GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

一起诺如病毒所致急性胃肠炎的病原学调查

目的确定天津市一起水源性急性胃肠炎暴发的致病原。方法采集病例粪便标本,饮用深井水标本,采用荧光定量(Real-time PCR)检测病毒核酸,包括轮状病毒、杯状病毒、星状病毒和肠道腺病毒,阳性标本进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增及测序分析。对粪便标本进行常见肠道致病菌的检测。结果采集粪便标本33份,检出诺如病毒GⅠ型阳性5份(15.2%),诺如病毒GⅡ型阳性12份(36.4%),诺如病毒GⅠ型、GⅡ型均阳性3份(9.1%)。经测序分析1株GⅠ型为GⅠ/14基因型;4株GⅡ型中,2株为GⅡ/8型,1株为GⅡ/6型,1株为GⅡ/2基因型。轮状病毒(A,B,C组)、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒和肠道致病菌检测均为阴性。3份饮水标本中轮状病毒(A,B,C组)、诺如病毒(GⅠ型,GⅡ型)、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒检测均为阴性,常见肠道致病菌检测结果均为阴性。结论本次水源性急性胃肠炎暴发系由诺如病毒GⅠ型/Ⅱ型混合感染引起。     

双重实时荧光定量PCR法检测腹泻患者粪便中诺如病毒(GⅠ+GⅡ)的研究

目的建立同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重实时荧光定量PCR方法,并在临床检验中得到应用。方法本研究采用了双重实时荧光定量PCR法,对诺如病毒GⅠ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了FAM和对诺如病毒GⅡ型病毒的特异性Taqman探针的5’端标记了JOE,从而实现了在同一反应管中对诺如病毒同时进行检测和分型。2015年采集两所哨点医院符合要求的门诊腹泻患者的380份粪便标本运用此方法进行了检测和分型。结果诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型分别在FAM检测通道和JOE检测通道出现相应的荧光扩增曲线;380例符合定义的临床标本中诺如病毒GⅠ型的检出率为3.68%,诺如病毒GⅡ型的检出率为14.74%,诺如病毒GⅠ型和诺如病毒GⅡ型混合感染的检出率为1.58%,全年诺如病毒的总检出率为20.00%。结论双重实时荧光定量PCR法具有重复性好、特异性强、时效性好和简单易操作的特点,具有极大的应用和推广价值。     

宁波市食源性腹泻患者中3种相关病毒的检测与分型

目的了解腹泻患者中食源性相关病毒感染情况与流行特征,为防控病毒性胃肠炎提供依据。方法采集2 129份食源性腹泻患者粪便标本,用实时荧光定量PCR法检测轮状病毒、诺如病毒和甲型肝炎病毒核酸;用NSP4和VP1基因对轮状病毒和诺如病毒流行株分别测序。结果检出轮状病毒核酸52份,阳性率为2.44%,以A组感染为主;检出诺如病毒核酸113份,阳性率为5.31%,以Ⅱ型为主。VP1基因将诺如病毒分为GⅠ.2、GⅡ.6和GⅡ.17 3个型;A组轮状病毒均带NSP4毒力基因。全年均可检出病毒,秋冬季是发病高峰;全人群均可检出,5岁~及其以下年龄组的阳性率高于18岁~年龄组,差异有统计学意义(P0.05)。结论检测发现A组轮状病毒和GⅡ.17型诺如病毒是本市病毒性胃肠炎主要流行病原。病原感染途径多样、带毒者多、人群普遍易感、全年均可检出,本市人群随时有暴发疫情的可能。应加强关注,强化检测,以减少疾病的流行。     

3起GⅡ.17型诺如病毒突发疫情的分子流行病学分析

目的了解3起学校诺如病毒突发疫情的分子流行病学特征,分析诺如病毒疫情的基因型。方法采用实时荧光定量反转录PCR检测标本诺如病毒RNA,阳性标本进行逆转录PCR扩增、电泳、测序和进化树分析。结果 3起学校疫情的17份肛拭子样本中,诺如病毒GⅡ型阳性12份。10株疫情病毒经序列测定和比对,均为GⅡ.17亚型;与来自Gen Bank数据库的GⅡ.17亚型NV参考株相似性均在98%以上;系统发生树上与GⅡ.17基因亚型在一个进化分支上,属于GⅡ.17基因亚型。结论 GⅡ.17型诺如病毒将是今后疾病预防控制机构进行长效监测和防控的重点。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

