金黄色葡萄球菌ltaS突变株的构建与eLtaS蛋白的表达

目的通过构建金黄色葡萄球菌（SAU）ltaS突变株以及体外重组表达其胞外形式的eLtaS蛋白,研究LtaS以及eLtaS蛋白在SAU中的生物学功能。方法利用同源重组的方法构建SAU 8325-4来源的ltaS缺失突变菌株,并对其生长以及外毒素水平进行检测;同时,在大肠杆菌中,体外重组表达并纯化eLtaS蛋白,继而观察其对SAU生长的影响。结果在SAU 8325-4中成功构建了ltaS缺失突变菌株,并发现ltaS突变株生长较野生型菌株缓慢;通过表达纯化成功获得高纯度的eLtaS蛋白,其与突变株共培养后对突变株的生长缓慢现象没有回复作用。结论 LtaS蛋白在SAU侵袭机体的过程中发挥着重要的功能,其胞外形式的eLtaS蛋白可能未参与脂磷壁酸（lipotei-choic acid,LTA）的合成。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备

目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）重要的外分泌毒力因子α-溶血素（alpha hemolysin, Hla）,检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用;制备其特异性抗体,并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增hla基因,构建重组表达载体pET-28a-Hla,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,通过Ni2＋柱亲和纯化获得Hla蛋白;通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达,细胞裂解实验表明,纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞,但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。 ELISA结果表明,获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同,为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示;同时所制备的特异性抗体（ anti-Hla）可以抑制Hla的溶血作用,为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌ltaS突变株的构建与eLtaS蛋白的表达

目的通过构建金黄色葡萄球菌(SAU)ltaS突变株以及体外重组表达其胞外形式的eLtaS蛋白,研究LtaS以及eLtaS蛋白在SAU中的生物学功能。方法利用同源重组的方法构建SAU 8325-4来源的ltaS缺失突变菌株,并对其生长以及外毒素水平进行检测;同时,在大肠杆菌中,体外重组表达并纯化eLtaS蛋白,继而观察其对SAU生长的影响。结果在SAU 8325-4中成功构建了ltaS缺失突变菌株,并发现ltaS突变株生长较野生型菌株缓慢;通过表达纯化成功获得高纯度的eLtaS蛋白,其与突变株共培养后对突变株的生长缓慢现象没有回复作用。结论 LtaS蛋白在SAU侵袭机体的过程中发挥着重要的功能,其胞外形式的eLtaS蛋白可能未参与脂磷壁酸(lipotei-choic acid,LTA)的合成。     

金黄色葡萄球菌traP突变菌株的构建和功能研究

目的通过构建traP突变菌株研究RNAⅢ激活蛋白靶蛋白（TRAP）蛋白在金黄色葡萄球菌（SAU）中的功能。方法利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌（SAU）8325-4中构建traP的缺失突变菌株,对其表型和几种压力条件下的生长和生存状况进行检测,揭示其在金黄色葡萄球菌生命活动中的作用。结果在金黄色葡萄球菌8325-4中成功构建了traP的缺失突变菌株,突变株生长缓慢,其他表型如疏水性、表面电荷和生物膜发生了明显的变化;在重金属、过氧化氢,以及全血杀伤等压力条件下的生长和生存状况也发生了明显改变。结论TRAP蛋白在金黄色葡萄球菌侵袭机体的过程中发挥着重要的功能。     

金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM及其C端的表达、纯化与功能研究

目的利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）糖肽水解酶LytM及其C端185～316 aa蛋白（LytM185～316）,检测其生物学活性,并制备多克隆抗体,为检测LytM活性体的天然形式和产生机制以及研究LytM蛋白在SAU感染中的生物学意义奠定基础。方法以SAU 8325-4基因组为模板,PCR扩增lytM及其C端基因,并将其克隆入pET-28a构建重组表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导阳性克隆表达目的蛋白,通过亲和纯化获得目的蛋白LytM及LytM185～316,并制备LytM的多克隆抗体;用薄层层析法测定LytM以及LytM185～316的生物活性,并检测重组蛋白对SAU 8325-4菌体的裂解作用。结果成功构建了表达载体pET-28a-LytM和pET-28a-LytM185～316,获得了纯度较高的重组蛋白LytM及LytM185～316,经测定LytM不能够水解底物而LytM185～316具有较强的糖肽水解酶活性。制备了高效价的抗LytM的多克隆抗体,并证实其可以与LytM及LytM185～316特异性结合。结论只含有C端185～316 aa的重组蛋白能够水解底物,而全长的LytM不具有糖肽水解酶活性。     

