逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞杀伤作用的实验研究

目的：观察逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞的杀伤作用，探讨慢性粒细胞白血病的基因治疗方法。方法：通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染K562细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的K562／(：D tk细胞株。用RTl_PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine，5-FC)和／或无环乌苷(Ganciciovir，GCv)后MTT法测定转基因组及未转基因组K562细胞的存活率。结果：双自杀基因在K562细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCv对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCv。结论：逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死K562细胞，双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

双自杀基因对Raji淋巴瘤细胞杀伤的增强作用

目的 :观察反转录病毒介导的双自杀基因对 Raji淋巴瘤细胞的杀伤增强作用 ,探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 :通过脂质体将含有双自杀基因的反转录病毒载体 p WZL neo CDglytk导入病毒包装细胞 PA317,经 G4 18筛选后大量培养产病毒的阳性克隆 PA317/ CD+ tk细胞株 ,收集病毒上清 ,浓缩后转染 Raji淋巴瘤细胞 ,再次经 G4 18筛选 ,获得稳定表达双自杀基因的 Raji/ CD+ tk细胞株。用RT- PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物 5 -氟胞嘧啶 (5 - flourocytosine,5 - FC)和 /或无环鸟苷(Ganciciovir,GCV)后 ,MTT法测定细胞的存活率及 CDglytk双自杀基因对 Raji细胞的杀伤作用。结果 :双自杀基因在 Raji细胞中可稳定表达 ,联合使用 5 - FC和 GCV时 Raji细胞的存活率 (13.83% )明显低于单独使用 GCV (5 0 .6 5 % )或 5 - FC(5 7.6 8% )时 ,各组比差异具有显著性 (P<0 .0 1)。结论 :反转录病毒介导双自杀基因对 Raji淋巴瘤的杀伤作用明显增强     

逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞杀伤作用的实验研究

目的 :观察逆转录病毒介导的双自杀基因对K5 6 2细胞的杀伤作用 ,探讨慢性粒细胞白血病的基因治疗方法。方法 :通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,经G4 18筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317 CD +tk细胞株 ,收集病毒上清 ,浓缩后转染K5 6 2细胞 ,再次经G4 18筛选 ,获得稳定表达双自杀基因的K5 6 2 CD +tk细胞株。用RT PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物 5 氟胞嘧啶 (5 flourocytosine ,5 FC)和 或无环鸟苷 (Ganciciovir,GCV)后MTT法测定转基因组及未转基因组K5 6 2细胞的存活率。结果 :双自杀基因在K5 6 2细胞中可稳定表达 ,联合使用 5 FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用 5 FC或GCV。结论 :逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死K5 6 2细胞 ,双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用     

慢病毒携带的双自杀基因对淋巴瘤细胞杀伤作用的实验研究

背景与目的:慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫原性低等优点,适于体内基因治疗。本研究探讨慢病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用。方法:将表达慢病毒的3种质粒,即包装结构基因质粒pCMVΔ8.2、包膜基因质粒pCMV.VSVG、目的基因质粒pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk分两组(pHR'CS.Cdglytk为实验组、pHR'CS.GFP为对照组),经脂质体导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染Raji细胞,用荧光显微镜及RT-PCR检测基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV),用MTT法测定Raji细胞的生长抑制率,检测CD和HSV-tk双自杀基因对Raji细胞的作用。结果:表达慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见富集的病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在Raji细胞中高效、稳定表达。单独使用GCV或5-FC对细胞的生长抑制率分别为51%、50%,与未转染组Raji细胞比较,差异有显著性(P<0.01);联合使用5-FC和GCV对细胞的生长抑制率为73%,明显高于单独使用5-FC或GCV(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染淋巴瘤细胞;双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSVtk/GCV)对淋巴瘤细     

Anti-CD20-scFv-IgGFc基因修饰T细胞诱导Raji细胞凋亡的研究

背景与目的:研究重组anti-CD20-scFv-IgGFc的pLNCX质粒转染T淋巴细胞后,用锚定的T细胞杀伤Raji细胞,观察其诱导Raji细胞凋亡的能力.材料与方法:重组质粒通过脂质体转染至逆转录病毒包装的PA317细胞中,600/μg/ml的G418筛选3周后,用PA317细胞培养液感染的外周血T细胞和T细胞分别去杀伤等量的Raji细胞,于不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Annexin V和Bcl-2的阳性率.结果:流式细胞仪检测发现在24 h内,CD20阳性的Raji细胞上Annexin V阳性率明显高于对照组,Bcl-2的阳性表达率较对照组明显降低.结论:含anti-CD20-scFv-IgGFc重组子基因修饰的T细胞在数小时内就可引起Raji细胞发生凋亡,其早期凋亡可能通过启动Annexin V,同时通过抑制Bcl-2的表达而加快Raji细胞凋亡达到靶向杀伤的作用.     