诺如病毒GⅡ.17型在盘锦地区的检出和鉴定

目的对盘锦市一所中学暴发的一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,鉴定其病原体,并进一步对其基因分型和分析。方法对9份疫情样本采用荧光定量PCR法进行NV GⅠ型和NV GⅡ型检测,对阳性样本进行RNA电泳,挑取条带清晰样本进行产物纯化、测序和基因数据库比对,并用Bio Edit软件构建序列进化树。结果在15份样本中,有7份样品检出NV GⅡ型阳性,选取4份阳性样本进行RT-PCR扩增、测序,将所得数据进行比对后发现为NV GⅡ.17型和NV GⅡ.4型。结论经测序结果证实该疫情为诺如病毒所致,为NV GⅡ.17型和NV GⅡ.4型混合感染,NV GⅡ.17在本地区首次检出,未发现NV GⅡ.4/Sydney变异株。     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

大连市首次在急性胃肠炎暴发疫情标本中检出GⅠ型诺如病毒

目的为确定引起大连市某幼儿园急性胃肠炎暴发疫情的病原体,对患儿粪便和呕吐物标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT-PCR法对12份标本进行GⅠ型和GⅡ型诺如病毒RNA检测。结果 12份患儿标本中,9份GⅠ型诺如病毒核酸阳性。结论首次在大连地区发现由GⅠ型诺如病毒引起的暴发疫情。     

荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估

目的 建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测.方法 构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测.结果 此方法最低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应.针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60％、0.70％,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40％、0.40％,均在5％以下.结论 本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测.     

大连地区在食源性腹泻病例中检出GⅡ.17诺如病毒

目的了解大连地区流行的GⅡ型诺如病毒基因特征及其分布,为预防控制诺如病毒流行提供依据。方法采用荧光定量RT-PCR方法对2015年大连地区哨点医院上送的1 253份食源性腹泻病例粪便标本进行GⅡ型诺如病毒检测,对部分阳性标本进行亚型检测和基因特征分析。结果 1 253份标本中,检出GⅡ诺如病毒20份,阳性率为1.6%,其中8株GⅡ型诺如病毒经ORF1和ORF2连接区扩增和测序,发现5株为GⅡ.17,3株为GⅡ.4。进化树分析发现,本次大连地区检出的GⅡ.17和GⅡ.4分别与2015年韩国株和2015年中国台湾株亲缘关系密切。结论大连地区存在GⅡ.17和GⅡ.4诺如病毒流行,GⅡ.17诺如病毒在大连地区首次被检出。GⅡ.17是否是大连地区的优势流行株,还有待进一步跟踪监测。     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

感染性腹泻疫情检测结果分析

目的明确一起感染性腹泻疫情的病原体和来源。方法通过流行病学调查,查明罹患率。采集疑似感染性腹泻患者肛拭子、生活饮用水、空气和环境涂抹拭子,用实时荧光定量RT-PCR法快速检测轮状病毒A群、B群、C群,诺如病毒GⅠ、GⅡ型和肠道腺病毒三种感染性病毒核酸,肛拭子采用细菌培养检测肠道致病菌,生活饮用水检测菌落总数和大肠菌群。结果共采集病例标本21份,生活饮用水2份,厕所空气样2份,环境标本标本厕所蹲位地面墙面、寝室门把手地面等涂抹拭子20份,病例标本13份、环境标本3份为诺如病毒核酸GⅡ型,其他轮状病毒A群、B群、C群,诺如病毒GⅠ型和肠道腺病毒核酸、肠道致病菌检测为均阴性,饮用水菌落总数和大肠菌群检测均未检出。结论该起疫情为诺如病毒感染所致。暴发的可能传播为人与人接触传播和空气气溶胶传播。实时荧光定量RT-PCR法准确快速的检测出诺如病毒GⅡ型病原体,为疫情的处理提供了及时正确的方向。     

一起养老院急性胃肠炎疫情的病原学分析

目的明确一起养老院感染性腹泻疫情的病原体及其基因型别。方法通过流行病学调查,查明罹患率。对发病老人和部分工作人员进行肛拭子采样,采用细菌培养检测常规肠道致病菌,应用胶体金法检测轮状病毒,采用实时荧光定量RT-PCR进行诺如病毒核酸检测,应用常规RT-PCR扩增部分NoV阳性株衣壳蛋白的N/S区,PCR产物纯化回收、测序,利用Clustal X、MEGA4.1软件分析其基因序列。结果 21份病例及工作人员肛拭子样本,肠道致病菌和轮状病毒均为阴性,19份样本诺如病毒核酸阳性,毒株排除重组株的可能,测序样本均属GⅡ.4型诺如病毒,其与Hu/NSW696T/2006/AUS（EF684915）的同源性高达99%。结论经诺如病毒核酸序列分析,该疫情是一起由GⅡ.4-2006b型诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发。     

