丁酸钠诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的信号通路及对AQP3基因表达影响的研究

目的：探讨丁酸钠诱导结肠癌HT-29细胞凋亡过程的分子机理及其对水通道蛋白AQP3基因表达的影响。方法：MTT法检测不同浓度的丁酸钠对结肠癌HT-29细胞生长的影响;RT-PCR检测不同浓度的丁酸钠对细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4、p16和AQP3的基因表达水平,同时使用流式细胞仪检测细胞周期。结果：加入浓度超过2.5mmol/L的丁酸钠后,结肠癌HT-29细胞生长受到抑制,Cyclin D1、CDK4和AQP3的表达水平下降,p16的表达水平上调,细胞阻滞于G1/S期。结论：浓度超过2.5mmol/L的丁酸钠可以诱导结肠癌HT-29细胞凋亡,使其细胞周期阻滞于G1/S期,且这种诱导作用是剂量依赖型的,其分子通路可能是通过p16-Cyclin D1/CDK4这条信号途径,在此过程中,伴随着AQP3的基因表达水平降低。     

脱氢枞胺对氟苯甲醛激活JNK/P38通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡北大核心CSCD

目的研究脱氢枞胺对氟苯甲醛(DHAA-F)对人肝癌Hep G2细胞存活的影响,探讨其诱导细胞凋亡作用机制。方法用不同浓度DHAA-F处理Hep G2细胞24,48和72 h,CCK-8法检测细胞存活;DHAA-F20,40和80μmol·L^(-1)处理Hep G2细胞24 h,荧光显微镜观察细胞形态的变化,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、活化的胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3蛋白表达水平,以及丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族中ERK,JNK和P38蛋白的表达。结果与细胞对照组比较,DHAA-F可显著抑制细胞存活(P<0.01),24,48和72 h的IC50值分别为56.8±4.4,40.2±3.4和24.2±2.4μmol·L^(-1);DHAA-F 20,40和80μmol·L^(-1)作用24 h后,核固缩程度加深,PI染色增多,细胞凋亡率明显增加(P<0.01),由细胞对照组的(6.4±0.6)%分别增加至(12.3±1.7)%,(28.8±3.2)%和(61.8±4.6)%;DHAA-F可以增加Hep G2细胞中JNK和P38蛋白的磷酸化(P<0.01),引起BCL-2表达下调(P<0.01)、BAX及活化的胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表达上调(P<0.01);与DHAA-F组相比,P38MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125可逆转DHAA-F引起的BCL-2表达下调、BAX表达上调和胱天蛋白酶3的活化(P<0.01)。结论 DHAA-F可通过激活JNK/P38通路诱导人肝癌Hep G2细胞发生凋亡。     

DHA和EPA调控巨噬细胞表型抑制HT-29细胞生长

目的 探讨二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)通过调控巨噬细胞表型对HT-29细胞生长的影响。方法 人单核细胞株THP-1诱导成M2型巨噬细胞后,与人结肠癌细胞株HT-29共培养,分别向共培养体系中加入DHA或EPA 0、10、20、40μmol/L处理48 h。MTT法检测HT-29细胞增殖情况,ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平,实时荧光定量PCR检测巨噬细胞中CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)和CD206 mRNA表达,Western blot法检测HT-29细胞磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)蛋白表达。结果 与DHA 0μmol/L比较,DHA 10、20、40μmol/L处理后HT-29细胞存活率降低,共培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高,IL-10水平降低,巨噬细胞中CD86、iNOS mRNA表达升高,Arg1、CD206 mRNA表达降低,HT-29细胞中p...     

槲皮素诱导人结肠癌细胞HT-29凋亡的机制研究

目的 探讨槲皮素在体外对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响,并对其诱导机制进行研究。方法 体外常规培养HT-29细胞,随机设定对照组和高、中、低剂量（32,16,8 μg·mL^-1）槲皮素组,药物干预24 h后,采用CCK-8试剂盒检测槲皮素对HT-29细胞增殖的影响,倒置显微镜观察细胞形态变化,蛋白免疫印迹法检测MKK3/6/p38信号通路蛋白表达,并同时检测凋亡相关蛋白Caspase 8、Caspase 3、Bax及Bcl-2的表达水平。结果 槲皮素干扰HT-29细胞24 h后,CCK-8实验发现槲皮素可明显抑制细胞的增殖;形态学观察发现细胞密度明显减小、细胞体积变小;免疫印迹实验发现槲皮素可诱导MKK3/6及p38的磷酸化,进而促进促凋亡蛋白Caspase8、Caspase3及Bax的表达,抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论 槲皮素可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与激活MKK3/6/p38信号通路有关。     

