姜黄素对大鼠膀胱肿瘤的预防与治疗作用

目的:建立以N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)诱发膀胱癌的Wistar大鼠模型,研究姜黄素对诱发膀胱癌的化学干预作用,并探讨其可能的作用机制。方法:采用膀胱灌注MNU(1.5 mg/次)的方法诱发Wistar大鼠膀胱肿瘤(MNU灌注时间为第0、2、4、6和8周);实验分为2组,在诱癌的同时(第1、3、5、7和9周时,预防组)或者诱癌成功后(第10、12、14、16和18周时,治疗组)予以膀胱灌注姜黄素溶液(160 μmol/L)0.2 mL/只;分别在第13周时处死预防组大鼠,第23周时处死治疗组大鼠,获得的膀胱组织行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察病理变化,Hoechst 33258荧光染色法检测肿瘤组织中细胞的凋亡情况。结果:在预防组中,第13周时姜黄素处理组膀胱癌的发生率为23.1%(3/13),其中浅表性癌3例,无肿瘤侵犯肌层;对照组肿瘤的发生率为66.7%(8/12),浅表性癌6例,肿瘤侵犯肌层2例,与对照组相比肿瘤的发生率、分期之间差异均有统计学意义。治疗组病理检测结果显示,肿瘤发生后再用姜黄素处理不能降低肿瘤分期,但能显著增加膀胱肿瘤细胞的凋亡。结论:姜黄素可抑制膀胱灌注MNU诱导的大鼠膀胱癌的发生与进展,其机制可能与诱导膀胱肿瘤细胞凋亡有关;但对于已经成瘤的大鼠膀胱癌无明显疗效。     

MNU诱导的近交系大鼠膀胱肿瘤模型

目的通过膀胱灌注N-甲基亚硝基脲(MNU)诱导近交系大鼠膀胱肿瘤。方法选取F344大鼠20只，膀胱灌注MNU，每2周1次，共5次；于第14周处死动物，取膀胱肿瘤组织测MHC—Ⅰ及病理观察。结果MNU组肿瘤发生率为100％；膀胱肿瘤的MHC—Ⅰ表达较高(58．60％～93．80％)。结论MNU可成功诱导F344大鼠膀胱肿瘤的形成，是肿瘤免疫治疗的理想模型。     

MNU诱导大鼠膀胱癌基底膜病变与LN的相关性

目的观察N-甲基亚硝基脲(MNU)在诱导SD雌性大鼠膀胱癌的过程中,膀胱基底膜的病变情况与层粘连蛋白(Laminin,LN)的相关性。方法MNU 2 mg/次进行大鼠膀胱灌注,间隔2周,共4次;然后继续正常喂养6周,14周为诱癌终点。分别在MNU灌注后1周及诱癌终点14周用病理学检测观察膀胱粘膜变化情况;免疫组织化学检测基底膜中LN的表达情况,分析其相关性。结果病理结果显示:MNU灌注后膀胱粘膜经过了炎症性改变、异型增生、原位癌、浸润性癌等过程;免疫组化显示基底膜连续、完整的结构,出现断裂、缺损,最后视野下为散在碎片,无基底膜形态;LN在MNU诱导大鼠膀胱癌形成过程中随着基底膜的破坏逐渐减少,缺失;LN在基底膜中的表达在正常膀胱组织与膀胱癌之间存在差异性统计意义(χ2=25.37;P<0.01)。结论膀胱癌的发生、发展与基底膜的破坏密切相关,且LN的缺失是基底膜破坏导致膀胱癌的因素之一。     

经尿道灌注自杀基因治疗大鼠膀胱癌的实验研究

目的:探讨经尿道膀胱灌注脂质体和逆转录病毒载体介导的自杀基因(HSVtk),观察在羟基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)作用下大鼠膀胱肿瘤的生长情况.方法:用N-甲基-亚硝基脲(MNU)膀胱灌注建立大鼠原位膀胱癌模型.经尿道膀胱灌注脂质体、逆转录病毒载体HSVtk基因,随后腹腔内注射GCV,连续6天.结果:经尿道膀胱灌注HSVtk基因后48h,RT-PCR检测出膀胱肿瘤中HSVtk基因表达.逆转录病毒组和脂质体组膀胱总重量与裸质粒组和对照组相比有显著差异,表明膀胱肿瘤的生长被抑制.TUNEL法原位检测肿瘤组织中凋亡细胞不仅出现在表层细胞,而且深层细胞大量凋亡,推测旁观者效应可能发挥了一定作用.结论:经尿道膀胱灌注脂质体DNA或重组逆转录病毒载体可以向肿瘤转导HSVtk基因.HSVtk/GCV系统能抑制大鼠原位膀胱肿瘤的生长,显示出抗肿瘤作用.     