基于颜色判定的DNA环介导恒温扩增法快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立基于颜色判定的DNA环介导恒温核酸扩增法（100p—mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP）快速检测金黄色葡萄球菌（SAU）技术。方法利用LAMP法针对SAU特异基因rtUC基因设计7套引物,通过对7套引物扩增效率进行比较得到最佳引物组合来快速检测SAU,采用两种结果判断方法在50min内完成反应。结果LAMP方法检测核酸的最低浓度为7．16pg／μl,灵敏度为PCR法的10倍（PCR法为71．6pg／μ1）,同时采用22种同源或相似菌种进行特异性检测,结果表明具有良好的特异性。结论LAMP方法检测过程简单,实验装置简便,反应结果肉眼可视化辨别,灵敏度高,特异性强,特别适合基层防疫与检疫部门对SAU的快速检测。     

荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

目的利用SmartCycler系统建立一种简便、快速的荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称SAU）的方法。方法根据SAU特异nuc基因设计引物和探针,建立检测体系,并在体系中加入内质控IAC,通过另一个标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC。用SAU6538株污染饮用水和牛奶模拟实际样本,以评价体系的性能。结果以含nuc片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度为5拷贝/μl;以6538株基因组DNA为模板,最低检测限为10fg/μl;用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取DNA为模板,最低检测限为50cfu/ml。建立的定量标准曲线的循环域值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2≥0.998）,PCR效率E≥96.7%。用SAU6538污染饮用水和牛奶模拟实际样本,灵敏度可达5×102cfu/25ml样本。结论所建立的nuc-IAC荧光定量PCR具有内质控IAC,既能定量检测食物是否被污染,又能监测PCR体系,防止假阴性发生或低估病原菌污染量。     

金黄色葡萄球菌Efb蛋白的表达、纯化及功能抗体的制备

目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌外分泌蛋白Efb（extracellular fibrinogen-binding protein,细胞外纤维蛋白原结合蛋白）,检测其生物学活性,并制备其功能性抗体,以探讨Efb蛋白在金葡菌感染中的生物学意义。方法：以金黄色葡萄球菌NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增efb基因,构建重组表达载体pET28a-Efb,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,通过Ni柱亲和纯化获得Efb;通过补体激活试验及竞争ELISA的方法检测Efb蛋白的生物学活性,免疫动物制备抗体。结果：获得了纯度较高的重组Efb蛋白,重组蛋白能够有效抑制CH50以及AH50,并且制备了Efb的功能性多克隆抗体。结论：Efb蛋白能够抑制补体激活的经典途径及替代途径,其特异性抗体能够阻断对于补体激活经典途径的抑制作用。     

耐利福平金黄色葡萄球菌突变株体内选择的临床研究

目的 对耐药突变选择窗（MSW）和金黄色葡萄球菌耐药突变株体内选择的关系进行初步研究。方法 选择前鼻腔携带金黄色葡萄球菌的结核患者为实验组，观察含利福平（RFP）联合化疗方案治疗前及治疗2、4、5周后金黄色葡萄球菌对RFP敏感性的变化，对获得性RFP耐药患者治疗前后分离的菌株进行分子分型。以前鼻腔携带金黄色葡萄球菌的糖尿病患者为对照组。结果 实验组58例患者治疗后有5例前鼻腔携带的金黄色葡萄球菌获得RFP耐药，脉冲场凝胶电泳和蛋白A分子分型结果表明这5例患者携带的菌株不同，但同一患者治疗前后分离的菌株同源。对照组39例患者中无耐药菌株出现。结论 耐利福平的金黄色葡萄球菌突变株的选择性富集是在MSW内完成的。     

