSCs 可黏附于该支架材料上，细胞形态良好。MTT 检测示，BMSCs 于胶原凝胶支架中培养后 3、5、7 d 的吸光度（A）值均高于单纯 BMSCs 培养，其中 5、7 d 时组间差异有统计学意义（t=4.472，P=0.011；t=4.819，P=0.009）。HE 染色示，胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs 在胶原凝胶内培养 24 h 后均匀分布其中；7 d 时 BMSCs 形态多样，部分细胞伸出细长突起，具有体外培养的神经元样形态。 结论胶原凝胶支架制备简便，具有良好的生物相容性，可作为神经组织工程支架材料。     

可注射明胶原位水凝胶作为脱钙骨基质粉末输送载体可行性的初步研究

目的介绍一种可注射明胶原位水凝胶，探讨其作为脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）粉末输送载体的可行性。方法首先取明胶制备巯基化明胶，Ellman 法检测其巯基含量；然后将其与聚乙二醇双丙烯酸酯交联反应制备可注射明胶原位水凝胶，采用倒置法检测凝胶时间；最后将可注射明胶原位水凝胶与 DBM 粉末混合后制备复合物（以下简称 DBM-Gel）。将 C2C12 细胞包裹于 DBM-Gel 内，采用 live/dead 染色和 Alamar blue 法研究材料细胞毒性。将 C2C12 细胞黏附于 DBM 表面，制备包裹细胞的 DBM-Gel（DBM-Gel 组），培养 1、3、5、7 d 后检测细胞 ALP 活性；以单纯黏附细胞的 DBM 作为对照（DBM 组）。采用裸鼠肌肉异位成骨模型进行体内骨诱导性观察，于裸鼠腹部肌袋分别植入 DBM-Gel（DBM-Gel 组）以及 DBM、PBS 混合液（DBM 组），4 周后取材进行组织学观察以及 ALP 活性检测。结果Ellman 法检测制备的巯基化明胶其巯基含量为（0.51±0.03）mmol/g，可注射明胶原位水凝胶凝胶时间为（6±1）min。将 DBM 与巯基化明胶、PEGDA 溶液混合后，在凝胶时间内可以通过注射方式到达植入位点。随着培养时间延长，DBM-Gel 中细胞呈铺展形态，并且部分细胞之间有连接；培养 1、3、7 d 细胞成活率分别为 95.4%±1.9%、97.3%±1.3%、96.1%±1.6%；培养 1、3、5、7 d 细胞相对增殖率分别为 1.0±0.0、1.1±0.1、1.5±0.1、1.6±0.1。体外诱导培养 1、3、5、7 d DBM-Gel 组和 DBM 组细胞表现相似的 ALP 活性，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；随培养时间延长，两组 ALP 活性均逐渐增加，5、7 d 时 ALP 活性显著高于 1、3 d（P<0.05），1、3 d 间比较以及 5、7 d 间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。体内植入 4 周后，DBM-Gel 组可见骨、软骨形成，未观察到骨髓形成；DBM 组可见骨髓、骨、软骨形成。DBM-Gel 组、DBM 组骨诱导性组织学评分分别为 4.0、4.5 分；ALP 活性分别为（119.4±22.7）、（146.7±13.0）μmol/mg protein/min，组间比较差异无统计学意义（t=–2.085，P=0.082）。 结论可注射明胶原位水凝胶作为 DBM 粉末输送载体可行。     

核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰壳聚糖介导微小 RNA-140 对兔关节软骨细胞作用的研究