胞嘧啶脱氨酶基因联合5-Fc治疗结肠癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶基因(CD)联合前体药物5-氟胞嘧啶(5-Fc)对结肠癌细胞的生长抑制作用。方法应用逆转录病毒介导的方法,将逆转录病毒载体pLXSN中含有大肠杆菌CD基因的重组质粒pCD2转染到病毒包装细胞PA317后,感染人结肠癌细胞株SW1116。对转基因的细胞进行RT-PCR检测和体内外药物敏感实验。结果获得了稳定表达EC—CD基因的结肠癌细胞株SWCD2,与野生型SW1116细胞相比,SWCD2细胞对基本无毒性的原药5-Fc的敏感性增加,50％细胞生长抑制率(IC50)浓度由野生型SW1116细胞的16000μmol／L降低到SWCD2的66μmol／L。经5-Fc治疗后,SWCD2细胞的裸鼠移植瘤生长明显缩小。结论CD基因联合5-Fc对人结肠癌细胞具有实验性基因治疗作用。     

CD基因联合 5-Fc治疗人胃癌的实验研究

目的：通过 转基因方法观察自杀基因CD对人胃癌细胞株7901的体内外 杀伤作用,并观察组织病理变化。方法：应用逆转录病毒方法转导自杀基因CD,通过体外实验观察CD 基因对人胃癌7901细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在BALB／cnu/nu裸鼠建立胃癌模型,然后将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药,观察肿上瘤体积变化,通过病理切片观察组织病理变化。结果：CD基因在外外即显出明显的杀伤作用（含旁观者效应）,20％的转基因细胞可以杀伤70％－80％的肿瘤细胞。在实验动物体内,CD基因结合前药5－Fc可显著杀伤肿瘤,而单纯转导CD基因和只用5－Fc并不能起到杀伤作用。结论：自杀基因CD联合前药5－Fc对胃癌产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞。CD／5－Fe在体内试验对胃癌有显著杀伤作用。     

胰、脾

联合应用双自杀基因对SW1990细胞的杀伤作用//逆转录病毒介导的CD／5-FC对胰腺癌细胞的杀伤作用//胰头癌淋巴结转移的临床研究//胰岛素瘤的诊断与治疗//高强度聚焦超声治疗晚期胰腺癌//常规分村立体定向适形放射治疗晚期胰腺癌28例临床观察//^125I种子檀入内照射联合化疗治疗胰腺癌临床疗效的初步评价。     

缝隙连接蛋白43对双自杀基因系统旁观者效应的影响

Objective： To observe the influence of connexin 43 （Cx43） on the bystander effect induced by cytosine deaminase （CD） and herpes simplex virus thymidine kinase （HSV-tk） coexpression suicide genes system in human cholangiocarcinoma QBC939 cells and transplantation tumors in nude mice. Methods： In vitro, the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells were respectively treated with 5-fluorocytosine （5-Fc） and Ganciclovir （GCV）. The cytotoxic effect was evaluated by MTT method. In order to investigate the influence of Cx43 on the bystander effect, the size of transplantation tumors of the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells was measured before and after application of 5-Fc and GCV. Results： CD and tk genes were stably expressed in transfected QBC939 cells. The increased expression of Cx43 was determined by testing for the presence of Cx43 mRNA by RT-PCR and the presence of Cx43 protein by Western Blot in CD＋tk＋Cx＋ cells. The killing effect of 5-Fc and GCV on CD＋tk＋Cx＋ cells was more effective than that on CD＋tk＋ cells both in vitro and in vivo. Conclusion： Double suicide genes system CD/5-Fc＋tk/GCV could induce remarkable killing effect on cholangiocarcinoma cells in vitro and transplantation tumors in vivo. The cotransfection of Cx43 gene could enhance the bystander effect and hence the inhibition of carcinoma cells.     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk对CEA阳性肺癌的杀伤作用

目的：增强E.coli cd/HSV-1 tk自杀基因的细胞毒性，实现阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系靶向杀伤CEA阳性肺癌，方法：PCR法分别扩增出CMV增强子，CWA启动子，cd-tk，构建真核表达载体pE-CEA-cd-tk;MTT法检测pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系的体外细胞毒性，体内实验采用肺腺癌细胞SPC－A－1裸鼠皮下移植瘤模型，通过肿瘤局部或鼠尾静脉注射脂质体／pE-CEA-cd-tk复合物，腹腔注射GCV＋5－FC前体药物进行治疗。结果：阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系体外可靶向杀伤CEA阳性肺癌细胞，这种杀伤作用存在显著的细胞差异；体内可抑制小鼠皮下肺肿瘤结节的生长，荷瘤鼠存活期延长。结论：阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系体内外对CEA阳性肺癌均具有较强的杀伤作用，有望用于CEA阳性肺癌的治疗。     

