siRNA沉默c-FLIP基因表达与表柔比星联合应用对MCF-7细胞凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默c-FLIP基因表达联合应用表柔比星对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响。方法 体外化学合成c-FLIP序列特异性双链小干扰RNA(siRNA),转染MCF-7细胞,应用Western blot方法检测c-FLIP蛋白的抑制水平、检测Caspase-8的表达差异;应用流式细胞术检测细胞凋亡的变化及表柔比星与c-FLIP-siRNA联合应用对细胞凋亡的影响。结果 c-FLIP-siRNA能有效地抑制c-FLIP蛋白的表达(P＜0.05),促进细胞的凋亡(P＜0.05)。c-FLIP-siRNA和表柔比星联合应用较单用表柔比星能明显促进MCF-7细胞的凋亡(P＜0.05)。结论 c-FLIP-siRNA能够促进MCF-7细胞的凋亡,并且能够增强表柔比星的抗肿瘤作用。     

纳豆脂肽诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制研究

目的:初步探讨纳豆脂肽诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的可能作用机制。方法:取对数生长期的MCF-7细胞,实验设4组,分别加入不同浓度(0、1、2、4μg/mL)的纳豆脂肽,于37℃培养箱中继续培养12 h后,收集细胞,采用流式细胞术检测纳豆脂肽对MCF-7细胞凋亡的影响;单细胞凝胶电泳检测纳豆脂肽对MCF-7细胞DNA损伤的影响;Western blot法检测纳豆脂肽对雌激素受体ERα和ERβ蛋白表达的影响。结果:与对照组比较,各浓度纳豆脂肽处理组均可诱导MCF-7细胞凋亡(P均<0.05);Olive尾矩和尾部DNA含量均明显增加(P<0.05或P<0.01),且4μg/mL纳豆脂肽组尾长亦明显增加(P<0.01)。纳豆脂肽浓度为4μg/mL时,ERα表达水平明显下降,ERβ表达水平明显上升,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论:纳豆脂肽可能是通过影响MCF-7细胞内雌激素受体表达水平和引起DNA损伤来诱导MCF-7细胞发生凋亡。     

癌源性外泌体对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的 探究乳腺癌细胞来源的外泌体对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。方法 使用超速离心法对人乳腺癌MCF-7细胞培养液中的外泌体进行提取和纯化,通过透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小,Western blot实验鉴定外泌体的标志蛋白。以外泌体与MCF-7细胞共培养48 h后的细胞为实验组,以未处理的MCF-7细胞为对照组。用MTT法、克隆形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验、流式细胞术实验和Western blot实验检测乳腺癌源性外泌体对MCF-7细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、凋亡及上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力的影响。结果 透射电子显微镜下外泌体的形状为典型的杯托状或者凹的半球状结构,直径40~110 nm;Western blot实验结果显示外泌体标志性蛋白CD9及CD81均明显表达;MTT和克隆形成实验结果显示,实验组细胞增殖及克隆形成能力较对照组明显增强(P＜0.05);划痕实验和侵袭实验结果显示,与对照组相比,实验组细胞迁移及侵袭能力明显增强(P＜0.001);流式细胞术分析显示,在外泌体刺激的乳腺癌细胞中,凋亡细胞的百分比显著低于对照组(P＜0.05);Western blot结果显示,乳腺癌来源的外泌体增加了N-cadherin和Vimentin的表达,降低了E-cadherin表达,促进了乳腺癌EMT过程(P＜0.05)。结论 乳腺癌细胞来源的外泌体能增强肿瘤细胞的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,促进乳腺癌EMT过程,并抑制肿瘤细胞凋亡。表明肿瘤来源外泌体可能作为细胞间信号转导的介质,在促进肿瘤生长和转移的信息传递方面发挥重要作用。     

