激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制

目的:细胞表面Toll样受体对激发先天性免疫、抵抗微生物感染有重要作用.最近研究发现激活细胞表面Toll样受体不仅可以预防微生物感染,还可以促进组织再生.实验通过脂多糖激活体外培养的角质细胞株Hacat细胞表面Toll样受体,观察其促进创面愈合的可能机制.方法:实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成.①实验分组及方法:角质细胞株Hacat由解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠;脂多糖为Sigma公司产品;小鼠抗人Toll样受体2单克隆抗体、兔抗人Toll样受体4多克隆抗体购于ebioscience公司.体外培养Hacat细胞,根据脂多糖(500 ng/L)与Hacat细胞共培养24,48,72 h将细胞随机分为脂多糖作用24 h 组、脂多糖作用48 h 组、脂多糖作用72 h 组,另设对照组,只加溶剂二甲基亚枫.②实验评估:蛋白免疫印迹技术检测脂多糖对Hacat细胞Toll样受体2、Toll样受体4及核因子-κB表达的影响;荧光定量聚合酶链反应检测脂多糖作用后Hacat细胞内基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达.结果:光学显微镜下正常人皮肤表皮及角质细胞Toll样受体2、Toll样受体4表达呈蓝黑色;脂多糖作用于Hacat细胞24,48,72 h 后Toll样受体2、Toll样受体4、核因子-κB表达均高于对照组(P ＜ 0.01).与对照组相比,其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高(P ＜ 0.01,P ＜ 0.05).脂多糖作用24 h 组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性(P ＞ 0.05),脂多糖作用48,72 h 组与对照组比较,差异显著(P ＜ 0.05).结论:激活Hacat细胞表面Toll样受体有促进创面愈合作用,其机制可能与脂多糖作用于Toll样受体从而激活核因子-κB信号传导通路促进细胞释放基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子等因素有关.     

健心方对核因子-kB活性的影响

目的；观察脂多糖对CHO-K1细胞核因子-kB活性的影响及健心方含药血清对脂多糖刺激的调节作用。 方法：①实验于2005-03／05在解放军广州军区武汉总医院实验中心和南方医科大学附属南方医院肿瘤中心实验室完成。选用清洁级SD大鼠12只。随机将鼠分为2组：动物治疗组和动物对照组，每组6只。②动物治疗组给予3．2kg／L健心方口服液（水煎醇提法制备，主要成分：黄芪、太子参、川芎、当归、葶苈子、云苓、桂枝、香附等），动物对照组用等量生理盐水以获得空白对照血清。灌胃体积均为10mL／kg。1d剂量分2次服。连续给药3d，第4天1次服用全天剂量后采血制备含药血清和空白对照血清。③体外培养CHO-K1细胞，分为6组：对照组：转染质粒（pNF-kB-TA-Lue和pCMV-β-半乳糖苷酶共0．5μg）后加用脂多糖刺激；感染1组：转染质粒并加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染；刺激1组：转染质粒并加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染后用脂多糖刺激；治疗组：转染质粒、加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染并用脂多糖刺激后加用古药血清干预；感染2组：转染质粒并加含Toll样受体4细胞外段的重组腺病毒感染；刺激2组：转染质粒并加含Toll样受体4细胞外段的重组腺病毒感染后用脂多糖刺激。（4）检测各组细胞核因子-kB相对活性，即相对发光值（荧光索酶强度值/β-半乳糖苷酶值）。⑤数据作完全随机设计方差分析，组间比较用LSD检验和Dunnett（双侧）检验。 结果：大鼠12只均进入结果分析。荧光素酶报告基因检测结果表明，相对发光值：对照组细胞明显高于感染1组（3560&;#177;57，1634&;#177;38，P〈0．05）；刺激1组细胞明显高于对照组、感染1组（8767&;#177;82，P〈0．05，0．01）；感染2组、刺激2组细胞明显低予对照组（530&;#177;74，536&;#177;71，P〈0．05）；治疗组明显低于刺激1组（1820&;#177;24，P〈0．05），但明显高于刺激2组（P〈0．05），略低于转染后对照组，但差异不明显（P〉0．05）。 结论：健心方古药血清可部分拮抗脂多糖导致的核因子-kB激活作用；Toll样受体4是脂多糖激活细胞的关键受体，健心方含药血清的拮抗作用可能是通过阻断了Toll样受体4对脂多糖的识别造成的。     