JNK信号传导通路在赭曲毒素A体外诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的探讨赭曲毒素A(OA)诱导人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡的作用机制。方法体外培养HKC,随机分为空白对照组、溶剂(0.04%乙醇)对照组、OA 1μmol·L-1处理组及c-Jun氨基端激酶(JNK)阻断剂SP600125 0.5μmol·L-1预处理+OA组。细胞处理24h后,分别采用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,免疫细胞化学染色和Western蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶(caspase)3蛋白的表达以及JNK的磷酸化水平(p-JNK)。结果OA组细胞凋亡率明显高于溶剂对照组〔(4.24±0.17)%vs(1.06±0.14)%〕,SP600125预处理+OA组HKC凋亡率〔(2.44±0.38)%〕明显低于OA组。OA组caspase 3蛋白的表达和p-JNK水平明显升高,SP600125预处理+OA组caspase 3蛋白的表达和p-JNK水平较OA组明显降低。结论OA可能通过激活JNK,上调caspase 3蛋白的表达而诱导HKC凋亡。     

蛋白酶体抑制剂MG-132通过JNK信号通路对人脑胶质瘤细胞SHG-44内质网应激相关机制的探讨

目的探讨MG-132通过内质网应激途径在诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44凋亡中的作用。选择内质网应激凋亡信号转导通路JNK,使用JNK特异阻断剂SP600125,观察MG-132通过JNK信号通路诱导胶质瘤细胞凋亡过程中凋亡指标的变化。方法传代法培养人脑胶质瘤细胞。选择浓度为5、10、15、50μmol/L的MG-132,分别作用于实验组,用噻唑噻(MTT)法筛选半数有效浓度后进行实验。实验分为5组:正常对照组、二硫苏糖醇(DTT)组、MG-132组、SP600125组、MG-132+SP600125组。试剂干预终止后,应用流式细胞仪和DNALadder评估肿瘤细胞凋亡,以聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测内质网应激指标GRP78、JNK。结果5μmol/L为筛选的最佳抑制浓度,SHG-44细胞活力下降达39%(P<0.05)。MG-132干预后,与对照组比较,DNA电泳呈凋亡特征(梯状条带),细胞凋亡率显著增加(P<0.05),GRP78m RNA表达明显增加(P<0.05)。但给予DTT后,与MG-132组表现一致,差异无统计学意义(P>0.05)。SP600125+MG-132较DTT和MG-132组有所减低,但不如单独SP600125组降低明显(P<0.05)。蛋白印迹法结果显示,与对照组比较,MG-132组和DTT组内质网应激指标GRP78、JNK表达明显增加(P<0.05),SP600125+MG-132组表达有所减低,但不如单独给予SP600125组明显(P<0.05)。结论内质网应激是MG-132诱导胶质瘤细胞凋亡的主要途径之一,JNK通路抑制剂SP600125可以部分阻断内质网应激,即JNK信号通路为MG-132发挥凋亡作用的途径之一。     

丝裂原激活蛋白激酶信号通路抑制剂对高糖培养视网膜微血管内皮细胞的影响

目的研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂对高糖培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMECs)的作用。方法体外培养RMECs,将细胞分为5组:空白组、模型组、SB203580(p38抑制剂)组、U0126(胞外调节蛋白激酶抑制剂)组和SP600125(应激活化蛋白激酶抑制剂)组,各抑制剂组加入相应抑制剂10μmol·L^-1预孵育1 h后,除空白组外,其他4组高糖处理24 h。以免疫荧光实验检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达分布,用实时荧光定量-聚合酶链式反应及免疫印迹法检测PPAR-γmRNA与蛋白的表达水平,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(MMP)。结果空白组、模型组、SB203580组、U0126组和SP600125组的PPAR-γmRNA表达量比值分别为1. 00±0. 01,0. 79±0. 06,1. 01±0. 04,1. 19±0. 11和0. 73±0. 12;这5组MMP分别为0. 40±0. 02,0. 22±0. 01,0. 41±0. 01,0. 45±0. 01和0. 21±0. 01。模型组与空白组比较,上述指标均显著降低,差异均有统计学意义(均P <0. 05);SB203580组和U0126组与模型组比较,上述指标均升高,差异均有统计学意义(均P <0. 05); SP600125组与模型组比较,差异均无统计学意义(均P> 0. 05);抑制剂组中,U0126组的上述指标升高最显著,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。PPAR-γ的蛋白水平变化与mRNA水平变化一致。结论在高糖环境中,抑制剂U0126可上调RMECs的PPAR-γ表达并减轻其线粒体损伤。     