西妥昔单抗对肺腺癌A549细胞株辐射增敏作用的研究

目的探讨西妥昔单抗(Cetuximab, C225)对人肺腺癌A549细胞株的辐射增敏作用及其机制。方法 体外培养人肺腺癌A549细胞株, 经不同浓度的C225作用后, 使用CCK-8法测定细胞增殖抑制率, 计算出C225的半数抑制浓度(IC₅₀), 并将IC₅₀的1/5作为后续实验的浓度。采用克隆形成方法观察C225对细胞辐射敏感性的影响, 按多靶单击模型拟合细胞存活曲线, 计算辐射增敏比(SER)。流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞周期情况。结果 C225均抑制了细胞的增殖, 并呈现明显的量-效关系, 其IC₅₀为18.24μg/mL。与单独照射组相比, 加药照射组的SF₂、D₀、D_q均下降(P＜0.05), SER_D0为1.40。C225联合X线照射明显增强了辐射诱导的细胞凋亡(P＜0.05)。C225使细胞阻滞于G₀/G₁期(P＜0.05), 单独照射组G₂/M期细胞比例增加(P＜0.05), C225+照射组同时出现G₀/G₁、G₂/M期细胞阻滞(P＜0.05);与对照组相比, C225组、单独照射组以及C225+照射组S期细胞比例均下降(P＜0.05)。结论 C225对A549细胞株具有辐射增敏作用, 其机制可能与C225抑制细胞的生长增殖和受照射后亚致死性损伤的修复, 增加细胞凋亡以及诱导细胞G₀/G₁期阻滞有关。     

ON123300对ER阳性人乳腺癌MCF-7细胞的影响及机制研究

目的 初步探讨新型多靶点激酶抑制剂ON123300对ER阳性、HER2阴性的人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期、凋亡的影响及机制。方法 取处于对数生长期的MCF-7细胞,分为DMSO对照组、Palbocilib处理组及ON123300处理组,给药干预48 h后观察细胞生长状态,CCK-8法检测各组MCF-7细胞增殖抑制情况,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞周期和凋亡,Western blot检测cyclinD1、CDK4、pRb1、survivin和PI3K的表达。结果 光学显微镜下可见DMSO对照组MCF-7细胞贴壁良好,增殖迅速;Palbocilib处理组的MCF-7细胞增殖出现轻微抑制和少量细胞脱落,未见细胞形态改变;ON123300处理组MCF-7细胞增殖明显受抑制,数量明显减少,细胞形态改变,出现脱落现象。细胞抑制率随药物浓度增加而增加,呈现剂量依赖效应。ON123300处理组的MCF-7细胞明显阻滞在G₁/S期,并伴有细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。ON123300处理组cyclinD1、CDK4、pRb1、survivin、PI3K的蛋白表达量随药物浓度增高均逐渐降低,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 ON123300对人乳腺癌细胞MCF-7有显著的增殖抑制、促进细胞周期阻滞和凋亡的作用,其机制可能与survivin/cyclinD1/CDK4/Rb1/和PI3K信号通路的抑制相关。     

微小RNA-152对乳腺癌细胞增殖及阿霉素敏感性影响的实验研究

目的 探讨微小RNA-152（miR-152）对乳腺癌细胞阿霉素敏感性的影响及其作用机制。方法 采用实时定量PCR（QPCR）检测人乳腺上皮细胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7细胞及阿霉素耐药株MCF-7／ADR细胞中的miR-152水平,分别向MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞转染miR-152模拟物 mimics（过表达组）和阴性对照NC（阴性对照组）,以未行转染为空白对照组。采用QPCR检测转染后MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞中miR-152的表达情况,采用MTT法检测不同浓度阿霉素（10、50、100、200和500 ng/ml）处理后各组的增殖情况,流式细胞术检测转染后各组的凋亡率,Western blotting检测磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α基因（PIK3CA）的蛋白水平,双荧光素酶报告实验评价miR-152对PIK3CA的靶向调控作用。结果 QPCR实验结果 表明MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞中的miR-152水平均低于HBL-100细胞,且MCF-7／ADR细胞的miR-152水平均低于MCF-7细胞,差异有统计学意义（P＜0.05）;过表达组转染后的miR-152水平均高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）。与其余两组比较,过表达组的存活率降低而凋亡率升高,且PIK3CA蛋白水平也降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-152可抑制野生型PIK3CA 3’ UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型PIK3CA 3’UTR的荧光素酶活性无影响。结论 miR-152表达在乳腺癌细胞中降低,且与阿霉素耐药有关,参与乳腺癌细胞的增殖和凋亡过程,在逆转乳腺癌耐药中发挥重要作用,具有一定价值。     

