CAP64荚膜相关基因在新生隐球菌分型中的意义

新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础^[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一^[2],我们根据新生隐球菌血清型DCAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

用改进的PCR方案测定PCR指纹条带序列后设计的特异引物对新生隐球菌新生变种作基因分型

新生隐球菌新生变种通过用 (ＧＡＣＡ) 4 引物采用ＰＣＲ指纹法可产生 4条主要条带 (42 0、4 75、5 4 0和80 0ｂｐ) ,根据它们不同的组合可以被再分为 6种基因型 (ＶＮ1～ＶＮ6 )。该研究的目的是确定能扩增这4条主要条带的特异性引物。首先须测定这 4条主要条带的核苷酸序列 ,为此作者建立了一种无需克隆载体的改进的ＰＣＲ测序方案以克服用 (ＧＡＣＡ) 4作单循环测序引物的缺陷 ;而后以获得的序列设计新引物 ,通过对新生隐球菌和其他酵母株的扩增 ,以证实新引物具有种的特异性 ,可用作新生隐球菌的分子分型。材料和方法 :①抽提 12株新生…     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

用表达的序列标记制备染色体特异性探针以分离新生隐球菌

从临床和环境中分离出的新生隐球菌的核型表现出高度的异质性,这与感染人体过程中或在不同条件下出现的核型改变有关。而分析这些不同核型的分子基础需要一组染色体特异性探针。作者首先从新生隐球菌B-3501株     

荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用

目的探讨新生隐球菌多糖荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用。方法按照笔者建立的原发性皮肤隐球菌感染模型构建方法,将新生隐球菌标准野生株B3501与荚膜缺陷株cap64分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠,皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程,比较皮损形成与消退的时间。结果野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌皮下接种于BALB/c小鼠后,均可以在免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠皮肤上产生结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损,皮损可以自愈,真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株感染的病程差异无显著性意义。结论野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌均可以造成BALB/c小鼠相似的皮肤感染。荚膜可能不是小鼠皮肤隐球菌感染的主要毒力因子。     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

80株中国大陆新生隐球菌环境株表型和分子特征的初步研究

目的了解中国大陆地区新生隐球菌环境株的分布情况,及其表型和基因型特征。方法采用CACA培养基培养1372份来自中国大部分地区私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,分离出新生隐球菌,并对其表型和基因型特征进行分析。结果共分离出80株新生隐球菌,分离阳性率约为5．5％,所有菌株37℃生长良好,有完整荚膜,尿素酶试验阳性。ITS序列分析证实分离出的新生隐球菌均属于血清型A。M13-PCR显示,其基因型为我国及东南亚地区特征性的VNIC型,显示了与临床株的高度一致性。结论中国大陆地区的新生隐球菌临床株与环境株显示了高度的同源性,提示对于易感人群,阻断与相应环境的接触可有效预防新生隐球菌的感染。     

C57BL/6小鼠感染新生隐球菌对大脑皮质BDNF和bFGF表达的影响

目的：观察C57BL／6小鼠感染新生隐球菌后对大脑皮质BDNF和bFGF表达的影响，并探讨BDNF和bFGF在新生隐球菌感染过程中的作用及其意义。方法：48只C57BL／6雌性小鼠随机分为对照组、环磷酰胺组和试验组，免疫组化法检测大脑皮质BDNF和bFGF的表达。结果：尾静脉注入新生隐球菌后6h大脑皮质查见新生隐球菌，2h大脑皮质BDNF的表达明显高于对照组和环磷酰胺组（P〈0．01），0.5h大脑皮质bFGF的表达明显高于对照组和环磷酰胺组（P〈0.01）。结论：新生隐球菌感染后大脑皮质BDNF和bFGF表达增高，提示BDNF和bFGF对新生隐球菌性脑膜炎具有修复作用，有望成为潜在的防治新生隐球菌性脑膜炎的药物。     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

脑脊液对新生隐球菌和念珠菌的抗真菌活性研究

隐球菌性脑膜炎是隐球菌病中最严重的一型 ,尽管从隐球菌性脑膜炎患者脑脊液 (ＣＳＦ)中可分离出新生隐球菌 ,但对ＣＳＦ影响病原真菌生长的因素知之甚少。作者参照血清抑制新生隐球菌生长因素的研究方法 ,探讨了ＣＳＦ对新生隐球菌和念珠菌的体外抗真菌活性。材料与方法 :新生隐球菌 8株、白念珠菌 2株、光滑念珠菌 1株、克柔念珠菌 1株、乳酒念珠菌 1株。ＣＳＦ过滤除菌后用乳酒念珠菌作生物测试以排除其中的抗真菌药物活性。用ＲＰＭＩ-1 64 0培养液将ＣＳＦ倍比稀释后加入微测量平板中 ,同时用ＲＰＭＩ-1 64 0作对照 ,然后在上述培养基…     

几种隐球菌酶扩增核糖体DNA图谱及快速基因鉴定

DNA的聚合酶链式反应(PCR)和核糖体DNA(rDNA)位点内限制酶切片段长度的多态性分析(RFLP)是遗传学分析的新方法,作者将这两种方法用于隐球菌rDNA的分析.受试菌种含新生隐球菌(19株)、浅白隐球菌(5株)、指甲隐球菌(2株)、罗伦隐球菌(4株)、黑隐球菌(1株)、白念珠菌(2株).将经土豆浸汁培养基中     