一起GⅡ.17型诺如病毒引起的聚集性腹泻疫情报告

目的调查一起GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情。方法收集该起疫情患者粪便标本,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)检测诺如病毒核酸,阳性标本进行核苷酸序列测定并进行同源性分析。结果该起感染性腹泻疫情共36例患者,采集13例临床表现典型患者的粪便标本进行检测,诺如病毒核酸阳性8份,阳性率为61.54%。将5株测序成功序列进行比对,确定诺如病毒基因型为GⅡ.17型。与2014年中国香港分离的诺如病毒GⅡ.17型参考株Norovirus HK GⅡ.17 2014在同一个进化分支上,核苷酸序列同源性为99.3%~99.7%。结论本次疫情是由GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情,应加强对此毒株的监测工作。     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

RT-LAMP法对Ⅱ型诺如病毒的检测

目的在本实验室建立适合于基层使用的Ⅱ型诺如病毒快速检测方法 RT-LAMP法,并将其应用于临床病毒性腹泻的检测,为了解诺如病毒导致的病毒性腹泻在南京市的流行状况提供方法和数据。方法用实验室保存的诺如病毒阳性标本进行方法学建立,并收集南京地区某医院2011年秋冬因腹泻就诊并临床诊断为病毒性腹泻的57例成年人患者的粪便进行Ⅱ型诺如病毒检测,包括荧光定量PCR法及基于环的等温扩增(LAMP)法,并对检测为阳性标本核酸进行测序分析。结果所建立的Ⅱ型诺如病毒RT-LAMP法和荧光定量检测法均可以检测到稀释到10 000倍的阳性标本,即两种方法具有相同的敏感度。对于诺如病毒I型、甲肝病毒及乙肝病毒没有扩增,即对诺如病毒Ⅱ型的扩增具有特异性。57例临床粪便标本,荧光定量PCR法与RT-LAMP法均检测到6例Ⅱ型诺如病毒阳性病例,两种方法符合率为100%,经测序分析,5例为诺如病毒GⅡ.4亚型,1例为诺如病毒GⅡ.6亚型。5例GⅡ.4亚型分别来源于4个不同的流行株,3个国家和地区,巴西、俄罗斯和北京。结论南京地区2011年诺如病毒腹泻病例以GⅡ.4亚型为主要感染亚型,也有GⅡ.6亚型。结果提示该病毒传播范围的广泛性和流行病学防控的艰巨性。荧光定量PCR与RT-LAMP法都可以快速进行病原检测,但RT-LAMP法因其方法简易、不需要特殊仪器、结果直接肉眼观察而更适合基层使用。     

一起GI、GⅡ型诺如病毒混合感染疫情的病原鉴定及基因特征分析

目的 对2018年湖州一起赴泰国旅游团游客中发生的急性胃肠炎疫情进行诺如病毒核酸检测及基因分型。方法 采用real-time RT-PCR方法对送检的疫情标本进行GI和GⅡ型诺如病毒核酸检测。采用RT-PCR方法对阳性标本进行RdRp区和VP1区部分片段的扩增和测序。综合系统进化分析和重组分析结果判定病毒基因型别。结果 送检的8例病例的粪便标本均为诺如病毒核酸阳性。其中5份标本为GI、GⅡ诺如病毒核酸同时阳性,3份标本为GⅡ诺如病毒核酸阳性。8份阳性标本有5份测序成功。系统进化分析结果显示本次疫情检出的GⅡ型诺如病毒为GⅡ. P17-GⅡ. 17基因型,GI型诺如病毒为GI. P4-GI. 5重组株。结论 该起赴泰国旅游团游客中发生的急性胃肠炎疫情是由GⅡ. P17-GⅡ. 17和GI. P4-GI. 5基因型诺如病毒混合感染所致,推测感染来源来自泰国曼谷旅行期间。     

2012-2019年北京市昌平区散发腹泻病例四种病毒监测结果分析

目的对北京市昌平区2012-2019年散发腹泻病例4种病毒监测结果进行分析,了解其流行特征。方法采集此期间辖区2家哨点医院肠道门诊散发腹泻病例便样本960份,提取核酸后用实时荧光RT-PCR方法检测A组轮状病毒、GⅠ/GⅡ组诺如病毒、星状病毒和肠道腺病毒,用描述性流行病学方法从时间、性别和年龄分布分析其流行特征。结果 960份便样本的病毒总检出率为32.29%(310/960),GⅠ/GⅡ组诺如病毒、A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒检出率分别为18.96%(182/960)、10.63%(102/960)、1.98%(19/960)和0.73%(7/960);在不同年份、性别和年龄组中,均为GⅠ/GⅡ组诺如病毒检出率最高,A组轮状病毒次之;GⅠ/GⅡ组诺如病毒春季检出率最高(28.33%,68/240),冬季次之(22.50%,54/240);A组轮状病毒冬季检出率最高(25.42%,61/240),春季次之(9.58%,23/240)。结论 GⅠ/GⅡ组诺如病毒和A组轮状病毒是北京市昌平区冬春季散发腹泻病例的主要病原。