DEHP对3β-羟类固醇脱氢酶表达水平的影响

目的：研究邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）对MCF-7细胞中3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）表达的影响。方法：采用不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L） DEHP对体外培养的MCF-7细胞分别染毒12、24和48 h,或同一浓度（0.8 mmol/L）染毒不同时间（3、6、12、24、48 h）后,荧光定量PCR检测各组MCF-7细胞3β-HSD mRNA表达水平,Western blot检测3β-HSD蛋白表达水平。结果：DEHP 0.1~0.8 mmol/L分别染毒细胞12~48 h,3β-HSD mRNA表达水平均较对照组升高,差异有统计学意义（P < 0.01）;DEHP 0.05 mmol/L染毒细胞48 h,3β-HSD mRNA表达水平比对照组升高,差异有统计学意义（P < 0.05）。DEHP 0.8 mmol/L染毒细胞6~48 h,3β-HSD mRNA表达水平均较对照组升高,差异有统计学意义（P < 0.01）。DEHP 0.2~0.8 mmol/L染毒细胞24 h,3β-HSD蛋白表达水平较对照组升高,差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。结论：DEHP可引起3β-HSD mRNA和蛋白表达水平升高,推测DEHP可能通过影响类固醇激素合成过程中3β-HSD表达水平的变化,从而产生生殖毒性作用。     

StAR基因高表达对DEHP致MCF-7细胞凋亡作用的影响

目的：构建类固醇合成急性调节蛋白（StAR）基因高表达载体,建立StAR基因高表达细胞,研究StAR基因高表达对邻苯二甲酸二-（2-乙基己）酯（DEHP）毒性作用的影响。方法：根据GenBank提供的StAR基因cDNA序列设计引物,PCR扩增StAR基因并将其克隆到慢病毒载体中,构建StAR基因高表达MCF-7细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot鉴定细胞。用不同剂量DEHP染毒MCF-7细胞和StAR基因高表达MCF-7细胞24 h,检测细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8在mRNA和蛋白表达水平的变化。结果：基因测序证明构建的StAR基因高表达载体序列正确,荧光定量PCR检测StAR基因转染细胞比正常MCF-7细胞StAR mRNA表达水平升高591.9倍（P < 0.01）,Western blot实验结果显示,StAR基因转染细胞比正常MCF-7细胞StAR蛋白表达水平升高190%（P < 0.01）。不同剂量DEHP染毒StAR基因高表达细胞后,荧光定量PCR结果显示,StAR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8 mRNA表达水平较对照组（0 mmol/L DEHP）显著升高,差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。Western blot实验显示,StAR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平比对照组显著升高,差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。结论：本实验成功构建了StAR基因高表达细胞,DEHP处理后StAR基因高表达细胞的凋亡相关基因表达水平较MCF-7细胞升高,提示StAR基因具有促进DEHP致细胞凋亡作用。     

MiR-122促进原发性肝细胞癌Huh-7细胞凋亡

目的 探讨miR-122对原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞性状的影响。方法 HepG2细胞、Huh-7细胞分别转染miR-122、anti-miR-122,转染Mock组作为阴性对照,分别于转染后24 h、48 h用流式细胞法、TUNEL法检测细胞凋亡及细胞周期。结果 转染后24 h、48 h,转染miR-122、Mock的HepG2细胞两组间细胞凋亡率均无统计学意义(P＞0.05),而在转染后48 h,与Mock组Huh-7细胞相比,转染anti-miR-122的Huh-7细胞凋亡率明显降低(P＜0.05);转染后24 h、48 h,转染miR-122、Mock的HepG₂细胞,各细胞周期组份均无统计学意义(P＞0.05),但于转染后48 h,转染anti-miR-122的Huh-7细胞可见G₀-G₁期细胞明显多于Mock组,S期、G₂-M期细胞则显著少于Mock组(P＜0.05)。结论 miR-122表达水平的下降能够抑制某些HCC细胞如Huh7细胞凋亡,miR-122可能作为一种内源性凋亡调控因子,在肝脏组织中发挥抗肿瘤作用。     