二苯乙烯苷调控MAPKs信号通路诱导大肠癌SW116细胞凋亡

目的研究二苯乙烯苷(THSG)对大肠癌SW116细胞凋亡的诱导作用及其可能的分子机制。方法体外常规培养SW116细胞,采用不同剂量(0、5、10、20、40、80、120 mmol/L)THSG处理SW116细胞,CCK8法分析不同剂量药物处理24、48、72 h后细胞的存活率;不同浓度(0、10、20、40 mmol/L)THSG干预SW116细胞24 h后,Annexin/PI双染后流式细胞仪检测SW116细胞凋亡情况,Western blot方法检测SW116细胞中凋亡相关蛋白PARP和Pro-caspase 3的表达及MAPKs信号通路p38、ERK、JNK的磷酸化水平;p38、ERK、JNK特异性抑制剂干预细胞后,Western blot方法检测抑制剂对p38、ERK、JNK磷酸化的抑制作用。结果 THSG呈剂量和时间依赖性地抑制大肠癌SW116细胞的增殖,诱导细胞凋亡;THSG干预SW116细胞后,Cleaved PARP表达显著升高、Pro-caspase 3表达显著降低,胞内p38和JNK磷酸化水平显著升高(P<0.05),然而ERK磷酸化水平显著降低(P<0.05)。结论特异性抑制剂阻断ERK激活,可以增强THSG诱导SW116细胞凋亡,特异性阻断p38、JNK活化,能够部分逆转THSG对p38和JNK磷酸化和细胞凋亡的诱导作用。THSG通过激活p38和JNK信号传导,抑制ERK信号途径,诱导大肠癌SW116细胞凋亡。     

c-Jun氨基端激酶通路抑制剂SP600125对大鼠脑缺血再灌注后自噬的影响北大核心CSCD

目的研究c-Jun氨基端激酶(JNK)特异性抑制SP600125对大鼠脑缺血再灌注后自噬性蛋白Beclin1、髓样细胞白血病基因-1(Mcl-1)蛋白和B淋巴瘤-2基因相关X(Bax)蛋白表达的影响。方法按照体重将SD大鼠随机分为3组,每组10只:假手术组、模型组和实验组。模型组和实验组均采用线拴法制作SD大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO)模型,脑缺血1 h再灌注72 h。造模前,实验组先向大鼠侧脑室内注射3μg·μL^(-1)SP600125溶液10μL,1 h后进行MCAO制模。以组织免疫荧光染色方法测定MCAO后JNK与Beclin1的表达;以免疫印迹法测定MCAO后JNK、Beclin1、Mcl-1和Bax蛋白表达。结果给药后,假手术组、模型组、实验组的JNK条带光密度值分别是0.11±0.05,0.83±0.03,0.56±0.04;这3组的Beclin1条带光密度值分别为0.14±0.04,1.77±0.05,0.86±0.05;这3组的Mcl-1条带光密度值分别为0.17±0.03,0.79±0.04,1.46±0.05;这3组的Bax条带光密度值分别为0.26±0.05,1.15±0.06,0.47±0.04。模型组与假手术组比较,JNK、Beclin1、Mcl-1和Bax值均明显增高,差异均有统计学意义(均P<0.01);实验组与模型组比较,JNK、Beclin1和Bax值均明显下降而Mcl-1值明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论通过抑制JNK可下调脑缺血再灌注后Bax与Beclin1的表达、上调Mcl-1蛋白表达,推测JNK可能参与调节缺血再灌注后神经元的自噬。     

p-JNK在结肠癌组织中的表达及抑制JNK通路后HT-29细胞增殖和凋亡变化

目的研究p-JNK在结肠癌组织中的表达以及抑制JNK信号通路后人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的变化。方法使用免疫组织化学方法检测50例结肠癌组织标本和50例正常结肠组织标本中p-JNK的表达情况并和临床资料进行比较分析;在人结肠癌细胞株HT-29中使用SP600125抑制JNK信号通路后,MTT法检测细胞增殖,TUNEL法检测凋亡。结果 p-JNK在结肠癌组织中的表达水平明显高于正常对照组织(P<0.05);并和淋巴结转移、肿瘤分化程度、肿瘤的侵犯深度相关(P<0.05);而与肿瘤部位无关。抑制JNK信号通路后,HT-29细胞中的p-JNK表达降低(P<0.05);增殖减少,凋亡增加(P<0.05)。结论在结肠癌组织中存在p-JNK的高表达,抑制JNK信号通路能降低人结肠癌细胞株HT-29细胞的增殖,并促进凋亡;JNK信号通路和结肠癌的发生发展有关。     