甲状旁腺激素对人成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的调控

背景：甲状旁腺激素是骨代谢的重要调节因子，膜型基质金属蛋白酶1在骨吸收的调控中起重要作用。 目的：观察甲状旁腺激素对人成骨样MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的影响。 设计、时间及地点：观察对比实验。于2001—03／2002-07在中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所实验室完成。 材料：人成骨样MG－63细胞株，甲状旁腺激素（1～34）。 方法：分别应用1．10．100nmol／L的甲状旁腺激素（1～34）干预MG-63细胞24h；或分别用10nmol／L甲状旁腺激素（1～34）干预MG－63细胞2，6，24，48h；每干预组设3个平行样本，重复3次。 主要观察指标：采用Northern杂交法检测膜型基质金属蛋白酶1 mRNA表达水平：Western杂交法检测膜型基质金属蛋白酶1蛋白表达水平。 结果：①1，10，100nmol／L的甲状旁腺激素（1～34）对MG-63细胞膜型基质金属蛋白酶1mRNA及蛋白的表达有抑制作用，呈剂量依赖性（P〈0．05）。②10nmol／L的甲状旁腺激素（1-34）在干预2-48h内对膜型基质金属蛋白酶1mRNA及蛋白的表达有抑制作用，呈时间依赖性（P〈0．05）。 结论：甲状旁腺激素具有抑制成骨样细胞膜型基质金属蛋白酶1表达的作用，此可能为甲状旁腺激素诱导骨吸收的作用途径之一。     

银杏叶提取物对脐静脉内皮细胞Toll样受体4／核因子-кB途径及细胞间黏附分子1表达的影响

目的：观察具有抗血小板活化因子、清除氧自由基、抗氧化作用的银杏叶提取物对脂多糖介导的人脐静脉内皮细胞Toll样受体4／核因子-κB信号途径及细胞间黏附分子、E-选择素表达的影响。 方法：①实验于2003-01／2004-12在大连医科大学附属第二医院实验中心完成。取健康产妇分娩后的新鲜婴儿脐带(由本院分娩的产妇自愿提供)，应用胶原酶消化人脐静脉内皮，收集内皮细胞进行培养。②将培养成融合状态的内皮细胞随机分为4组：对照组：M199培养基中不加其他干预物质；脂多糖组：M199培养基中加入脂多糖1mg／L；脂多糖+银杏叶提取物50组：预先加入银杏叶提取物50(80mg／L)，60min后加入脂多糖1mg／L；脂多糖+咖啡酸苯乙酯组：预先加入咖啡酸苯乙酯(20mg／L)30min。干预12h，收集细胞检测Toll样受体4和细胞间黏附分子1、E-选择素表达水平；干预1h，收集细胞提取核蛋白检测转录核因子κBp65活化变化。③采用反转录聚合酶链反应检测Toll样受体4和细胞间黏附分子1、E-选择素mRNA表达水平；采用蛋白质印迹技术检测Toll样受体4蛋白表达水平及核因子-KB活化的变化；采用酶联免疫吸附方法检测人脐静脉内皮细胞表面细胞间黏附分子1，E-选择素蛋白表达。④多个样本均数的比较采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用q检验 结果：①人脐静脉内皮细胞Toll样受体4mRNA和蛋白表达(A值)：脂多糖组明显高于对照组(P<0．01)，脂多糖+银杏叶提取物组和脂多糖+咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组(p<0．05～0．01)。②人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子1、E-选择素mRNA和蛋白表达(A值)：脂多糖组明显高于对照组(P<0．01)，脂多糖+银杏叶提取物组和脂多糖+咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组(P<0．05～0．01)。③人脐静脉内皮细胞核蛋白核因子-κBp65活化(A值)：脂多糖组明显高于对照组(P<0．01)，脂多糖+银杏叶提取物组和脂多糖+咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组(P<0．05)。 结论：银杏叶提取物可能通过抑制核因子-κB活化，进而减弱Toll样受体4／核因子-κB途径从而抑制脂多糖介导的黏附分子表达及炎症反应。     