过表达SOX7对胆囊癌GBC-SD细胞增殖生物学特性的影响及其机制研究

目的 探讨过表达SOX7(Sex determining region Y-box 7)基因对胆囊癌GBC-SD细胞株增殖、凋亡的影响及其可能涉及的细胞信号通路。方法 用特异性的重组质粒pcDNA3.1-SOX7作为实验组转染GBC-SD细胞建立稳定过表达SOX7基因的细胞,空载体pc-DNA3.1-mock作为对照组。采用Edu细胞荧光染色法检测过表达SOX7基因对GBC-SD细胞增殖的影响,同时采用Hoechst 33342细胞染色法检测GBC-SD细胞的凋亡。Western blot检测相关信号通路蛋白的表达。结果 实验组中SOX7 mRNA的相对表达量为(353.0±28.1)%,相对于对照组(100.0±2.3)%表达明显增加,差异具有统计学意义(P＜0.05)。对照组细胞在450 nm吸光度值为(4.6±0.4),较实验组(2.4±0.2)明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Edu免疫荧光染色结果表明,对照组细胞增殖比例(33.3±3.4)%高于实验组(12.2±4.2)%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Hoechst 33342细胞凋亡荧光染色结果表明,对照组细胞凋亡比例(5.2±1.3)%较实验组(10.2±2.4)%降低,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western blot实验结果表明,对照组PTEN蛋白的相对表达量为(0.2±0.02),而实验组的相对表达量为(0.7±0.04),对照组磷酸化Akt的相对表达量为(0.8±0.03),而实验组为(0.4±0.02),差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 过表达SOX7基因能显著抑制胆囊癌细胞GBC-SD的增殖,导致其凋亡增加。PTEN/Akt信号通路的激活可能与之有关。     

致康胶囊对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨致康胶囊对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖及凋亡的影响。方法:采用0（对照组）、0.5、1.0、2.0 mg/ml 致康胶囊培养液分别处理乳腺癌细胞MCF-7,分别于培养后24、48和72 h计数MCF-7细胞数。采用MTT法检测致康胶囊对乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期;PI 单染流式细胞仪检测致康胶囊对MCF-7细胞凋亡的影响。结果:不同浓度致康胶囊能有效地抑制MCF-7细胞增殖,且随浓度增加和作用时间延长,细胞的增殖抑制率增加。0.5、1.0、2.0 mg/ml的致康胶囊作用MCF-7细胞72 h后,G0/G1期细胞所占细胞周期的比例分别为19.33%±10.38%、14.12%±5.37%和26.84%±2.13%;而对照组G0/G1期比例为51.83%±1.90%。0.5、1.0、2.0 mg/ml致康胶囊处理48 h后细胞的凋亡率分别为2.09%±0.74%、3.84%±0.78%和 5.35%±0.83%。结论:致康胶囊能抑制MCF-7细胞的体外增殖,且抑制作用表现为时效和量效关系;并能通过阻滞细胞周期于G2/M期,促进乳腺癌细胞凋亡。     

4-氨基吡啶与多西紫杉醇抗人乳腺癌细胞MCF-7 作用及相互关系探讨*

目的:通过研究钾离子通道阻断剂4- 氨基吡啶（4-AP ）对肿瘤化疗药物多西紫杉醇（docetaxel ,DOC ）的抗人乳腺癌细胞MCF-7 作用的影响,探讨4-AP 能否增强DOC 的作用。方法:用MTT 比色法分析DOC 、4-AP 以及两药联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7 增殖的影响;用流式细胞术PI 单染法及Annexin V-FITC/PI双染法检测上述两种药物对人乳腺癌细胞MCF-7 的细胞周期及早期凋亡的影响。结果:DOC 能明显抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖,并呈剂量和时间依赖性。4-AP 对MCF-7 细胞增殖亦具有一定的抑制作用,在用药后24h、48h 及72h 的抑制率分别为11.9%±1.7% 、42.1%±3.2% 、44.2%±1.6% 。且5mmol/L 4-AP 可使DOC 的作用增强,使25μ mol/L DOC 对人乳腺癌细胞株MCF-7 最大杀伤作用时间从72h 提前至24h。5 μ mol/L DOC 能够使MCF-7 G2/M期细胞比率明显增加（53.58%±1.44% 与对照组8.83%±0.44% 相比,P<0.01）,使G0/G1 期细胞减少（11.48%±0.14% 与对照组63.89%±0.98% 相比,P<0.01）,说明DOC 主要在G2/M期阻滞MCF-7 细胞的增殖。5mmol/L 4-AP 作用于MCF-7 使其G0/G1 期细胞比率增加,G2/M期细胞明显减少,甚至消失（0.42%±0.17% 与对照组8.83%±0.44% 相比,P<0.05）。 而两药联用可见4-AP 使MCF-7 G2/M期细胞比率有所减少,而G0/G1 期细胞比率有所增加。DOC 单独作用于人乳腺癌细胞株MCF-7 细胞24h 后,能明显增加晚期凋亡和死亡率（由6.97%±0.75% 增加到20.77%±0.75% ,P<0.05）;而两药联合时,与对照组相比,早期凋亡比例由4.60%±0.91% 增加到12.20%±0.82%（P<0.05）,晚期凋亡和死亡细胞比例由6.97%±0.75% 增加到58.42%±0.31%（P<0.05）,提示4-AP（5mmol/L ）能明显增加DOC 诱导的MCF-7 早期凋亡。结论:DOC 和4-AP 分别在G2/M期和G0/G1 期抑制MCF-7 细胞增殖,4-AP 通过促进DOC 诱导细胞凋亡发挥抑制MCF-7 细胞增殖的作用。      