MNU诱导的大白鼠膀胱肿瘤动物模型

 目的　研究N--甲基亚硝基脲(MNU)诱发大白鼠膀胱肿瘤 的 作用。方法　以MNU为诱癌剂,进行大白鼠膀胱灌注,以光镜、扫描电镜、 透射电镜等为观察手段,对其诱发的膀胱肿瘤进行观察。结果　每次灌注MNU2 m g/只,每2周1次,共4次,8周诱发膀胱肿瘤率100%,其组织学形态及病理特征与人膀胱肿瘤 十分相似。结论　MNU诱发的大白鼠膀胱肿瘤为一理想的动物模型。     

吡柔比星膀胱内灌注预防非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌复发的机制

目的 观察膀胱内灌注吡柔比星后对正常膀胱组织和膀胱癌组织细胞凋亡的影响,探讨吡柔比星膀胱内灌注预防非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌复发的机制.方法 将40例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌患者随机分为3组,15例于经尿道膀胱肿瘤电切术(TUR-BT)前1h、15例于TUR-BT术前24 h行膀胱内灌注(30 mg吡柔比星,在膀胱内保留30 min),对照组10例仅行TUR-BT术.取患者的正常膀胱组织和膀胱癌组织,以荧光显微镜观察吡柔比星的分布,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,免疫组化染色检测bcl-2和bax的蛋白表达.结果 吡柔比星膀胱内灌注后1h,正常膀胱组织黏膜层偶见吡柔比星荧光,膀胱癌组织可见弥漫分布的吡柔比星荧光,可达肌层.24 h后,在膀胱癌组织内仍可见到吡柔比星的荧光.TUNEL检测结果显示,实验组膀胱癌的凋亡指数显著高于对照组(P<0.01).bcl-2/bax比值与凋亡指数具有相关性.结论 吡柔比星灌注化疗中可选择性作用于非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌.通过影响膀胱癌组织bcl-2/bax表达,诱导肿瘤细胞发生凋亡,可能是吡柔比星膀胱内灌注预防非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌复发的重要机制.     

曲古霉素A治疗膀胱癌的体内外研究

目的 观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对膀胱癌的体内外杀伤作用.方法 用MTT法检测TSA对膀胱癌细胞生长的抑制作用;Hochest染色观察细胞凋亡;Western blot检测乙酰化组蛋白3和survivin表达的变化,观察膀胱灌注TSA对膀胱癌模型大鼠肿瘤生长的抑制作用.结果 TSA对膀胱癌细胞的抑制率均随着浓度的增加而明显增加;TSA下调膀胱癌细胞survivin的表达;TSA与阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)和顺铂(DDP)联用具有明显的协同作用;经TSA膀胱灌注可明显抑制膀胱癌模型大鼠肿瘤生长,肌浸润癌比例明显低于未治疗组;TSA膀胱灌注联合MMC腹腔注射抑制肿瘤作用更明显.结论 TSA可明显抑制膀胱肿瘤的生长,并且能增强抗癌药物对膀胱癌细胞的杀伤作用.     

同种肿瘤来源的HSP70-PC对原位的大鼠膀胱肿瘤的治疗研究

 目的 研究用来自亚高温盆腔区域热疗后原位大鼠膀胱肿瘤的热休克蛋白70-肽复合物（HSP70-PC）对原位大鼠膀胱肿瘤的治疗作用机制。方法 经尿道膀胱灌注MNU制备出大鼠膀胱肿瘤动物模型。将动物随机分为A（肿瘤对照）组、B（HSP70-PC治疗）组、C（肿瘤细胞裂解液治疗）组，每组5只。皮下注射治疗1个月后检测膀胱及肿瘤湿重，肿瘤分期分级，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数（AI），免疫组化检测肿瘤细胞增殖细胞核抗原指数（PCNA LI）、肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率、膀胱引流区域髂动脉及腹主动脉旁淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率、脾脏S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率，ELISA法检测血清Rat IFN-γ含量。结果 膀胱及肿瘤湿重B组低于A、C组（P＜0.01）。A、C组间差异无显著性意义（P = 0.610）。B组肿瘤分期低于A、C组（P＜0.01）；A、C组间差异无显著性意义（P =1.00）。肿瘤分级各组间差异均无显著性意义（P =1.00）。B组肿瘤细胞AI、膀胱肿瘤组织中CD8阳性细胞率、血清Rat IFN-γ含量均高于A、C组（P＜0.01）；A、C组间差异均无显著性意义（P =0.870，0.597，0.979）。脾脏S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率由高到低依次为B、C、A组（P＜0.01）。肿瘤细胞PCNA LI、膀胱肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率、淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率三组之间差异均无显著性意义（P =0.808，0.718，0.847）。结论 皮下注射HSP70-PC可以上调原位的膀胱肿瘤大鼠的细胞免疫状态，促进肿瘤凋亡，但对肿瘤细胞增生无影响。     