周期性张应力与软骨细胞基质金属蛋白酶的表达

背景：课题组前期研究证实,在关节软骨缺损及骨性关节炎的动物模型中,软骨细胞可过度表达基质金属蛋白酶,各种异常刺激均可能打破基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制因子间平衡,从而导致关节软骨细胞外基质退变,软骨细胞功能下降和失调。目的：观察兔关节软骨缺损修复过程中周期性张应力对软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响。方法：建立兔单侧膝关节软骨缺损模型,术后10周分离软骨细胞体外培养,非手术侧软骨细胞为正常组,术侧软骨细胞随机分为高应力组、低应力组及对照组,加载幅度为sin00％,0．1,1．0,OHz的周期性张应力,于24h、48h、1周、2周和4周后RT-PCR测定各组基质金属蛋白酶2,3,9,13的表达。结果与结论：加载周期性张应力24h后,正常组及对照组间的基质金属蛋白酶2,3,9,13的表达差异有显著性意义（P《O．05）;加载周期性张应力1周、2周及4周后高应力组和低压力组间差异有显著性意义（P〈0．05）;同时发现,低应力组中基质金属蛋白酶2,3,9,13的表达持续下降,加载周期性张应力24h与4周之间的差异有显著性意义（P〈0．05）。可见力学载荷可影响兔关节软骨缺损修复过程中基质金属蛋白酶的表达,在细胞分子水平上,关节软骨缺损病理的发生发展与应力相互影响。     

青心酮对RAW264．7细胞可溶性Toll样受体4表达及炎症相关因子的影响

目的：观察活血化瘀中药秃毛冬青叶中有效成分青心酮对RAW264．7细胞炎症反应时可溶性TOU样受体4mRNA及蛋白表达、血红素氧和酶1mRNA表达、肿瘤坏死因子d分泌的影响。 方法：①实验于2004-03／2005-01在华中科技大学同济医学院病理生理教研室完成。②采用RAW264．7巨噬细胞株建立细胞炎症反应模型。观察下述4种情况下培养液血红素氧和酶1mRNA的变化：脂多糖刺激；青心酮[青心酮注射液，3，4-羟基苯乙酮40mg／支（2mL），实验用，北京制药三厂]预处理3h后加脂多糖刺激；青心酮和脂多糖同时加入；脂多糖刺激3h后加入青心酮。其他指标测定实验分为3组：空白对照组（正常细胞培养，加入等数量的培养基，不加入任何药物）；青心酮预处理组（先加入溶有青心酮1&;#215;10^-7mol／L的培养基培养3h，再加入脂多糖10μg/L刺激4，8h）；未处理组（加入等数量的培养基3h，再加入脂多糖10μg/L刺激4，8h）。③采用反转录聚合酶链反应分析可溶性TOU样受体4、血红素氧和酶1mRNA的变化；Western blot方法检测可溶性Toll样受体4蛋白水平的改变，用ELISA方法检测培养液肿瘤坏死因子α分泌的变化。④组间数据处理采用配对t检验。 结果：①可溶性TOU样受体4mRNA表达：青心酮预处理脂多糖刺激4h后明显高于未处理组（P〈0．01）。未处理组经脂多糖刺激4h后，明显低于空白对照组（P〈0．05）。②可溶性TOU样受体4蛋白表达：青心酮预处理组脂多糖刺激8h后明显高于未处理组（P〈0.05），但与空白对照组比较，差异不明显（P〉0．05）；未处理组脂多糖刺激8h后，明显低于空白对照组（P〈0，05）。③血红素氧和酶1mRNA表达：青心酮预处理后加脂多糖刺激和青心酮、脂多糖同时加入后明显高于脂多糖刺激后（P〈0．05）。④培养液中肿瘤坏死因子d：脂多糖刺激后明显增加（P〈0．01）；青心酮预处理脂多糖刺激后明显低于未处理组（P〈0．01）。 结论：青心酮预处理能有效的抑制炎症反应，可能与其上调可溶性TOU样受体4mRNA及蛋白表达，增加血红素氧和酶1mRNA表达，减少肿瘤坏死因子α分泌有关。     