毛蚶抗癌蛋白对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用

目的:从毛蚶软体部位中分离出具有一定抗癌活性的毛蚶蛋白组分,研究其对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法:以新鲜毛蚶软体部分为原材料,分离获得毛蚶抗癌蛋白组分(命名为NS);倒置相差显微镜观察不同浓度(50、100、200、400μg/mL)NS组分对MCF-7癌细胞生长的影响,将200μg/mL NS组分作用MCF-7细胞不同时间(12、24、48 h)后,Giemsa染色观察癌细胞及核形态的变化,流式细胞术检测NS组分对MCF-7细胞周期及细胞凋亡的影响,Western blot检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:与阴性对照组比较,各浓度NS组分对人乳腺癌MCF-7细胞生长均具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01);倒置相差显微镜下可见200μg/mL NS组分作用MCF-7细胞12 h后,部分细胞收缩变圆、脱落,24、48 h后细胞脱落现象更加明显;Giemsa染色发现,NS组分处理12 h后细胞出现有丝分裂相增加,继而出现多核或核碎裂等现象;流式细胞术检测发现NS组分主要引起细胞G2-M期阻滞;NS处理组凋亡率均较对照组明显升高(P均<0.01),且随着药物作用时间的延长,细胞凋亡比例逐渐增加。Western blot检测发现NS组分作用MCF-7细胞后p53及procaspase-3蛋白表达量均上调。结论:毛蚶抗癌蛋白NS组分体外对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒作用主要通过引起细胞发生G2-M期阻滞、诱导细胞凋亡实现的,期间伴随p53及procaspase-3蛋白表达上调。     

异烟肼通过ROS/Caspase-3信号通路诱导L-02细胞凋亡及槲皮素的保护作用

目的：探讨ROS/Caspase-3信号通路在异烟肼（INH）诱导人正常肝细胞（L-02细胞）凋亡中的作用及槲皮素的保护效应。方法：将L-02细胞随机分为对照组、INH组（10 mmol/L INH）、25 μmol/L槲皮素组（10 mmol/L INH和25 μmol/L槲皮素）、50 μmol/L槲皮素组（10 mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素）。各组均处理24 h后,应用MTT法检测L-02细胞存活率,分光光度法检测细胞上清液中LDH活性,Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡率;制备L-02细胞线粒体,利用DCFH-DA和Rho-123荧光探针检测活性氧（ROS）水平及线粒体膜电位（△Ψm）,应用Western blot检测Caspase-3蛋白的表达。结果：与对照组比较,INH组细胞存活率显著降低（P < 0.01）,与INH组比较,50 μmol/L槲皮素处理组细胞存活率明显增加（P < 0.01）;INH组细胞LDH活性、细胞凋亡率、线粒体ROS水平较对照组显著升高（P < 0.01）,25和50 μmol/L槲皮素组细胞LDH活力、细胞凋亡率、线粒体ROS水平较INH组明显降低（P < 0.05或P < 0.01）,且50 μmol/L槲皮素组作用更显著;INH组细胞线粒体△Ψm较对照组显著降低（P < 0.01）,25和50 μmol/L槲皮素组细胞线粒体△Ψm较INH组明显升高（P < 0.05或P < 0.01）,50 μmol/L槲皮素组的作用更加明显;与对照组比较,INH组细胞Caspase-3蛋白表达显著增加（P < 0.01）,与INH组比较,25和50 μmol/L槲皮素组细胞Caspase-3蛋白表达明显减少（P < 0.05或P < 0.01）,且50 μmol/L槲皮素组作用更明显。结论：INH可以诱导L-02细胞发生凋亡,ROS/Caspase-3信号通路参与了其凋亡的过程;槲皮素对INH诱导的细胞凋亡具有保护效应,机制可能与其减少ROS释放,抑制ROS/Caspase-3信号通路有关。     