新生隐球菌不同变种所致小鼠原发性皮肤感染的比较

目的：探讨新生隐球菌不同变种在原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染中的作用。方法：按照我们建立的原发性皮肤隐球菌感染模型的方法，将新生隐球菌新生变种标准野生株B3501与格特变种标准株ATCC32609分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠，皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程，比较皮损形成与消退的平均时间。结果：2种变种的新生隐球菌皮下接种于BALB／c小鼠后，可以在免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠皮肤上产生丘疹、结节、溃疡、传染性软疣样皮损，皮损可以自愈，真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株只在免疫正常小鼠的皮损形成时间上存在差异。结论：新生变种与格特变种的新生隐球菌均可以造成BALB／c小鼠相似的皮肤感染。推测2种变种对原发性皮肤感染的致病力可能无差异，新生变种发病较多可能与其分布有关。     

新生隐球菌cap60荚膜缺陷株转化系统的构建

目的 构建新生隐球菌荚膜缺陷株ｃａｐ６０的转化系统。方法与结果：（１）在新生隐球菌的荚膜缺陷株ｃａｐ６０中利用５－氟乳清乳（５－ＦＯＡ）反选择法筛选到一个尿嘧啶合成基因突变株。（２）利用带有以新生隐球菌ｕｒａ５基因为选择标记的质粒载体ｐＣｎｔｅｌｌ－ｄ通过电转化法和化学转化法成功地转化该ｕｒａ５突变株。     

新生隐球菌白化株酚氧化酶结构基因的突变研究

目的 探讨新生隐球菌白化突变的分子机制,进一步研究白化突变株与野生产黑株之间漆酶基因（CNLAC1）的差异。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增白化突变株与野生产黑株在比较研究中发现的差异基因片段;克隆异常片段的PCR产物,用PGEM-T载体构建重组表达质粒载体。转化大肠杆菌,进行目的基因测序。结果 克隆了产黑株及白化株存在差异的片段,构建了差异基因片段的重组质粒载体,转化后测序发现在1715bp-2617bp之间白化验突变株不仅存在基因片段大小的改变,而且存在碱基序列的改变。结论 新生隐球菌白化突变的分子机制,可能在于其CNLAC1基因在1715bp-2617bp之间碱基序列的改变,而不是基因片段的单纯缺失,白化突变株差异基因片段可能为新生隐球菌病的预后和治疗提供一个靶基因。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎41例临床分析

目的:探讨艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎患者的临床特征及疗效。方法:回顾性分析2011年4月——2018年6月该院收治的41例艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎患者的临床特点、实验室和辅助检查及疗效等。结果:所有患者中临床表现为发热者25例(61.0%),头痛者23例(56.1%),恶心呕吐者8例(19.5%)及颈项强直者29例(70.7%)。CD4~+T淋巴细胞计数100×10~6个/L者40例(97.6%);脑脊液压力180 mmH_2O者34例(82.9%),脑脊液墨汁染色阳性者34例(82.9%),脑脊液培养示新生隐球菌阳性者28例(68.3%),6例脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原检查均阳性(100%),合并新生隐球菌败血症者23例(56.1%);头颅影像学检查异常者12例(29.3%)。经规范化抗隐球菌治疗,有效率为70.7%(29例),病死率为29.3%(12例),其中复发率为2.4%(1例)。结论:对疑似艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎感染患者应及时行腰椎穿刺术、脑脊液病原学检测及隐球菌荚膜多糖抗原检查,对疑似患者的早期诊断和治疗是降低新生隐球菌性脑膜炎病死率的关键。     

隐球菌与体外培养角质形成细胞的相互作用

目的：研究隐球菌与体外培养的角质形成细胞的相互作用。方法：检测新生隐球菌对体外培养的角质形成细胞HaCaT株（简称HaCaT细胞）的时间-浓度黏附率、通透率；检测新生隐球菌对细胞的损伤；透射电镜观察二者相互作用的超微结构。结果：新生隐球菌标准野生株B3501（简称B3501）可以对HaCaT细胞产生黏附与侵袭，黏附率与侵袭率呈现时间依赖性；同时，B3501还可以使HacaT细胞凋亡率升高，对其造成损伤，这与菌体的活力相关。超微结构可见新生隐球菌与角质形成细胞的黏附与侵袭过程。结论：活的隐球菌黏附与侵袭角质形成细胞是其感染皮肤的重要条件。进一步明确二者的相互作用对隐球菌发病机制的研究具有重要意义。     

重度隐球菌性脑膜炎抢救成功一例

隐球菌性脑膜炎（以下称隐脑）是由新生隐球菌侵犯中枢神经系统而引起的深部真菌病，预后严重，死亡率高，即使经过正规治疗，死亡率仍高达２５％～６０％［１］，以往认为隐脑患者脑脊液（ＣＳＦ）中菌体计数超过２８０个／ｍｍ３，即无法救治，往往在数天内死亡。最近我...     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。