银杏叶提取物对脐静脉内皮细胞Toll样受体4/核因子-κB途径及细胞间黏附分子1表达的影响

目的：观察具有抗血小板活化因子、清除氧自由基、抗氧化作用的银杏叶提取物对脂多糖介导的人脐静脉内皮细胞Toll样受体4/核因子-κB信号途径及细胞间黏附分子、E-选择素表达的影响.方法：①实验于2003-01/2004-12在大连医科大学附属第二医院实验中心完成.取健康产妇分娩后的新鲜婴儿脐带（由本院分娩的产妇自愿提供）,应用胶原酶消化人脐静脉内皮,收集内皮细胞进行培养.②将培养成融合状态的内皮细胞随机分为4组：对照组：M199培养基中不加其他干预物质;脂多糖组：M199培养基中加入脂多糖1 mg/L;脂多糖＋银杏叶提取物50组：预先加入银杏叶提取物50（80 mg/L）,60 min后加入脂多糖1 mg/L;脂多糖＋咖啡酸苯乙酯组：预先加入咖啡酸苯乙酯（20 mg/L）30 min.于预12 h,收集细胞检测Toll样受体4和细胞间黏附分子1、E-选择素表达水平;干预1 h,收集细胞提取核蛋白检测转录核因子κB p65活化变化.③采用反转录聚合酶链反应检测Toll样受体4和细胞间黏附分子1、E-选择素mRNA表达水平;采用蛋白质印迹技术检测Toll样受体4蛋白表达水平及核因子-κB活化的变化;采用酶联免疫吸附方法检测人脐静脉内皮细胞表面细胞间黏附分子1,E-选择素蛋白表达.④多个样本均数的比较采用方差分析,多个样本均数的两两比较采用q检验结果：①人脐静脉内皮细胞Toll样受体4 mRNA和蛋白表达（A值）：脂多糖组明显高于对照组（P＜0.01）,脂多糖＋银杏叶提取物组和脂多糖＋咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组（P＜0.05～0.01）.②人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子1、E-选择素mRNA和蛋白表达（A值）：脂多糖组明显高于对照组（P＜0.01）,脂多糖＋银杏叶提取物组和脂多糖＋咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组（P＜0.05～0.01）.③人脐静脉内皮细胞核蛋白核因子-κB p65活化（A值）：脂多糖组明显高于对照组（P＜0.01）,脂多糖＋银杏叶提取物组和脂多糖＋咖啡酸苯乙酯组明显低于脂多糖组（P＜0.05）.结论：银杏叶提取物可能通过抑制核因子-κB活化,进而减弱Toll样受体4/核因子-κB途径从而抑制脂多糖介导的黏附分子表达及炎症反应.     

RNA干扰技术对小鼠巨噬细胞基质金属蛋白酶9表达的抑制

目的：构建基质金属蛋白酶9靶向的RNA干扰质粒载体，观察其对小鼠巨噬细胞基质金属蛋白酶9基因表达的沉默作用。 方法：实验于2004-11／2005—07在哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室完成。设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列，并与psiSTRIKE^TM质粒载体连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体，以脂质体法将重组质粒导人小鼠巨噬细胞内，采用Invitrogen公司Lipofectamne^TM2000转染试剂进行转染。实验分为实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入4μL脂质体和psiSTRIKE^TM／基质金属蛋白酶9重组质粒2μg；阴性对照组只加2μL Lipofectamne^TM2000转染试剂；空白对照组则不加任何干扰因素。分别于转染前、转染24，48，72h后用反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学技术检测基质金属蛋白酶9mRNA及蛋白水平的表达情况。 结果：①成功构建靶向基质金属蛋白酶9基因发夹状RNA干扰质粒载体。②实验组转染重组质粒24，48，72h后阳性细胞率与转染前相比逐渐减少（分别为70％，42％，32％，99％，P〈0．01），而阴性对照组和空白对照组则差异无显著性意义。③转染小鼠巨噬细胞后，基质金属蛋白酶9mRNA蛋白表达下调。 结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显抑制基质金属蛋白酶9mRNA及蛋白的表达，提示通过减少动脉粥样硬化斑块细胞外基质的降解，来稳定动脉粥样硬化斑块，在基因治疗方向为斑块稳定进行了新的尝试。     