铁超载对非酒精性脂肪肝病HepG2细胞模型中Hepcidin和 Fpn-1的影响

目的：探讨铁超载对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）HepG2细胞模型中铁代谢指标Hepcidin和Fpn-1的影响。方法：采用四甲基噻唑蓝（MTT）法分别检测浓度均为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L的油酸（OA）和硫酸亚铁铵[Fe（NH₄）₂·（SO₄）₂·6H₂O,下称Fe]对HepG2细胞活力的影响,确定OA和Fe联合给药浓度。采用0.5 mmol/L OA联合不同浓度（0、0.125、0.25、0.5 mmol/L）的Fe诱导HepG2细胞建立NAFLD 细胞模型,并设阴性对照组（未经药物处理的细胞）和0.5 mmol/L Fe单独处理组为对照,测定细胞内甘油三酯（TG）和铁蛋白（Fn）含量。采用实时荧光定量PCR（qPCR）法和Western blot法测定细胞中铁调素（Hepcidin）、膜铁转运蛋白（Fpn-1） mRNA和蛋白的表达。结果：与阴性对照组相比,0.5 mmol/L的OA,0.125、0.25、0.5 mmol/L的Fe对细胞存活率无明显影响（P > 0.05）。与对照组和0.5 mmol/L OA组相比,0.5 mmol/L OA与各浓度Fe联合作用时,随着铁浓度增大,细胞内的TG和铁蛋白（Fn）含量逐渐增加,差异具有统计学意义（P < 0.05）。与对照组和0.5 mmol/L OA组相比,0.5 mmol/L OA联合不同浓度Fe处理后Hepcidin的mRNA和蛋白表达均明显下降（P < 0.05）;0.5 mmol/L OA联合不同浓度Fe处理后Fpn-1 mRNA的表达均明显上调（P < 0.05）;与对照组相比,0.5 mmol/L Fe组、0.5 mmol/L OA联合0.25、0.5 mmol/L Fe组Fpn-1蛋白水平明显降低（P < 0.05）。结论：0.5 mmol/L OA联合不同浓度Fe处理时可引起细胞发生脂质沉积,使体内正常铁代谢发生紊乱,Hepcidin的mRNA和蛋白表达均明显下降,Fpn-1 mRNA表达上调而蛋白表达下降,进一步加重NAFLD的进展。     

乳腺癌多药耐药DEDD作用及机制研究

目的 死亡效应结构域DNA结合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)可抑制乳腺癌的生长和转移,但在乳腺癌多药耐药中的作用尚不明确.本研究将探讨DEDD在人乳腺癌多药耐药中的作用及机制.方法 通过转染DEDD-shRNA建立稳定敲低DEDD表达的MCF-7人乳腺癌细胞株,MTS实验检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7 WT(Wild type,野生型)、MCF-7 control shRNA和MCF-7 DEDD-shRNA细胞活力的影响,Annexin-V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染后流式细胞仪检测细胞凋亡.蛋白质印迹法检测乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)在药物干预后的蛋白表达水平.结果 多柔比星干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=89.49,P＜0.001)、不同时间(F=50.81,P＜0.001)组间比较差异有统计学意义.多柔比星干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50分别为(0.97±0.15)和(0.62±0.09) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(0.46±0.05)和(0.26±0.03) μmol/L和MCF-7 control shRNA细胞(0.39±0.05)和(0.25±0.03)μmol/L,P＜0.001.紫杉醇干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=15.94,P＜0.001)、不同时间组间(F=129.70,P＜0.001)比较差异有统计学意义.紫杉醇干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50为(16.74±2.26)和(9.88±1.47) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(13.39±1.44)和(7.69±0.92) μmol/L(P=0.001)和MCF-7 control shRNA细胞(12.58±1.15)和(7.17±1.12) μmol/L(P＜0.001).多柔比星干预后24 h后流式细胞凋亡结果显示,不同处理(F=131.46,P＜0.001)、不同浓度组间(F=160.95,P＜0.001)比较差异有统计学意义.正常培养状态下,MCF-7 control shRNA细胞和MCF-7 DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(14.32±1.47)％和(11.58±1.63)％,而给予0.5μmol/L和1 μmol/L多柔比星作用24 h后,M[CF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(21.62±1.97)％和(24.39±2.36)％,明显低于MCF-7 control shRNA细的(36.26±1.87)％和(38.23±1.46)％,P＜0.001.同样,紫杉醇干预后24 h,不同处理(F=124.81,P＜0.001)、不同浓度组问(F=172.56,P＜0.001)细胞凋亡率比较差异有统计学意义.给予9.37和18.74 μmol/L紫杉醇作用24 h后,MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(30.26±1.63)％和(32.18±2.16)％,明显低于MCF-7 control shRNA组的(53.84±2.17)％和(58.27±2.16)％,P＜0.001.多柔比星作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=14.67,P＜0.001)、不同时间(F=6.39,P=0.006)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予0.5 μmol/L多柔比星作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.87±0.04、1.06±0.02和5.25±0.18.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.多柔比星作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为1.06±0.01、0.97±0.04和2.98±0.13.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平出现回落,但仍显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.同样,紫杉醇作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=7.26,P=0.004)、不同时间(F=8.32,P=0.002)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予9.37 μmol/L紫杉醇作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.81±0.05、2.25±0.10和1.78±0.14.其中MCF-7 control shRNA组细胞BCRP表达水平高于MCF-7 WT (P＜0.001)和MCF-7 DEDD-shRNA (P=0.002)组.而紫杉醇作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.73±0.04、1.73±0.05和3.12±0.12,MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平继续增高,且显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.结论 敲低DEDD表达可增强乳腺癌细胞的抗肿瘤药耐药性,BCRP的表达增加可能是低表达DEDD乳腺癌细胞多药耐药的机制之一.     