目的探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide，NNS）修饰壳聚糖（chitosan，CS）（^NNSCS），介导人微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）基因转染，对体外培养的兔关节软骨细胞的作用。 方法将重组质粒 GV268-miR-140 和空质粒 GV268 分别与 ^NNSCS 复合形成 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物。取新生新西兰大耳白兔膝关节软骨，采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法分离培养原代软骨细胞。取第 2 代软骨细胞分为 3 组：正常细胞对照组（A 组）、^NNSCS/GV268 空质粒转染组（B 组）、^NNSCS/GV268-miR-140 转染组（C 组），B、C 组细胞分别以 ^NNSCS/GV268 及 ^NNSCS/GV268-miR-140 纳米复合物瞬时转染。转染后，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）检测外源 miR-140 的表达；Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色法及 MTT 法分别检测外源 miR-140 对软骨细胞凋亡及增殖活力的影响；RT-qPCR 检测软骨细胞中 Sox9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、组蛋白去乙酰化酶 4 （histone deacetylase 4，Hdac4）基因表达。 结果RT-qPCR 检测示，C 组外源 miR-140 表达水平较 A、B 组明显上调（P<0.05）。与 A、B 组比较，C 组软骨细胞凋亡率明显降低，细胞增殖活力明显增加，细胞内 Sox9、Aggrecan 基因相对表达量明显上调、Hdac4 基因相对表达量明显下调（P<0.05）；A、B 组间以上指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论^NNSCS 可携带外源基因进入软骨细胞并高效表达，高表达的 miR-140 能提高体外培养软骨细胞的生物活性，为其用于治疗软骨损伤性疾病提供了实验依据。     

骨骼肌来源细胞移植早期修复小鼠周围神经缺损的实验研究

目的通过观察损伤周围神经早期生长情况，探讨骨骼肌来源细胞（muscle-derived cells，MDCs）修复小鼠坐骨神经缺损的作用机制。方法收集携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠的后肢骨骼肌，提取 EGFP-MDCs 并培养至 P1 代备用。构建 C57BL/6 小鼠右侧坐骨神经 5 mm 长缺损模型，并用 7 mm 长的聚氨酯（polyurethane，PUR）导管桥接两神经断端，将 EGFP-MDCs 注入 PUR 导管内（MDC 组），与空白组（PUR 组）比较。于术后 1、2 周取术侧坐骨神经近侧断端及远侧断端神经组织，大体观察神经早期生长情况；对神经组织的纵行冰冻切片行雪旺细胞标志物 S100β 免疫荧光染色，计算小鼠再生神经内雪旺细胞迁移的最远距离总和，并观察表达 S100β 的雪旺细胞来源；对神经组织横行冰冻切片行磷酸化酪氨酸激酶受体（phosphorylated erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，p-ErbB2）及磷酸化黏着斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase，p-FAK）免疫荧光染色，计算二者蛋白阳性率。结果大体观察示术后 1、2 周 PUR 组术侧神经的近侧和远侧断端均未相连，而 MDC 组术后 2 周两侧神经断端已连接。免疫荧光染色示，术后 1 周，MDC 组及 PUR 组术侧神经的近侧和远侧断端内表达 S100β 的雪旺细胞并未相连；术后 2 周，MDC 组两侧神经断端内表达 S100β 的雪旺细胞已连接，而 PUR 组仍未连接。术后 2 周，两组再生神经内雪旺细胞迁移的最远距离总和分别较各组术后 1 周显著增加，术后 1、2 周 MDC 组显著高于 PUR 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 1 周，MDC 组近侧断端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白阳性率均显著高于 PUR 组（P<0.05）；术后 2 周两组近侧断端 p-ErbB2 蛋白阳性率差异无统计学意义（t=0.327，P=0.747），MDC 组 p-FAK 蛋白阳性率显著高于 PUR 组（t=4.470，P=0.000）。术后 1、2 周，MDC 组远侧断端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白阳性率均显著高于 PUR 组（P<0.05）。术后 1、2 周，MDC 组再生神经内均可见部分表达 S100β 的雪旺细胞来源于 EGFP-MDCs。 结论MDCs 可促进小鼠坐骨神经断端内 ErbB2 及 FAK 蛋白磷酸化，促进雪旺细胞迁移。MDCs 可分化为表达雪旺细胞标志物 S100β 的细胞，或作为其他细胞成分参与周围神经损伤的早期修复。     