血管内皮生长因子对佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9表达的影响

目的:观察血管内皮生长因子对佐剂性关节炎滑膜细胞质金属蛋白酶3及质金属蛋白酶9表达的影响,并探讨其意义。方法:实验于2006-02/12在桂林医学院实验中心完成。①实验材料:清洁级8周龄雄性Wistar大鼠6只,血管内皮生长因子为Peprotech EC LTD公司产品,基质金属蛋白酶3(扩增369bp)上游引物、下游引物,基质金属蛋白酶9(扩增405bp)上游引物、下游引物均购自晶美公司。②实验干预:先用弗氏完全佐剂造Wistar大鼠模型;造模20d后取Wistar大鼠右后足滑膜细胞进行原代培养。③实验分组:实验分为血管内皮生长因子组:取P2代细胞接种于6孔培养板,分别加入终浓度为5,25,50μg/L血管内皮生长因子;对照组:不加血管内皮生长因子。④实验评估:取病理切片观察滑膜细胞形态学改变;采用半定量反转录聚合酶链反应检测Wistar大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9的m-RNA表达。结果:①培养细胞的形态学观察:原代培养14d滑膜细胞从组织块边缘逸出,21d密集生长开始传代;传代细胞48h可明显分辨出树突样细胞、巨噬细胞样细胞和成纤维细胞样细胞;传至21代,细胞生长及特性稳定。②病理切片:滑膜组织有中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润,滑膜细胞增生、排列紊乱,纤维素渗出,胶原纤维沉着,纤维素样坏死,呈滑膜炎表现。③基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9的mRNA表达:对照组基质金属蛋白酶3mRNA表达相对灰度值与血管内皮生长因子终浓度5,25,50μg/L组比较,差异有显著性意义(0.32±0.03,0.77±0.06,1.12±0.12,1.59±0.02,P<0.05);对照组基质金属蛋白酶9mRNA表达相对灰度值与血管内皮生长因子终浓度5,25,50μg/L组比较,差异有显著性意义(0.47±0.07,0.50±0.10,0.91±0.10,1.31±0.06,P<0.05);基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9mRNA表达随血管内皮生长因子浓度的加大表达增加。结论:血管内皮生长因子以剂量递增的方式对体外培养的佐剂性关节炎滑膜细胞基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶9的表达有促进作用。     

人骨髓间充质干细胞培养上清与肝星状细胞相关酶的分泌

背景：研究证实骨髓间充质干细胞移植治疗能改善甚至逆转肝纤维化,但其具体机制尚不清楚。目的：检测人骨髓问充质干细胞培养上清对肝星状细胞中基质金属蛋白酶2及组织抑制基质金属蛋白酶1表达的影响。方法;采用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞,收集原代培养7d的骨髓问充质千细胞培养上清,加入肝星状细胞中培养作为实验组,并设置单独肝星状细胞组、单独骨髓间充质干细胞组为对照。培养24,48h后,检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2蛋白与组织抑制基质金属蛋白酶1蛋白的表达。结果与结论：与单独肝星状细胞组、单独骨髓问充质于细胞组比较,实验组培养24,48h后肝星状细胞基质金属蛋白酶2及组织抑制基质金属蛋白酶1表达减少（P〈0．05或P〈0．01）。表明骨髓间充质干细胞培养上清抑制肝星状细胞中基质金属蛋白酶2、组织抑制基质会属蛋白酶1的表达。     

液相蛋白芯片法测蜕膜细胞与滋养层细胞共培养体系中基质金属蛋白酶的表达

目的：探讨蜕膜基质细胞与绒毛外滋养层细胞共培养体系中细胞滋养层细胞侵入过程中基质金属蛋白酶表达水平的变化及在母胎界面间基质金属蛋白酶对细胞滋养层细胞侵袭行为的调控。 方法：实验于2005—09／12在南方医科大学南方医院生殖中心及病生实验室完成。①分别进行蜕膜基质细胞与绒毛外滋养层细胞的体外分离培养与纯化。②在Transwell—Col Insert细胞培养板内进行蜕膜细胞与滋养细胞体外共培养及直接混合培养。③利用Luminex xMAP对培养上清液中多种基质金属蛋白酶蛋白表达的含量变化进行分析。 结果：①与绒毛外滋养层细胞相比，基质金属蛋白酶1，3在共培养体系与混合培养体系中的表达依次升高，差异有显著性（P〈0．05），基质金属蛋白酶2，7，9在共培养体系与混合培养体系中的表达依次降低，差异有显著性（P〈0．05），且在共培养体系中以基质金属蛋白酶2，9表达尤为显著，基质金属蛋白酶8，12，13在各培养体系中均为低表达。②两种共培养体系中，除基质金属蛋白酶-13变化不显著外，其余基质金属蛋白酶均在Tranwell共培养体系下显著升高（P〈0．05）。④基质金属蛋白酶1，3，7，8两两之间正相关，基质金属蛋白酶2，7，9两两间正相关，相关关系均显著（P〈0．05），且关系较密切（r〉0.5548）。 结论：共培养条件下滋养层细胞侵入过程中基质金属蛋白酶量的变化及之间的相互关系与胚胎着床关系密切。     