LncRNA NBAT1通过调控miR-3664-5p/Caspase 9分子轴对人乳腺癌细胞增殖的影响

目的 探究lncRNA NBAT1通过调控miR-3664-5p/Caspase 9分子轴对人乳腺癌细胞增殖的影响。方法 通过在线生物软件分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库比较lncRNA NBAT1在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达量。RT-qPCR方法比较正常细胞株MCF-10A和乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-453中lncRNA NBAT1的表达水平。生物信息学预测lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者之间关系,并进一步通过荧光素酶报告系统进行验证;lncRNA NBAT1过表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞株,RT-qPCR检测转染后lncRNA NBAT1的表达,qPCR检测miR-3664-5的表达,Western blot检测Caspase 9的蛋白表达水平;CCK-8和克隆形成实验检测细胞的增殖能力;同时将lncRNA NBAT1过表达载体和mimics miR-3664-5p转染MCF-7细胞,观察mimics miR-3664-5p对lncRNA NBAT1抑制细胞增殖能力产生的缓解效应。结果 TCGA数据库分析发现,lncRNA NBAT1在乳腺癌组织中的表达量显著低于正常组织(P＜0.001);qPCR检测发现lncRNA NBAT1在正常细胞株MCF-10A细胞中表达量最高(P＜0.001),MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中表达量比MCF-10A细胞低(P＜0.001),MCF-7细胞表达量最低(P＜0.001);通过生物信息学预测lncRNA NBAT1可以吸附miR-3664-5p,Caspase 9是miR-3664-5p的靶基因,并进一步通过荧光素酶报告系统进行验证;lncRNA NBAT1过表达载体转染乳腺癌细胞株MCF-7,qRT-PCR检测发现pc-NBAT1组比pc-NC组LncRNA NBAT1的表达增高(P＜0.001),miR-3664-5的表达降低(P＜0.001),Western blot检测发现pc-NBAT1组比pc-NC组Caspase 9的表达增高(P＜0.001)。CCK-8和克隆形成实验发现pc-NBAT1组比pc-NC组细胞的增殖能力降低(P＜0.001);同时将lncRNA NBAT1过表达载体和mimics miR-3664-5p转染MCF-7细胞,发现mimics miR-3664-5p能够对lncRNA NBAT1抑制细胞增殖能力产生缓解效应(P＜0.001)。结论 lncRNA NBAT1通过调控miR-3664-5p/Caspase 9分子轴抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌治疗提供新的潜在靶点。     