股骨粗隆间骨折外侧壁损伤的研究进展

目的总结股骨粗隆外侧壁的一般概念、外侧壁损伤的原因及治疗进展，以期提高对外侧壁的认识，减少手术并发症的发生。方法查阅国内外股骨粗隆外侧壁的相关文献，并进行分析总结。结果外侧壁的上界是股骨外侧肌嵴，下界是股外侧皮质与下股骨颈切线的交点。外侧壁的完整性对于防止股骨粗隆间骨折的固定失败和再手术非常重要。损伤原因主要是无合适的分型标准作为指导、X 线片显示的骨折模式与骨折实际情况不符、骨折类型特殊、术中操作不当等。治疗方法主要是重建外侧壁，根据不同骨折模式选择不同的重建方法。结论外侧壁对于股骨粗隆间骨折的治疗至关重要，外侧壁破裂应一期固定，最大限度减少再手术风险。     

鹿茸软骨组织脱细胞基质材料的制备及生物相容性研究

目的探讨鹿茸软骨制备脱细胞基质材料的可行性以及生物相容性，为软骨修复重建探索新材料。方法取梅花鹿鹿茸生长中心间充质层，进行由 DNA 酶、RNA 酶、抑肽酶等介导的脱细胞处理；行组织学和 DNA 含量检测，评价脱细胞效果。取第 2 代鹿生茸区骨膜（antlerogenic periosteum，AP）细胞，行荧光干细胞标记明确其干细胞特性后，用 PKH26 荧光标记并与制备的间充质层脱细胞基质进行复合培养；7 d 后取材行HE染色观察以及荧光显微镜下观察 PKH26 标记的 AP 细胞在基质表面生长情况。以上观测均以未复合 AP 细胞的脱细胞基质作为对照。将复合培养 7 d 的样本移植至裸鼠一侧腹股沟（实验组），取空白培养样本移植于另一侧（对照组）。于移植后 7、21 d 取材行 HE 染色，同时对组织进行冰冻切片并在荧光显微镜下观察 PKH26 标记成功的 AP 细胞在脱细胞基质表面及内部的生长情况，评价含 AP 细胞的脱细胞基质在裸鼠体内的组织相容性。结果HE 和 DAPI 染色显示脱细胞处理后材料中无细胞残留，DNA 含量为（19.367±5.254）ng/mg，较脱细胞处理前的（3 805.500±519.119）ng/mg 显著降低（t=12.630，P=0.000），提示成功制备间充质层脱细胞基质。AP 细胞与间充质层脱细胞基质复合培养 7 d 后，AP 细胞主要黏附于材料表面，部分进入脱细胞基质内部。植入裸鼠体内后，随观察时间延长，接种 AP 细胞可以在脱细胞基质材料中增殖并逐渐进入材料内部，并诱导血管生成。 结论实验成功制备鹿茸软骨脱细胞基质，该基质材料在离体和活体情况下适于种子细胞（AP 细胞）的黏附和增殖，并具有刺激血管生成的功能，为其用于软骨组织修复提供理论依据。     

肌腱干细胞在骨肌腱接点纤维软骨带重建中的作用机制研究进展

目的对肌腱干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）在骨肌腱接点（bone-tendon junction，BTJ）纤维软骨带重建中的作用机制进行综述。方法广泛查阅国内外有关 TDSCs 促进 BTJ 纤维软骨带重建的研究文献，并总结分析。结果TDSCs 具有向骨细胞、纤维软骨细胞及肌腱细胞分化的能力，因此具备形成纤维软骨带的潜能；决定 TDSCs 成骨、成软骨分化的因素有力学刺激、生物活性因子、细胞外基质及炎性因子等。结论TDSCs 因其来源的特殊性，具有成为重建 BTJ 纤维软骨带种子细胞的潜能，通过外界刺激可诱导 TDSCs 形成类似于纤维软骨带结构。     