金黄色葡萄球菌β-溶血素鞘磷脂酶活性关键氨基酸位点的研究

目的 重组表达金黄色葡萄球菌β-溶血素及其突变体蛋白,研究影响β-溶血素鞘磷脂酶活性的关键氨基酸位点.方法 根据已报道的β-溶血素晶体结构,以金葡菌COL菌株基因组为模板,利用重叠PCR技术对hlb基因进行点突变,构建重组表达载体pET-28a-hlbH-288-N和pET-28a-hlbH-161-A,经IPTG诱导表达目的蛋白,通过Ni2+柱亲和纯化获得蛋白HlbH-288-N、HlbH-161-A及Hlb;利用溶血实验检测Hlb蛋白及两种突变体蛋白的鞘磷脂酶活性.结果 获得纯度较高的HlbH-288-N和HlbH-161-A蛋白;溶血活性实验结果 表明,Hlb和HlbH-161-A蛋白能有效裂解绵羊红细胞(RBC),而HlbH-288-N蛋白不能裂解绵羊RBC.结论 Hlb蛋白第288位组氨酸是影响其鞘磷脂酶活性的关键位点.     

MRSA和鲍曼不动杆菌抗药基因检测及对3种醇类消毒剂抗性研究

目的观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和鲍曼不动杆菌（ABA）对3种醇类消毒剂的抗性与耐药基因携带情况。方法选择最小抑菌浓度（MIC）试验、悬液定量杀菌试验和耐药基因PCR检测方法进行研究,并与标准菌株作平行比较检测。结果 2株MRSA对3种醇的MIC值高于6株鲍曼不动杆菌,稍高于标准菌株6538和8099。杀菌实验结果显示,3种醇对2株MRSA的杀灭对数值均低于标准株6538和8099,对MRSA-1杀灭对数值大于MRSA-2,对6株鲍曼不动杆菌的杀灭对数值大于标准株8099;作用至1 min时,3种醇均能将8099全部杀灭,对6株鲍曼不动杆菌的杀灭对数值D162〈3070122〈3070341〈3040217     

半乳糖凝集素-1的表达纯化与生物活性分析

目的：获得重组人半乳糖凝集素-1（galectin-1）蛋白,并分析其生物学活性。方法：PCR方法扩增目的基因,将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）,获得重组质粒pET-galectin;将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导,获得目的蛋白的表达;采用Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,用红细胞凝集试验分析其生物学活性。结果与结论：成功构建重组原核表达质粒pET-galectin,目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化后,得到的蛋白纯度可达80%以上。红细胞凝集试验结果表明获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,可进一步用于半乳糖凝集素-1功能研究。     

E4F1真核表达载体的构建及与p53的相互作用

目的：构建E4 F1野生型及缺失32～81位氨基酸的真核表达载体,检测其与p53的相互作用及对下游基因p53的调节。方法分别用普通PCR和重组PCR方法从乳腺文库中扩增E4F1野生型编码序列及缺失32～81位氨基酸的突变型序列,分别将其以正确相位构建到pXJ40-MYC载体中,得到重组质粒MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）,分别转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经酶切鉴定并转染293 T细胞, Western印迹检测蛋白的表达。将MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）质粒与FLAG-p53质粒共转染293T 细胞,免疫共沉淀实验检测其相互作用,野生型及缺失突变型表达载体共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测其对下游基因p53的调节。结果 E4F1重组质粒及其突变型构建成功,在293 T细胞中鉴定表达正确,野生型及突变型E4 F1均与p53存在相互作用,突变型的结合能力增强,野生型E4F1升高p21蛋白表达水平,而突变型不改变p21蛋白水平。结论成功构建E4F1野生型及缺失32～81位氨基酸的突变型真核表达载体,二者都能与p53相互作用且突变型结合能力更强,野生型E4F1升高基因p53的靶基因p21的蛋白表达水平,而突变型不改变靶基因p21的蛋白水平。该研究为进一步研究E4 F1对p53的调节及其机制奠定了基础。     

烧伤患者血培养菌谱调查及耐药性分析

 目的 分析我院烧伤患者血培养阳性标本病原菌分布情况及主要病原菌耐药性特点,为临床合理应用抗菌药物提供依据.方法 采用细菌、真菌常规生化编码方法进行细菌、真菌鉴定,用K-B纸片法监测其耐药率.结果 送检的968例血培养标本中,检出病原菌149株,阳性率为15.39 %.其中,革兰阳性球菌83株,占55.70%,革兰阴性杆菌60株,占40.27%,真菌6株,占4.03%;分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)57株,占93.44%;耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)11株,占84.62%.金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、复方磺胺甲唑及头孢类都有很高的耐用性;凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)对万古霉素、阿米卡星有较好的敏感性.分离出的8株肠球菌中HLAR占87.50%,有很高的耐药性.非发酵菌对头孢菌素、庆大霉素、阿米卡星、复方磺胺甲唑都有很高的耐药性.结论 烧伤患者血培养病原菌主要有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和凝固酶阴性葡萄球菌,且以耐药株为主.     