尿酸钠结晶影响肾小管上皮细胞的紧密连接

背景：目前研究来看,尿酸性结石与紧密连接蛋白及肾间质纤维化的关系仍未明确。目的：观察尿酸钠结晶对肾小管上皮细胞紧密连接的影响。方法：配制单钠尿酸钠晶体。将正常大鼠肾小管上皮细胞随机分为对照组和尿酸钠结晶组,分别用无血清培养基和尿酸钠结晶进行培养。免疫荧光和RT-PCR方法检测24,48,72h紧密连接蛋白的表达。结果与结论：与对照组比较,尿酸钠结晶于不同时相刺激NRK-52E细胞后,紧密连接蛋白和mRNA表达下降（P〈0.05）,72h时下降显著（P〈0.01）,蛋白表达出现重新分布现象。说明尿酸钠结晶可破坏肾小管上皮细胞紧密连接蛋白的结构、功能及导致分布异常。     

重组人粒细胞集落刺激因子对药物性皮肤溃疡愈合的影响

背景：粒细胞集落刺激因子对成纤维细胞、角质细胞、皮肤黏膜细胞均有不同程度的刺激作用。 目的：观察粒细胞集落刺激因子对药物性外渗所致皮肤溃疡的愈合作用。 设计：随机对照动物实验。 单位：解放军第四军医大学西京医院呼吸内科。 材料：实验于2004—06／2004—11在解放军第四军医大学西京医院呼吸内科实验室完成。取雄性昆明种小白鼠20只，体质量18～24g。 方法：将制备好的皮肤溃疡动物模型随机分为对照组和治疗组，每组10只。对照组给予酚妥拉明1mg，利多卡因20mg，地塞米松1mg，用生理盐水稀释至0．5mL，封闭，1次／d，共7d；治疗组在溃疡周围注射粒细胞集落刺激因子25μg，用生理盐水稀释至0．5mL，隔日给药1次，共7d。观察溃疡处皮肤组织的愈合时间和组织学变化。 主要观察指标：观察粒细胞集落刺激因子对药物性外渗所致皮肤溃疡、糜烂的愈合时间和组织学变化。 结果：20只小白鼠均进入结果分析。①愈合时间：对照组糜烂、溃疡的愈合时间明显长于治疗组[（20-24，8～12）d，t=2．264，P=0．01]；②组织学观察：对照组治疗7d后肉芽组织增生不明显；治疗组治疗7d后肉芽组织增生，新生血管丰富。 结论：粒细胞集落刺激因子能促进药物性糜烂、溃疡的创伤愈合。     

人外周单个核细胞来源树突细胞成熟与肺炎支原体膜脂蛋白的影响

目的：实验着眼于肺炎支原体膜脂蛋白对人外周血单个核细胞来源的树突细胞的表型（CD83，CD86）及分泌细胞因子的作用，探讨肺炎支原体加重哮喘的机制是否是改变了树突细胞的性状。 方法：①对象：所有外周血采自正常人，志愿献血者为武汉大学医学院2005级硕士博士研究生6人：实验用肺炎支原体膜脂蛋白购自广州华银医药科技有限公司。②实验过程及分组：从肘静脉采集志愿者20mL新鲜全血，以不连续密度梯度离心法及贴壁法获取单核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，重组人白细胞介素4培养5d得到不成熟树突细胞后，分别予肺炎支原体膜脂蛋白，脂多糖和空白刺激再培养2d。③评估：用流式细胞仪检测各组树突细胞表面表达CD83，CD86的情况，用酶联免疫吸附法检测各组树突细胞分泌白细胞介素12的水平。 结果：①肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83，CD86高于未刺激组（P〈0．01，P〈0．01）;脂多糖组树突细胞表达CD83，CD86高于末刺激组（P〈0．01，P〈0．01）;肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞表达CD83较脂多糖组无差异，表达CD86高于脂多糖组（P〈0．05）。②肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组（P〈0．01）;脂多糖组树突细胞分泌白细胞介素12高于未刺激组（P〈0．01）；肺炎支原体膜脂蛋白组树突细胞分泌白细胞介素12低于脂多糖组（P〈0．05）。 结论：肺炎支原体膜脂蛋白可刺激未成熟树突细胞分化成熟，但较脂多糖刺激的不同，前者刺激成熟的树突细胞在呈递抗原给T细胞时，可进一步使T细胞向Th2极化，导致Th1／Th2平衡失调，从而加重哮喘。     