载柚皮苷复合支架对兔骨软骨缺损修复的实验研究

目的探讨载柚皮苷复合支架的性能及其对兔骨软骨缺损修复的效果。方法利用 W/O/W 方法制备载柚皮苷和无载柚皮苷缓释微球；以凹凸棒石和 Ⅰ 型胶原蛋白为材料，通过“3 层夹心法”分别构建载柚皮苷、无载柚皮苷和载 TGF-β₁ 复合支架。分别利用体外缓释、扫描电镜和细胞计数试剂盒 8 法评价载柚皮苷微球的缓释效果、支架的形貌和细胞相容性。取 40 只日本大耳白兔随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 10 只。于兔双侧股骨髁间窝处制备直径 4.5 mm、深 4 mm 的骨软骨缺损模型，A 组为缺损组（空白对照），B、C、D 组分别于骨软骨缺损处植入无载柚皮苷复合支架（阴性对照组）、载柚皮苷复合支架（实验组）及载 TGF-β₁ 复合支架（阳性对照组）。分别于术后 3、6 个月时取材，行大体、HE 染色、甲苯胺蓝染色，分别观察骨软骨缺损修复效果；Western blot 检测新生软骨 Ⅱ 型胶原蛋白表达水平。 结果载柚皮苷微球具有良好的缓释效果；构建的骨软骨复合支架有较好的孔隙；载柚皮苷软骨层支架细胞的增殖率与无载柚皮苷支架比较明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。兔体内植入实验大体观察示，术后 3 个月 C、D 组缺损范围与 A、B 组相比明显缩小；术后 6 个月 C 组缺损处被新生软骨所覆盖，D 组新生软骨与周围正常软骨整合良好。组织学染色示，术后 3 个月 A、B 组缺损处被少量纤维组织填充，C、D 组可见少量软骨生成；术后 6 个月 C、D 组新生骨软骨组织与正常骨软骨类似，A、B 组缺损处以大量纤维组织为主。Western blot 检测示，术后 3、6 个月 C、D 组缺损处新生组织中 Ⅱ 型胶原蛋白表达量均显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论载柚皮苷复合支架具有良好的组织相容性，并对兔关节骨软骨缺损有较好的修复效果。     

全股骨置换术的研究进展

目的总结分析全股骨置换术近年的研究进展。方法广泛查阅与全股骨置换术相关的文献报道，分析和总结其手术指征、手术技术、假体设计、手术并发症及分类、术后康复锻炼和功能评价。结果全股骨置换术的适应证是股骨广泛受累或存在跳跃性病灶的肿瘤性疾病和非肿瘤性疾病，以及伴有严重骨缺损的髋膝关节翻修术。手术切口近端以 Watson-Jone 切口为主，然后沿大腿外侧，远端延伸至髌骨外侧显露股骨全长，保护好血管神经和髋外展结构，行组配或定制假体置换。假体设计不断进步，呈现出了多样化的假体。手术并发症多且发生率不一。术后康复锻炼早期以物理治疗为主，负重训练循序渐进。功能评价主要以国际骨与软组织肿瘤协会（MSTS）评分为主。结论全股骨置换术保肢效果确切，需要继续进行大样本量和长期随访研究，逐渐统一手术适应证和功能锻炼标准，减少术后并发症。     