EZH2过表达在MCF-7获得性耐药中的作用

目的 探讨EZH2过表达在MCF-7/ADR获得性耐药中的作用。方法 应用荧光定量PCR技术和Western blot技术分别检测EZH2在MCF-7和MCF-7/ADR中的mRNA和蛋白的相对表达量。将带有报告基因eGFP的EZH2 shRNA、EZH2 shRNA-scramble质粒分别转染MCF-7/ADR细胞后,用G418筛选获得稳转细胞株,应用荧光定量PCR技术验证EZH2 shRNA组EZH2 mRNA表达是否被抑制。采用WST-1方法检测EZH2 shRNA、EZH2 shRNA-scramble和阴性对照组细胞对阿霉素敏感性的变化情况。结果 MCF-7/ADR中EZH2 mRNA相对表达量约为MCF-7的2.52±1.523倍,MCF-7/ADR中EZH2蛋白相对表达量约为MCF-7的1.58±0.58倍,差异均有统计学意义(P＜0.05)。EZH2 shRNA组稳转的细胞株EZH2 mRNA的抑制率约为84%(P＜0.05),加入阿霉素后细胞增殖能力约下降25%(P＜0.05),而EZH2 shRNA-scramble组和阴性对照组加入阿霉素后细胞增殖能力无明显变化。结论 在MCF-7/ADR细胞中EZH2 mRNA和蛋白的相对表达量较MCF-7细胞高。沉默EZH2的表达有可能逆转MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。     

磁性纳米颗粒载ABCG2-siRNA逆转乳腺癌细胞对阿霉素耐药性的研究

目的：研究抑制乳腺癌耐药蛋白（ABCG2）表达对乳腺癌细胞耐药性的逆转作用,为乳腺癌基因靶向治疗提供新思路。方法：通过透射电镜和纳米粒度电位分析仪对磁性纳米颗粒（polyMAG）的粒径、电位进行表征,利用凝胶电泳阻滞实验检测polyMAG 与siRNA的结合情况,并用polyMAG携载不同浓度（5、10、20、50、100 nmol/L）ABCG2-siRNA,将其转染入乳腺癌细胞耐药株（MCF-7/ADR）后,采用CCK-8检测siRNA转染后细胞的存活率,荧光定量PCR和Western blotting分别检测ABCG2 mRNA和蛋白表达水平,Calcein-AM/PI染色观察细胞凋亡。结果：polyMAG粒径约100 nm,呈正电荷,表面电位29.6 mV。当polyMAG与ABCG2-siRNA的比为1：1和1：2时ABCG2-siRNA可完全结合。当20~100 nmol/L polyMAG-siRNA干扰ABCG2表达后,细胞存活率较未转染组明显降低（P < 0.05）。20 nmol/L polyMAG-siRNA转染组ABCG2 mRNA表达显著下调,约为未转染组的1/8（P < 0.05）,且凋亡细胞较其他组明显增多;50 nmol/L polyMAG-siRNA转染后可明显干扰ABCG2蛋白表达（P < 0.05）。结论：polyMAG-siRNA能高效干扰ABCG2表达,增加MCF-7/ADR细胞对阿霉素敏感性,逆转细胞耐药。     

PUMA基因转染乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡敏感性的研究

  目的  探讨PUMA基因转染是否增强乳腺癌MCF-7细胞对表柔比星致凋亡的敏感性。   方法  应用脂质体介导重组真核表达载体PUMA-pCDNA3和空载体pCDNA3质粒瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞中, G418筛选阳性细胞。将系列浓度(0.01~100μmol/L)的表柔比星分别作用于MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞72 h, MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50, FCM、TUNEL法检测细胞凋亡情况, Western blotting检测各组细胞PUMA蛋白表达的变化。   结果  MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞的表柔比星IC50分别为(13±1.4)、(1.8±0.2)和(10.7±1.3)μmol/L, MCF-7/PUMA细胞对表柔比星作用的敏感性增加了7.2倍。表柔比星以剂量依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡, 但对MCF-7/PUMA细胞所诱导的凋亡比MCF-7和MCF-7pCDNA3更明显。低浓度表柔比星(0.1μmol/L)轻微引起MCF-7/pCDNA3[(1.15±0.26)%]和MCF-7细胞凋亡[(0.9±0.24)%], 但能诱导MCF-7/PUMA细胞明显凋亡[(6.44±1.46)%]; 高浓度表柔比星(1μmol/L)诱导各组细胞凋亡, 但表柔比星MCF-7/PU MA细胞凋亡率[(35.47±9.36)%]明显高于MCF-7[(12.6±3.73)%]和MCF-7/pCDNA3细胞[(15.2±5.17)%], 差异均有统计学意义(P < 0.01);FCM和TUNEL方法检测显示相同的结果。PUMA蛋白在MCF-7/PUMA细胞中的表达明显高于MCF-7和MCF-7/pCD NA3细胞。   结论  PUMA基因稳定转染明显地增强了乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡作用的敏感性。