转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化：Notch1受体阻断剂的影响

背景：研究发现,在病理状态下各种细胞可通过转化生长因子β1的介导,促进肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化为肌成纤维细胞,进而加速肾小管间质纤维化的进展。目的：验证Notch1受体特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂DAPT能否有效阻断、部分逆转或者完全逆转转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化。方法：以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞为观察对象,建立转化生长因子β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化体外模型,实验分为空白对照组、10μg/L转化生长因子β1组、转化生长因子β1（10μg/L）＋γ-分泌酶抑制剂DAPT（5μmol/L）组、转化生长因子β1（10μg/L）＋γ-分泌酶抑制剂DAPT（5μmol/L）部分延迟加入组、转化生长因子β1（10μg/L）＋γ-分泌酶抑制剂DAPT（5μmol/L）延迟加入组。分别于12,24,48,72 h,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;用免疫组织化学法和RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙粘连素蛋白和mR NA表达变化。结果与结论：1在干预后在12,24,48,72 h,与空白对照组相比较,转化生长因子β1组α-平滑肌肌动蛋白蛋白和mR NA表达均明显增加（P〈0.05）,E-钙粘连素蛋白和mR NA表达逐渐减少（P〈0.05）。2转化生长因子β1＋γ-分泌酶抑制剂DAPT组α-平滑肌肌动蛋白的蛋白和mR NA、E-钙粘连素蛋白和mR NA的表达各时间段均接近空白对照组（P〉0.05）。3γ-分泌酶抑制剂DAPT部分延迟加入组,α-平滑肌肌动蛋白的蛋白和mR NA的表达在12 h增加（P〈0.05）,之后其表达逐渐减少（P〈0.05）,E-钙粘连素蛋白表达在24 h开始减少（P〈0.05）,之后逐渐增加,E-钙粘连素mR NA各时间段都与空白对照组相接近,72 h时α-平滑肌肌动蛋白与E-钙粘连素的蛋白及mR NA表达均与空白对照组无显著差异（P〉0.05）。4与空白对照组相比较,延迟加入组各时间点的α-平滑肌肌动蛋?     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

苦参碱抑制宫颈癌HeLa细胞增殖作用及机制

目的探讨苦参碱对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。方法以不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0g/L）的苦参碱分别处理HeLa细胞24、48、72h后,应用MTT法检测细胞增殖抑制率,WesternBlot方法检测培养48h细胞中真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）、4E结合蛋白1（4E-BP1）蛋白表达情况;1.0g/L的苦参碱作用HeLa细胞1、3、6、12h后,Western Blot方法测其eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平。结果苦参碱明显抑制HeLa细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性：在相同时间内,随着苦参碱浓度的增加,HeLa细胞的增殖抑制率明显升高（F=235.035,P〈0.05）;在同一浓度时,随着苦参碱作用时间的延长,HeLa细胞的增殖抑制率也明显升高（F=320.207,P〈0.05）;2.0g/L苦参碱作用72h对HeLa细胞增殖抑制率最大,为（65.30±2.17）%。不同浓度苦参碱处理HeLa细胞48h后,eIF4E、4E-BP1蛋白的表达均无明显变化（F=0.171、0.932,P〉0.05）。1.0g/L苦参碱作用于HeLa细胞不同时间后,细胞中eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平均降低,且呈时间依赖性（F=43.48、107.23,P〈0.01）。结论苦参碱可以明显抑制体外培养宫颈癌HeLa细胞的增殖,其作用可能是通过抑制eIF4E以及4E-BP1的磷酸化,从而抑制蛋白翻译来实现的。     