瓜蒌-薤白药对用于抗大鼠急性心肌缺血时对MAPK信号通路的影响

目的探讨瓜蒌-薤白药对单用与配伍用于大鼠抗急性心肌缺血心肌损伤中对MAPKs信号通路的影响。方法将40只大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（I／R）组、瓜蒌（TK）组、薤白（AM）组、瓜蒌薤白（TKAM）组,通过结扎冠状动脉左前降支造成大鼠急性心肌缺血损伤模型,分别用药物进行干预,各组动物于不同试验时限（缺血30min）时取出心脏。采用Westernblotting法观察丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs）信号通路细胞外信号调节激酶（。extracellularsignal—regulatedkinase,ERK）、C—Jun氨基端激酶（C—JunN—terminalkinase,JNK）、p38MAPKs磷酸化水平的影响,验证MAPKs信号在急性心肌缺血诱导心肌损伤发生发展中的作用：对心肌组织进行HE染色观察心肌坏死组织病理变化。结果对于大鼠抗急性心肌缺血模型,经电镜检查结果显示,配伍后的瓜蒌-薤白药对（1．875g／mL）对大鼠急性心肌缺血所造成的心肌组织损伤具有相对显著的保护作用;经Westernblot方法检验结果显示,与假手术组相比,在各组中以TKAM组P—p38及P—JNK的表达作用最弱,表明瓜蒌-薤白药对能有效抑制P—JNK及P—p38通路的蛋白进行表达;而通路P—ERK的表达结果却与其他两条通路相反,由此可以推论ERK信号通路的激活可能对心肌损伤具有保护作用。结论瓜蒌薤白配伍后抗心肌组织损伤的效果更显著;3种丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在瓜蒌薤白药对抗急性心肌缺血过程中发挥着不同的作用。     

5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对 HT-29和 LoVo结直肠癌细胞株中 p16基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的：探讨甲基化酶抑制剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷（5′-Aza-2′-deoxycytidine,5′-Aza-CdR）对结直肠癌细胞株HT-29和Lo-Vo中p16基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达的影响。方法应用TaqMan探针为基础的实时定量PCR法、SYBR Green PCR法及蛋白印迹实验（ Western blot ）检测不同浓度5′-Aza-CdR处理前后HT-29和LoVo细胞中p16基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。结果 TaqMan 探针为基础的实时定量PCR法检测HT-29和LoVo细胞中p16蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0．5、1．0、1．5μM 5′-Aza-CdR处理后p16基因mRNA和蛋白均重新表达,具有统计学意义（P均＜0．05）。结论结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中p16启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5′-Aza-CdR能够较成功的逆转结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中p16基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。     

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞MAPK/ERK信号通路的影响

目的探讨苦参碱对人横纹肌肉瘤（RMS）RD细胞ERK通路的影响。方法取对数生长期的细胞,随机分为对照组（含细胞无药物）及3个药物干预组（分别为U0126 10μmol组、苦参碱1.0 mg/mL组和U0126 10μmol与苦参碱1.0 mg/mL共同作用组）。蛋白质印迹法（Western blotting）检测p44/p42MAPK（ERK1/2）及Phospho-p44/p42MAPK（p-ERK1/2）的表达;反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测erk m RNA的表达。最后采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析。结果 Western blotting法检测ERK1/2、p-ERK1/2的表达,对照组（U0126 10μmol组,苦参碱1.0 mg/mL组及U0126 10μmol与苦参碱1.0 mg/mL共同作用组）的灰度值分别为：2.84±0.03、2.64±0.03、2.14±0.01、2.10±0.02及1.76±0.15、1.37±0.19、1.21±0.24、1.19±0.22。与对照组比较,苦参碱1.0 mg/mL组及苦参碱与U0126共同作用组对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.01）;RT-PCR方法检测erk m RNA的表达,对照组（U0126 10μmol组,苦参碱1.0 mg/mL组及U0126 10μmol与苦参碱1.0 mg/mL共同作用组）的灰度比值分别为0.59±0.04、0.57±0.04、0.25±0.02和0.18±0.01,苦参碱1.0 mg/mL组及苦参碱与U0126共同作用组erk m RNA的表达量较对照组明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论苦参碱在体外环境下作用RMS-RD细胞,可抑制erk m RNA的表达及ERK1/2蛋白磷酸化的活性。     