丹皮酚对表柔比星诱导的膀胱癌BIU-87细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨丹皮酚对表柔比星诱导的膀胱癌BIU-87细胞凋亡的影响，并对其及作用的分子机制进行探讨。方法:将培养的人膀胱癌BIU-87细胞以不同浓度的丹皮酚处理后，采用MTT法检测对细胞增殖抑制的影响，流式细胞术检测细胞凋亡情况，酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测白细胞介素-1β（IL-1β）水平，Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）和生存素（survivin）的表达水平。结果:丹皮酚抑制人膀胱癌细胞BIU-87增殖。表柔比星抑制膀胱癌细胞BIU-87的增殖，诱导细胞凋亡，促进Cleaved Caspase-3、IL-1β的表达，抑制survivin的表达，与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。丹皮酚可增强表柔比星对膀胱癌细胞BIU-87增殖抑制作用，增强表柔比星对细胞凋亡的诱导，与EPI组及对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:丹皮酚可增强表柔比星诱导膀胱癌细胞的凋亡和增殖抑制作用，其作用机制与Caspase-3的活化，下调survivin的表达，促进IL-1β的分泌有关。     

肿瘤相关巨噬细胞对膀胱癌细胞增殖和血管生成的影响

目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）对膀胱癌细胞增殖和血管生成的影响。方法:采用巨噬细胞U937的上清液培养膀胱癌细胞系T24,CCK-8法检测膀胱癌细胞的增殖能力;流式细胞术检测其对细胞周期的影响;通过实时荧光定量PCR和Western blot检测膀胱癌细胞中血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA和蛋白表达以及AKT磷酸化水平。结果:CCK-8结果表明TAMs促进膀胱癌细胞的增殖;流式结果显示TAMs能促进细胞周期G1-S期转换;实时荧光定量PCR和Western blot 结果显示TAMs促进膀胱癌细胞内VEGF的mRNA和蛋白表达,并促进AKT磷酸化。结论:TAMs促进细胞周期G1-S期转换,促进AKT磷酸化和VEGF的表达,且TAMs有望成为膀胱癌治疗和预后判断新的靶点。     

微粒体环氧化物水解酶在膀胱癌中表达的研究

目的：探讨微粒体环氧化物水解酶（mEH）在正常膀胱组织和膀胱癌中的表达及其与临床分期和病理分级的关系。方法：应用western blot和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法检测20例正常膀胱组织、90例膀胱癌组织中mEH的表达情况及其与膀胱癌各临床病理参数的关系。结果：膀胱癌和癌旁正常组织中均有mEH的表达,但在膀胱癌中的表达量明显低于癌旁正常组织的表达量且具有统计学意义（P〈0.01）。膀胱癌组织中mEH蛋白表达总阳性率为31.11%,显著低于正常膀胱组织的65%（P〈0.05）,而且与肿瘤病理分级及肿瘤临床分期具有显著的相关性（P〈0.05）。结论：mEH蛋白的低表达与膀胱癌的发生、发展密切相关,可以为膀胱癌的良、恶性分析及判断肿瘤的生物学行为提供一定的依据。     

MAGE-A3在人类膀胱癌干细胞中的表达

目的：研究肿瘤相关抗原,黑色素瘤抗原家族A成员3（melanoma antigen family A,3;MAGE-A3）,在人类膀胱癌干细胞中的表达情况,并探讨其意义.方法：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和Western blot技术检测MAGE-A3在人类膀胱癌细胞系T24细胞中及从其中分离出来的具有干细胞特性的T24侧群细胞中的表达情况;采用免疫荧光双标记技术检测MAGE-A3和膀胱癌干细胞的一个标志物CD133在T24侧群细胞中的共表达情况.结果：在mRNA和蛋白水平,MAGE-A3在具有癌干细胞特性的T24侧群细胞中的表达水平明显高于对应的母系T24细胞;MAGE-A3和膀胱癌干细胞标志物CD133在T24侧群细胞中有阳性共表达.结论：MAGE-A3在人类膀胱癌干细胞中有特异性的高表达,有望成为膀胱癌干细胞一个新的、特异性的标志物,及针对膀胱癌干细胞进行免疫治疗的一个新的靶点.     