^60Co γ射线半身照射对小鼠非照射区域骨髓造血功能的影响

目的：观察局部电离辐射对小鼠非照射区域骨髓造血功能相关指标的影响。 方法：实验于2003—10／2004—03在解放军第兰军医大学辐照中心和全军复合伤研究所完成，选择雄性昆明小鼠180只，采用次序随机分组法分4组，即正常对照组、全身照射组、左半身照射组及全身屏蔽照射组。每组45只。正常对照组不作其他处理；全身照射组固定于照射架内；左半身照射组麻醉固定体位，用铅砖屏蔽右半身；全身屏蔽照射组麻醉固定，用铅砖屏蔽全身。应用8.0Gy ^60Coγ射线照射，剂量率68.46cGy／min。照射后不同时相检测各组小鼠血清超氧化物歧化酶活性及丙二醛、肿瘤坏死因子α含量变化，观察骨髓细胞凋亡情况和骨髓有核细胞数、粒细胞巨细胞集落形成单位等骨髓造血功能的变化。 结果：全身照射组照射后第8天死亡2只，第9天死亡4只，其余各组无脱失。①非照射区域骨髓细胞有核细胞数照射后24h和48h显著低于正常对照组（P〈0．01），但显著高于半身照射组照射侧（左侧）（P〈0．01）。②非照射区域骨髓细胞凋亡率照射后2d和9d均显著高于正常对照组（P〈0．01），但显著低于半身照射组照射侧（左侧）（P〈0．01）。③非照射区域照射后24h和48h粒细胞巨细胞集落形成单位数均显著低于正常对照组（P〈0．01），但显著高于半身照射组照射侧（左侧）（P〈0．01）。④照射后12h和24h左半身照射组小鼠血清肿瘤坏死因子α含量显著高于正常对照组（P〈0．01），但显著低于全身照射组（P〈0.01）。⑤照射后2d和9d左半身照射组小鼠血清丙二醛含量显著高于正常对照组（P〈0．01）。但显著低于全身照射组（P〈0．01）；血清超氧化物支化酶活性显著低于正常对照组（P〈0．01），但显著高于全身照射组（P〈0．01）。 结论：局部电离辐射作用后，可导致     

胰高糖素样肽1在血管再生中的作用及其机制研究

目的：探讨胰高糖素样肽1（GLP-1）对高糖培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其可能机制。方法人脐静脉内皮细胞分组培养,正常葡萄糖组（NG,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）,高葡萄糖组（HG,葡萄糖浓度33 mmol/L）,高糖加GLP-1干预组（分为低剂量组,中剂量和高剂量组,浓度分别为1、10、20 nmol/L,分别记为C1、C2、C3组）,于培养24 h,48 h和72 h用MTT法检测细胞增殖情况,并用ELISA法检测培养基上清液中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的浓度。结果48 h后高糖组细胞增殖明显低于正常对照组,GLP-1干预后能明显促进细胞增殖,以中剂量最为明显（0.6±0.11 vs.0.47±0.09,P＜0.05）,72 h这种情况更为明显;高糖培养48 h细胞分泌VEGF明显减少[（101.72±6.82） ng/ml vs.（184.66±14.06 ng/ml）,P＜0.05],GLP-1干预后VEGF水平明显增加（P＜0.05）,尤其是中剂量组,72 h结果相似。结论 GLP-1能促进细胞分泌VEGF从而改善高糖导致的内皮细胞增殖能力下降。     

假体置入患者外周血白细胞Toll样受体2和4的表达

背景：研究证实全髋关节置换后松动假体表面生物膜中表达Toll样受体,但其变化规律尚不清楚。目的：观察关节假体置入患者外周血白细胞Toll样受体2,4的表达。方法：选择关节置换患者和同期10例行关节镜检套患者,于入院次日和假体置入后第3天早晨空腹抽取肘静脉血,流式细胞术分析外周血白细胞中Toll样受体2和Toll样受体4的阳性表达,同时送血样至枪验科检查A细胞、血沉、C-反应蛋白水平。结果与结论：两组白细胞、血沉、C-反应蛋白均在正常范围内。Toll样受体2,4均主要表达于外周血单核细胞,而在外周血淋巴细胞和中性粒细胞的表达率较低;关节置换组术后外周血单核细胞Toll样受体2阳性表达率明显低于术前（P〈O.05）;关节筐换组Toll样受体4、关节镜组Toll样受体2,4手术前后阳性表达率差异无显著性意义（P〉0.05）。关节置换组手术前后外周血单核细胞Toll样受体2阳性表达率低于关节镜组（P〈0.05）,两组Toll样受体4表达率无差异。提示在无感染的情况下,手术本身应激和局部损伤不影响Toll样受体2,4的表达,假体的置入下调了外阍血Toll样受体2的表达。