HSV—tk／GCV系统对神经胶质瘤的自杀基因治疗研究

目的在ｉｎｖｉｔｒｏ和ｉｎｖｉｖｏ水平建立致死神经胶质瘤的ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ自杀基因系统,并验证该系统的有效性。方法用携带单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因的重组逆转录病毒,感染大鼠神经胶质瘤细胞Ｃ６,筛选稳定表达ｔｋ的克隆细胞Ｃ６／ｔｋ;经生长抑制试验,比较Ｃ６／ｔｋ细胞对三种核苷类似物ＧＣＶ、ＢＶｄＵ和ＡＣＶ的敏感性;Ｃ６／ｔｋ细胞在裸鼠皮下成瘤,用ＧＣＶ进行治疗并观察疗效。结果ｔｋ基因整合入Ｃ６细胞并在Ｃ６／ｔｋ细胞中稳定表达;生长抑制试验表明,ＧＣＶ是最为有效的原药,Ｃ６／ｔｋ细胞对ＧＣＶ高度敏感,ＩＣ５０＜０．２μｍｏｌ／Ｌ,而野生型Ｃ６细胞和转染空载病毒载体的Ｃ６／０细胞对ＧＣＶ的ＩＣ５０≥１００μｍｏｌ／Ｌ,相差５００多倍。裸鼠ｉｎｖｉｖｏ实验得到相应结果,治疗组肿瘤受到明显抑制和杀伤。结论在ｉｎｖｉｔｒｏ和ｉｎｖｉｖｏ水平,表达ｔｋ基因的肿瘤细胞均被ＧＣＶ有效杀伤,这表明ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ自杀基因系统有可能成为基因治疗脑瘤的有效方法。     

HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞体外杀伤效应的研究

目的:研究HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:利用重组DNA技术,将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体(pLNCTK)中,在LipofectAMINE介导下,转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NTH3T3细胞测定病毒滴度,将重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,挑取阳性克隆,扩大培养,命名为MM45T.Li/TK.PCR,RT-PCR对HSV-tk基因修饰的MM45T.Li细胞进行鉴定,然后观察CCV对MM45T.Li/TK和不同比例TK~ 与TK~-混合细胞的杀伤作用.结果:重组逆转录病毒滴度为5×10~5CFU/ml,PCR及RT-PCR分析证明HSV-tk基因已整合至MM45T.Li细胞基因组中,并在mRNA水平上的表达.MM45T.Li/TK与未转基因的原肿瘤细胞,二者的生长速度与形态结构无明显差别.MM45T.Li/TK细胞对CCV高度敏感,即低浓度GCV(1mg/L)处理MM45T.Li/TK细胞3d,即可将其杀死.旁观者效应显示将25%MM45T.Li/TK细胞与75%MM45T.Li混合,发现90%以上的细胞被杀死.结论:小鼠肝癌细胞对HSV-tk/CCV系统高度敏感,并具有明显的旁观者效应.     

Adenovirus-mediated gene transfer of enhanced Herpes simplex virus thymidine kinase mutants improves prodrug-mediated tumor cell killing

The Herpes simplex virus 1 (HSV) thymidine kinase (tk) suicide gene together with ganciclovir (GCV) have been successfully used for the in vivo treatment of various solid tumors and for the ablation of unwanted transfused stem cells in recent clinical trials. With the aim of improving this therapeutic system, we compared the potential efficacy of adenoviral (Ad) vectors expressing enhanced tk mutants in vitro and in vivo. The previously created HSV-tk mutants dm30 and sr39, created by random sequence mutagenesis, were inserted into a standard Ad.RSV E1(-)E3(-) backbone using homologous recombination. GCV killing of Ad.HSV-tk, Ad.dm30-tk and Ad.sr39-tk was assessed in various tumor cell lines with a cell proliferation assay. Cells expressing the two TK mutants were two-to-five-fold more sensitive to GCV when compared with Ad.HSV-tk transduced cells in all cell lines tested (five human mesotheliomas, one human lung cancer, a human cervical carcinoma, a mouse fibrosarcoma, and a rat glioma line) at equal TK expression levels. Flank tumor models, including cell-mixing studies, assessed the in vivo efficacy of the engineered viruses in BALB/C and SCID mice. In all animal studies, Ad.dm30-tk and Ad.sr39-tk showed more tumor growth inhibition than Ad.HSV-tk when GCV was administered. The use of adenovirus-mediated gene transfer of both tk mutants dm30-tk and sr39-tk for cancer suicide gene therapy should provide a more effective and safer alternative to wild-type HSV-tk.