18F-FP-peptide用于化疗后肿瘤细胞凋亡显像

目的 研发含天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)核心的正电子核素标记的caspase-3多肽活性显像剂,以在体检测肿瘤细胞凋亡.方法 用国产合成模块通过点击化学合成( 18S,21S,24S,27S,30S)-27-(2-羧乙基)-21-(羧甲基)-30-( (2S,3R,4R,5R,6S)-6-((2-(4-(3-[18F]氟戊基)-1H-1,2,3三唑-1-yl)乙酰氨基)甲基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酰氨)-24-异丙基-18-甲基-17,20,23,26,29-五羰基-4,7,10,13-四氧-16,19,22,25,28-五氨杂三十烷-1,32-二酸(18 F-FP-peptide).在体外18F-FP-peptide与经卡铂化疗的A549肺癌细胞混合60 min后,检测细胞放射性摄取率,摄取率=(放射性活度平均值×10×100％)/(细胞计数×细胞体积×放射性对照值).将18F-FP-peptide注射到经卡铂化疗的荷A549肿瘤小鼠体内,60 min后测其生物学分布,并行micro PET/CT显像.应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,评价18 F-FP-peptide放射性摄取率与细胞凋亡率的相关性.数据处理使用SPSS 13.0统计软件,计量资料采用x-±s表示,组间比较采用单因素方差分析,相关性研究采用线性相关与回归分析.结果 18 F-FP-peptide的合成效率为(21.0±4.5)％(n=6,不校正),放化纯为99％,比活度为870 GBq/μmol.体外细胞实验研究表明,各组细胞凋亡率随卡铂化疗时间延长逐渐升高,经卡铂处理后0、1、2和24h后细胞凋亡率分别为(1.02±0.31)％、(4.85±1.26)％、(6.37±2.21)％和(10.23±2.43)％,对应的细胞摄取率分别为(0.06±0.01)％、(0.31±0.04)％、(0.44±0.02)％和(0.86±0.04)％,各组细胞凋亡率与放射性摄取率之间呈明显正相关(y=1.1244+11.0949x,r=0.9850,P＜0.01);荷A549肿瘤卡铂化疗后24h,肿瘤组织放射性摄取率为(0.33±0.02) ％ID/g,明显高于未化疗肿瘤组织的(0.08±0.01) ％ID/g(F=31.25,P＜0.01);而两者的细胞凋亡率分别为(15.50±1.47)％和(1.92±0.31)％,差异有统计学意义(F=33.54,P＜0.01);荷A549肿瘤化疗后细胞凋亡率和肿瘤对18 F-FP-peptide的放射性摄取率呈明显正相关(y=-1.9055+54.4341x,r=0.9907,P＜0.01);Micro PET显像示,未经化疗的肿瘤基本无放射性摄取,SUVmax与对侧比值为1.32±0.01,而经卡铂化疗的肿瘤明显摄取显像剂,SUVmax与对侧比值为3.46±0.02,两者比较差异有统计学意义(F=11.05,P＜0.01).结论 18F-FP-peptide是有临床潜在价值的caspase-3 活性显像剂.     

质粒介导的耐多药大肠埃希菌CTX-M、CTX-M-3基因检测

目的了解泸州本地质粒介导的耐多药大肠埃希菌的CTX M、CTX M 3基因分布情况。方法用K-B法进行耐药菌株筛选,PCR扩增CTX M、CTX M 3基因,琼脂糖凝胶电泳检测基因大小,阳性产物外送测碱基序列。结果 71株大肠埃希菌中,有一株死亡。全敏6株,占8.57%,单耐16株,占22.86%,双耐18株,占26.71%,耐多药30株,占42.86%。耐多药质粒中的阳性结果经DNA测序仪检测基因序列,与已知的基因相比较,CTX M有23株,占76.67%,CTX M 3有21株,占70%。两种基因均含有的有12株,占40%。结论泸州地区耐多药大肠埃希菌存在质粒介导的CTX M、CTX M 3基因,耐多药的大肠埃希菌对第三代头孢菌素中的头孢唑肟敏感,对亚胺培南,美罗培南较敏感。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。