腰椎间盘退变组织中P-p38 MAPK的表达

目的探讨腰退变椎间盘组织中丝裂原活化蛋白激酶(P-p38 MAPK)的表达。方法应用免疫组织化学方法和ELISA检测10例正常腰椎间盘组织和30例腰退变椎间盘组织中P-p38MAPK的表达量。结果腰退变椎间盘组织中P-p38 MAPK的表达量明显高于正常腰椎间盘组织[(0.657±0.086)μg/L vs.(0.165±0.024)μg/L](P<0.05)。结论退变椎间盘中P-p38 MAPK含量明显高于正常椎间盘组织,提示其可能参与了腰椎间盘的退变过程。     

地塞米松对哮喘小鼠肺液清除功能障碍的作用

目的：研究支气管哮喘（以下简称哮喘）小鼠肺液清除功能的变化及地塞米松的作用，并探讨其可能机制。方法：雌性C57／BL6小鼠48只，随机分为对照组、哮喘组和地塞米松干预组。以卵蛋白（OVA）联合佐剂腹腔注射（第1、15天）加雾化吸入（第25～29天）方法复制小鼠哮喘模型。分别在末次激发后2h及24h测定各组小鼠肺组织病理变化及湿干重比值（W／D），应用免疫组化法测定各组水通道蛋白5（AQP5）在肺组织中的分布，分别采用实时PCR和蛋白质印迹法测定各组小鼠肺组织中AQP5mRNA和蛋白质的变化。ELISA法测定各组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞数和细胞因子IFN-γ及IL-13的水平。结果：哮喘组小鼠肺组织W／D较对照组明显升高，末次激发后2h和24h分别为4．98±0．46和4．81±0．33，分别升高22．9％和18．7％（P〈0．05），且激发后2h哮喘组小鼠肺组织W／D升高更明显。地塞米松干预组小鼠2h和24h肺组织W／D分别为4．01±0．11和4．21±0．14，与哮喘组小鼠相比显著降低（P〈0．05）；与对照组无显著性差异（P〉0．05）。HE染色可见哮喘组小鼠肺组织支气管周围大量以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润；地塞米松干预组小鼠气道炎症程度减轻，支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞比哮喘组明显减少，IFN-γ和IL-13分别为（89．25±9．71）和（52．37±8．69）pg／mL，与哮喘组EIFN-γ和IL-13分别为（66．71±7．51）和（85．49±9．23）pg／mL]相比明显改善（P〈0．05）。免疫组化分析表明，AQP5主要表达于Ⅰ型肺泡上皮细胞和气道上皮细胞的腔膜面。哮喘小鼠肺组织中AQP5的表达均较对照组明显减少（mRNA减少约42％，蛋白质减少约64％）。地塞米松上调其表达（与模型组比较，P〈0．05）。结论：哮喘小鼠存在肺液清除功能障碍，肺液含量增?     

油酰乙醇胺对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究油酰乙醇胺(OEA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用以及对p38信号通路的影响。方法分离大鼠胸主动脉,组织贴块法培养VSMCs,AngⅡ刺激VSMCs建立细胞增殖模型,不同浓度OEA(5,10,20μmol/L)作用后,用溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)掺入的方法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化;Western-bolt法检测对P-p38和p38蛋白表达的影响。结果与AngⅡ组比较,随着OEA浓度升高,VSMCs的增殖受到抑制、G0/G1比例显著升高,G2/M比例显著降低,且P-p38和p38蛋白的表达量降低并呈浓度依赖关系。结论 OEA对VSMCs的增殖有抑制作用,其机制可能是抑制了p38MAPK信号通路。     

5’-氮杂-2’-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞苷（5’-Aza-CdR）对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用0.5、1.0、1.5μmol/L浓度的5’-Aza-CdR处理CRC细胞株HT-29和LoVo。应用MethyLight方法、实时荧光定量PCR方法及蛋白印迹试验（Westernblot）检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中MGMT基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达情况。结果 MethyLight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转。实时荧光定量PCR检测5’-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组HT-29细胞株和LoVo细胞株MGMT基因mRNA表达水平均较对照组上调,Western blot检测5’-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组MGMT蛋白表达水平均较对照组上调,且均具有药物剂量依赖性（P〈0.05,P〈0.01）。结论 CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5’-Aza-CdR能够逆转CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。     