旋转成形术治疗儿童股骨远端骨肉瘤

目的评估旋转成形术治疗儿童股骨远端骨肉瘤的临床疗效。方法回顾性分析 2014 年 3 月—2016 年 6 月采用旋转成形术治疗的 10 例股骨远端骨肉瘤患儿临床资料。男 7 例，女 3 例；年龄 4～10 岁，平均 6.7 岁。病理类型：骨母细胞型骨肉瘤 4 例，混合型骨肉瘤 4 例，软骨母细胞型骨肉瘤 2 例。Enneking 分期均为ⅡB 期。病程 3.5～6.0 个月，平均 4.6 个月。术后应用 1993 年美国骨与软组织肿瘤协会（MSTS93）评分、多伦多下肢功能量表（TESS）评分及膝关节活动度评估患肢功能，影像学检查评估肿瘤复发及转移情况。结果术后 1 例出现切口延期愈合，经换药后愈合；其余患儿切口均Ⅰ期愈合。10 例患儿均获随访，随访时间 24～72 个月，平均 52.6 个月。随访期间均无局部复发；3 例出现远处转移后死亡 1 例、无瘤生存 1 例、带瘤生存 1 例。2 例术后 2 年足跟部出现胼胝和溃疡，均经处理后好转。骨连接端愈合时间 2.5～5.0 个月，平均 3.5 个月。术后 4 个月患儿均能独立行走。末次随访时，MSTS93 评分为 19～25 分，平均 22 分；TESS 评分为 87～93 分，平均 90 分。佩戴假肢后膝关节活动度伸 0°～10°，平均 5°；屈 85°～95°，平均 90.5°。结论对于保肢困难的股骨远端骨肉瘤患儿，采用旋转成形术治疗能有效保留患肢功能，改善生活质量，可以作为截肢的备选术式。     

p22phox 和 NOX5 在缺氧诱导成骨细胞自噬及凋亡中的作用研究

目的探讨 p22phox 和 NOX5 在缺氧诱导成骨细胞自噬和凋亡中的作用。方法将新生大鼠颅骨组织剪碎，采用组织块贴壁法及差速贴壁法分离纯化成骨细胞。取第 1 代细胞行 HE、茜素红、ALP 染色以及流式细胞仪鉴定。采用三气培养箱制备成骨细胞缺氧模型，于缺氧 0、3、6、12、24 h 时，采用 Western blot 检测 p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ表达情况，流式细胞仪检测活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平以及细胞凋亡率，选取细胞内 ROS 水平最高时间点作为后续实验的缺氧时间点。将第 1 代成骨细胞分成正常组、si-p22phox 缺氧处理组和 si-NOX5 缺氧处理组，行对应转染及缺氧处理后，采用 RT-PCR 检测 si-p22phox 和 si-NOX5 抑制效率。然后再将第1 代成骨细胞分成正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组，行对应转染及缺氧处理后，采用 Western blot 检测细胞 p22phox、NOX5、自噬相关蛋白（LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）表达情况，流式细胞术检测细胞凋亡率和 ROS 水平。最后，将成骨细胞分成缺氧 12 h 组（缺氧组）和同时抑制 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 组（抑制+缺氧组），对应处理后免疫荧光染色观察 Beclin 及 Bax 表达。结果经鉴定，分离获得的细胞为成骨细胞。缺氧处理后，成骨细胞 p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量以及细胞凋亡率均逐渐升高（P<0.05），ROS 水平亦升高（P<0.05）且 12 h 达峰值；选择缺氧 12 h 模型进行后续实验。抑制 p22phox 基因不影响 NOX5 的表达，而抑制 NOX5 基因也不影响 p22phox 的表达；与单纯缺氧处理相比，抑制 p22phox 或 NOX5 基因表达后 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量下降（P<0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量增高（P<0.05），细胞凋亡率及 ROS 水平亦下降（P<0.05）；同时抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达后，免疫荧光染色见 Beclin、Bax 荧光较弱。 结论抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达可以降低缺氧条件下成骨细胞内 ROS 水平，同时降低细胞自噬以及凋亡，尤其减弱了细胞早期向晚期凋亡的过渡，增强了缺氧成骨细胞的增殖能力。     