The dietary flavonol fisetin enhances the apoptosis-inducing potential of TRAIL in prostate cancer cells

Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is an endogenous agent that induces apoptosis selectively in cancer cells. Soluble or expressed in immune cells, TRAIL plays an important role in the defense against tumour cells. The resistance of cancer cells to TRAIL immune surveillance is implicated in tumour development. Naturally occurring flavonoids can sensitize TRAIL-resistant cancer cells and augment their apoptotic activity. Fisetin, a dietary flavonol has cancer preventive properties. This study was designed to investigate the effect of fisetin on the TRAIL-induced apoptosis potential in prostate cancer cells. Prostate cancer cell lines represent an ideal model for research in chemoprevention. Cytotoxicity was measured by MTT and LDH assays. Apoptosis was detected using Αnnexin?V-FITC by flow cytometry and fluorescence microscopy. Mito-chondrial membrane potential (ΔΨm) was evaluated using DePsipher staining by fluorescence microscopy. Death receptor (TRAIL-R1 and TRAIL-R2) expression was analysed by flow cytometry. Inhibition of NF-κB (p65) activation was confirmed with an ELISA-based TransAM NF-κB kit. Caspase-8 and caspase-3 activities were determined by colorimetric protease assays. Our study demonstrates that fisetin sensitizes the TRAIL-resistant androgen-dependent LNCaP and the androgen-independent DU145 and PC3 prostate cancer cells to TRAIL-induced death. Fisetin augmented TRAIL-mediated cytotoxicity and apoptosis in prostate cancer LNCaP cells by engaging the extrinsic (receptor-mediated) and intrinsic (mitochondrial) apoptotic pathways. Fisetin increased the expression of TRAIL-R1 and decreased the activity of NF-κB. Co-treatment of cancer cells with TRAIL and fisetin caused significant activation of caspase-8 and caspase-3 and disruption of ΔΨm. Our data indicate the usefulness of fisetin in prostate cancer chemoprevention through enhancement of TRAIL-mediated apoptosis.     

盐酸小檗碱对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究盐酸小檗碱对人胃癌细胞及永生化胃上皮细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨其中可能的分子机制。方法：利用不同浓度的小檗碱处理胃癌细胞系MKN-45和SGC-7901细胞,以及永生化胃上皮细胞系GES细胞,采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（PI标记）,Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果：MTT结果显示与空白对照组相比,小檗碱处理后,细胞增殖速度明显受到抑制（P〈0.05）,并呈浓度依赖性,其中50μg/ml处理组最大抑制率为81.3%,这种抑制作用对胃癌细胞更为明显。流式细胞仪检测表明,小檗碱在较低浓度（10μg/ml）时即可诱导胃癌细胞出现G0/G1阻滞,S期细胞百分比减少和细胞凋亡（P〈0.05）,这种作用呈时间和浓度依赖性。Western blot结果提示小檗碱处理后,胃癌细胞Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax及p53蛋白表达水平明显上调。结论：小檗碱可抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡,其机制与阻滞细胞周期进展以及调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和p53密切相关。     

甲基苄基亚硝胺诱导大鼠食管癌癌前病变食管组织中β-catenin表达及其Ser675位点磷酸化水平的变化

目的： 探讨甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱导食管癌癌前病变食管组织中β-连环蛋白(β-catenin)mRNA转录、蛋白表达及其Ser675位点磷酸化水平的变化。方法：Wistar大鼠按3.5 mg/kg皮下注射0.15% MBNA溶液,每周2次作为模型组,以同批次正常大鼠(皮下注射生理盐水)为对照组,每组8只,连续10周,于造模第10周处死2组大鼠,观察食管黏膜病理变化,采用定量PCR检测食管组织中β-catenin mRNA转录水平,Western blot检测β-catenin蛋白及其Ser675位点磷酸化蛋白表达水平,免疫组化检测β-catenin蛋白表达的定位情况。结果：MBNA诱导10周后模型组大鼠均可见食管黏膜粗糙,部分可见乳突瘤,食管黏膜病理学检查呈轻度不典型增生,且模型组大鼠食管组织中β-catenin mRNA转录水平(0.619±0.086)较正常组(1.000±0.235)降低(P<0.01);β-catenin蛋白表达水平(1.476±0.363)较正常组(1.000±0.496)升高(P<0.05);Ser675位点磷酸化β-catenin蛋白表达水平(2.150± 0.469)较正常组(1.000±0.367)升高(P<0.01);免疫组化结果显示β-catenin定位表达于食管黏膜上皮细胞,且模型组中的表达较正常组增强。结论：β-catenin蛋白的异常表达及其Ser675位点磷酸化水平的升高与食管癌变的病理变化可能直接相关,可作为食管癌研究的靶点。     