依达拉奉对大鼠星形胶质细胞水通透性的影响

目的 探讨依达拉奉对缺氧复氧大鼠星形胶质细胞模型水通透性和水通道蛋白4（AQP4）的影响.方法 原代培养大鼠星形胶质细胞,通过95％（体积分数）N2培养8h和95％（体积分数）的空气复氧培养6h,构建缺氧复氧水肿模型.设置空白组（正常细胞）、对照组（水肿细胞未经受药物刺激）和刺激组（接受0.1、1、10或100μg/mL的依达拉奉溶液刺激）.采用细胞水通透性系数（Pd）检测、荧光定量PCR和Western Blot定量空白组、对照组和刺激组细胞水肿、AQP4 mRNA AQP4蛋白表达.结果 缺氧8h和复氧6h后细胞水肿,且AQP4表达量上升.0.1μg/mL依达拉奉刺激后,模型细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达量与未刺激过的水肿星形胶质细胞比较,差异无统计学意义（P均＞0.05）,1、10或100μg/mL依达拉奉刺激后,水肿星形胶质细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达量显著低于未刺激过的水肿星形胶质细胞（P均＜0.05）,与正常的星形胶质细胞比较,差异无统计学意义（P均＞0.05）.结论 1、10或100 μg/mL依达拉奉可通过抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表达,从而抑制细胞水肿.     

透骨草提取物通过Bcl-2和Bax蛋白诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡

目的探讨Bax和Bcl-2蛋白在透骨草提取物诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡过程中的作用,为透骨草提取物治疗乳腺癌提供实验依据。方法采用吖啶橙染色方法透骨草提取物对MCF-7细胞形态的影响;采用流式细胞术检测透骨草提取物对MCF-7细胞凋亡率的影响;采用蛋白印迹法检测MCF-7细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果 30.5μg/ml透骨草提取物可诱导MCF-7细胞胞体皱缩,胞核固缩、呈新月状且边集,出现凋亡小体。30.5μg/ml透骨草提取物处理的MCF-7细胞凋亡率（22.3±1.2）%明显高于对照组（3.2±1.0）%（P〈0.05）。30.5μg/ml透骨草提取物可使MCF-7细胞Bcl-2蛋白表达明显低于对照组（P〈0.05）,而Bax蛋白表达明显高于对照组（P〈0.05）。结论透骨草提取物对MCF-7细胞有诱导凋亡作用,其作用机制可能与下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达有关。     

Silibinin activated p53 and induced autophagic death in human fibrosarcoma HT1080 cells via reactive oxygen species-p38 and c-Jun N-terminal kinase pathways

Our previous research demonstrated that hepatic-protectant silibinin induced autophagy in human fibro-sarcoma HT1080 cells through reactive oxygen species (ROS) pathway. Pifithrin-α (PFT-α), a specific inhibitor of p53, reduced autophagy and reversed silibinin's growth-inhibitory effect; besides, PFT-α decreased the activation of caspase-3, a crucial executor of apoptosis. Silibinin upregulated expression of p53/phosphorylated-p53 (p-p53) in a time-dependent manner. Catalase (scavenger of H(2)O(2)), superoxide dismutase (SOD) (scavenger of O(2)(?-)), and SB203580 (inhibitor of p38) attenuated upregulation of p53 expression, suggesting that p53 might be partially regulated by ROS-p38 pathway. On the other hand, c-Jun N-terminal kinase (JNK) increased autophagic death in silibinin-treated cells, and JNK/p-JNK expression was upregulated by silibinin time-dependently. Inhibition of JNK by SP600125 did not influence generation of ROS. Scavengers of H(2)O(2) or O(2)(?-) showed no effect on expression of JNK/p-JNK, indicating that JNK might not correlate with ROS in this process. However, activation of p53 was suppressed by SP600125; therefore the function of p53 was possibly controlled by JNK as well. Western blotting analysis showed that PFT-α reduced activation of extracellular regulated kinase1/2 (ERK1/2) and expression of protein kinase B (PKB, or Akt)/p-Akt. PD98059 (inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK)/ERK) and wortmannin (inhibitor of phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt) enhanced silibinin's cytotoxicity. Wortmannin augmented silibinin-induced autophagy, while PD98059 did not affect autophagic ratio. These results suggest that silibinin might induce p53-mediated autophagic cell death by activating ROS-p38 and JNK pathways, as well as inhibiting MEK/ERK and PI3K/Akt pathways.