降钙素原单克隆抗体的制备及鉴定应用

目的表达和纯化降钙素原(PCT)基因的融合蛋白,制备PCT融合蛋白的鼠源性单克隆抗体。方法根据GenBank数据库中降钙素原氨基酸序列设计引物,从TT细胞中扩增出降钙素原的全长片段,将其克隆至pEASYE1原核表达载体,构建重组表达质粒pEASY-E1-PCT;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞转化阳性克隆质粒中,以IPTG作为诱导剂诱导表达融合蛋白,通过His镍离子亲和层析纯化目的蛋白,纯化的目的蛋白免疫BALB/c小鼠,获取单克隆抗体并纯化,ELISA法检测抗体效价及交叉鉴定,制备的单抗与市售的降钙素原检测试剂盒进行对比。结果成功构建了pEASY-E1-PCT原核表达载体,获得2株可以稳定分泌特的单抗,经鉴定这两株抗体效价高、特异性好,与市售检测试剂盒检测结果一致。结论成功构建了原核表达载体pEASY-E1-PCT,获得了高纯度降钙素原PCT蛋白,制备并获得了2株特异的单克隆抗体,制备单抗与商品试剂盒对血清样本检测结果基本一致,为进一步研究降钙素原的生物学功能及试剂盒开发提供实验基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体。方法利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体。用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性。结果诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2mg/ml。制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1：32000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

CD26多克隆抗体的制备与鉴定

目的针对CD26酶催化结构域制备多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术以人白细胞mRNA为模板,扩增获取编码CD26催化结构域的基因序列,克隆入原核表达载体PET32a后,转化BL21感受态细菌,经IPTG诱导表达得到his-CD26融合蛋白;亲和层析柱纯化并经Western-blot鉴定后,用此重组蛋白免疫2只新西兰纯种大白兔,获取免疫血清共180 ml,经蛋白A柱纯化及抗原抗体亲和纯化后,采用间接ELISA法检测抗体效价,Western-blot及免疫细胞化学染色进行抗体效价及特异性鉴定。结果构建出PET32a/CD26原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达,经his亲合层析纯化后蛋白量达2.3 mg/ml;制备的多抗血清纯化后效价达256 000,经Western-blot证明能特异性的识别CD26重组蛋白,免疫细胞化学染色显示能特异的结合于H9细胞。结论成功制备了能特异性识别CD26的多克隆抗体。     

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的表达及其多克隆抗体制备

[目的]原核表达戊型肝炎病毒ORF3蛋白,探讨其抗原性,并制备特异性多克隆抗体。[方法]PCR扩增ORF3全长基因,将其克隆到原核表达载体pET32b中,诱导表达目的蛋白,并用戊型肝炎病毒阳性血清鉴定其抗原性。蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,western blot检测抗体特异性。[结果]成功构建原核表达载体pET32b—ORF3,在大肠杆菌中高效表达分子量约为32kDa的融合蛋白,ELISA分析表明其具有良好的抗原性。纯化的表达蛋白制备的多克隆抗体具有较强的特异性,效价达到1：32000。[结论]重组表达蛋白ORF3具有良好的抗原性,可用于戊型肝炎诊断试剂盒研制,制备的多克隆抗体特异性强效价高,为进一步研究戊型肝炎病毒奠定了实验基础。     

沙眼衣原体LpxA蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的纯化沙眼衣原体LpxA蛋白并制备抗LpxA蛋白的多克隆抗体,为研究LpxA蛋白的功能奠定基础。方法 PCR扩增LpxA基因,以pET28a质粒为载体,构建表达质粒pET28a-LpxA,转化大肠埃希菌BL21,利用IPTG诱导含有6*His的融合蛋白表达,并使用Ni 2+亲和层析柱进行纯化。以纯化的His-LpxA蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,并使用免疫印迹法检测抗体与His-LpxA蛋白的反应以及使用ELISA法测定多克隆抗体的滴度。结果重组表达质粒pET28a-LpxA构建成功,融合His-LpxA蛋白的相对分子质量为32.8kDa,能够在大肠杆菌中高效表达,纯化后目的蛋白纯度约为95%,免疫新西兰兔后,抗血清能够识别重组的His-LpxA蛋白,其滴度大于1∶10 240。结论成功纯化了LpxA蛋白和制备了抗血清,为研究LpxA蛋白的功能提供实验基础。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。