表柔比星诱导的保护性自噬抑制了胃癌MGC803细胞的凋亡

目的：明确表柔比星作用胃癌MGC803细胞后自噬的存在,探讨自噬在表柔比星诱导胃癌细胞凋亡中的作用。方法：表柔比星处理胃癌MGC803细胞,MTT检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白表达。结果：1.2μg/ml的表柔比星作用MGC803细胞24h,细胞凋亡率为（23.56±3.49）%,并且多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）蛋白发生了裂解。与此同时,1.2μg/ml的表柔比星导致了微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）蛋白的提高和细胞自噬体的增多。提示表柔比星同时诱导了凋亡和自噬的发生。与单药表柔比星相比,自噬抑制剂氯喹联合表柔比星明显提高了细胞增殖抑制率[（71.79±4.34）%vs（47.70±3.67%）,P〈0.05]。而且,氯喹联合表柔比星诱导了更明显的MGC803细胞凋亡[（43.98±4.67）%vs（25.09±3.29%）,P〈0.05]。结论：表柔比星诱导的保护性自噬抑制了胃癌MGC803细胞的凋亡。自噬抑制剂联合表柔比星为胃癌提供了新的治疗策略。     

死亡受体Fas在TRAIL 联合三氧化二砷诱导人胃癌细胞凋亡中的作用

目的： 探讨Fas在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)与三氧化二砷 (arsenic trioxide,As2O3)联合诱导人胃癌细胞凋亡过程中的作用。方法：采用体外培养人低分化胃腺癌细胞SGC-7901,分别以Fas正义、反义寡核苷酸转染SGC-7901细胞获得Sense、Antisense细胞。以0.5 μg/ml As2O3+0.2 μg/ml TRAIL分别处理未转染细胞、Sense组细胞以及Antisense组细胞,采用MTT法检测24、48、72 h后细胞增殖情况;倒置显微镜观察联合作用48 h后细胞集落形态;DAPI染色法、流式细胞仪技术检测48 h时细胞凋亡率;Western blot法检测48 h细胞中Fas、FADD以及Parp表达情况。结果：与未转染组和Sense组细胞比较,转染Fas反义寡核苷酸后,降低了TRAIL与As2O3联合抑制细胞增殖、促进凋亡的作用 (P<0.05),48 h时效果最为明显;荧光显微镜下可见死亡细胞明显减少;Western blot结果显示细胞中Fas、FADD表达降低,Parp活化程度降低 (均P<0.05)。结论：Fas在TRAIL与As2O3联合抑制人胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡过程中起重要作用。     

膀胱癌组织Survivin和Livin表达及其临床意义的研究

目的：研究凋亡抑制蛋白Survivin和Livin在膀胱癌组织中的表达及其临床意义。方法：用荧光定量PCR技术检测40例膀胱癌组织、10例正常和癌旁组织中Survivin及Livin基因的表达,用蛋白质印迹法和免疫组化的方法验证,分析两者在膀胱癌组织表达及相关性。结果：荧光定量PCR检测结果显示,Survivin和Livin在正常和癌旁组均无表达,在肿瘤组表达分别为0．01（0．00～0．03）和0．42（0．03～2．23）,与正常组相比差异有统计学意义,P=0．000。两者表达与性别、肿瘤的单发和多发、分级和分期无关,P〉0．05。蛋白质印迹法检测结果显示,膀胱癌组织中Survivin蛋白的定量值为0．40±0．11,Livin蛋白为1．14±0．13,差异有统计学意义,P＝0．001。免疫组化结果显示,癌组织中Survivin表达率为47．5％（19／40）,Livin表达率为65．og（26／40）,差异无统计学意义,P＝0．118。在高分级、浸润性、多发、复发的膀胱癌组织中,Livin比Survivin表达更显著。结论：Livin与Survivin两者有相关性,可作为肿瘤复发有效的预测因子。Livin可能与膀胱癌的浸润性有关。