去白细胞富血小板血浆对距骨骨软骨损伤的疗效及机制研究

目的探讨去白细胞富血小板血浆（pure platelet-rich plasma，P-PRP）对距骨骨软骨损伤的治疗效果及机制。方法将 2014 年 1 月—2017 年 10 月收治的符合选择标准的 36 例距骨骨软骨损伤患者，按随机数字表法随机分为对照组（A 组）、富白细胞 PRP（leukocyte PRP，L-PRP）组（B 组）、P-PRP 组（C 组），每组 12 例。3 组患者性别、年龄、病程、Hepple 分型等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。B、C 组分别于植骨处注射 2.5 mL L-PRP 和 P-PRP，A 组不注射任何药物。术前和术后 3、6、12 个月采用美国矫形足踝协会（AOFAS）踝-后足评分和疼痛视觉模拟评分（VAS）评价疗效。P-PRP 治疗机制研究：将 MC3T3-E1 细胞随机分为对照组（A 组）、L-PRP 组（B 组）、P-PRP 组（C 组），B、C 组分别用含 5%L-PRP 或 P-PRP 的培养液进行培养，A 组用相同含量 PBS 培养。采用 MTT 法检测细胞增殖情况，ELISA 法检测上清液基质金属蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）蛋白含量，测定细胞 ALP 活性，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测细胞中骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型胶原和 MMP-9 mRNA 的表达，Western blot 检测上清液 MMP-9 和细胞中磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）、磷酸化 c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）蛋白表达。 结果各组患者均获随访，随访时间 13～25 个月，平均 18 个月。无伤口感染、内固定失效等并发症发生。MRI 检查示，术前各组损伤程度相似，术后 6 个月各组均获康复，且 C 组优于 A、B 组。术后各时间点各组 AOFAS 评分和 VAS 评分均较术前显著改善（P<0.05）；术后 3、6、12 个月 C 组 AOFAS 评分均显著高于 A、B 组（P<0.05）；VAS 评分各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。P-PRP 治疗机制研究：C 组细胞增殖吸光度（A）值、ALP 活性、OPN 和Ⅰ型胶原 mRNA 相对表达量显著大于 A、B 组，B 组大于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。B 组 MMP-9 蛋白和 mRNA 相对表达量以及 ELISA 检测 MMP-9 蛋白含量显著大于 A、C 组，C 组小于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。Western blot 检测示 B 组 PI3K、pAKT、p-c-Jun 蛋白相对表达量显著大于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。 结论P-PRP 对距骨骨软骨损伤的治疗效果优于 L-PRP，可能与抑制成骨细胞中 PI3K/AKT/AP-1 信号通路的激活，从而降低 MMP-9 的分泌有关。     

金黄色葡萄球菌脂磷壁酸对破骨细胞分化的影响

目的探讨金黄色葡萄球菌脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid, LTA-sa）对破骨细胞分化的影响。 方法取 RAW264.7 细胞根据诱导培养条件不同分为 5 组，分别为 LTA-sa 100 ng/mL 组（A 组）、LTA-sa 200 ng/mL 组（B 组）、LTA-sa 400 ng/mL 组（C 组）、100 ng/mL 鼠 NF-κB 受体活化因子配基组（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；作为阳性对照，D 组）、空白对照组（E 组，等体积 PBS）。诱导培养后第 5 天，A～E 组行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色观察破骨样细胞形成情况并行细胞计数，采用 Image-Pro Plus 6.0 软件测量 COAS（Corning Osteo Assay Surface）24 孔板形成的骨吸收凹陷面积，计算其占整个视野面积的比值；同时 A、B、C、E 组采用 MTT 法检测细胞增殖情况。结果诱导培养后第 5 天，各组均可见破骨样细胞及骨吸收凹陷形成，但 A～D 组所形成的破骨样细胞及骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值均多于 E 组；且随 LTA-sa 浓度增加，A、B、C 组以上指标逐渐增加，但均低于 D 组；各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。诱导培养后第 5 天，A、B、C、E 组吸光度（A）值比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论LTA-sa 具有促进 RAW264.7 细胞向破骨细胞分化形成的作用。