一种新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、序列分析和克隆

目的免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,为猪囊尾蚴病临床免疫学诊断提供新的候选抗原分子。方法利用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,测序后与生物信息网站进行分析,并将一个类似血吸虫核糖体蛋白的基因克隆入PMD-18T载体。结果从cDNA文库中筛选出1个编号为5H的基因,长度是528bp;对其编码的氨基酸序列的分析显示其与日本血吸虫的L18a核糖体蛋白具有高度同源性。结论克隆了猪囊尾蚴的未知核糖体蛋白基因。     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

猪囊尾蚴抗原基因GP50的表达及鉴定

目的为了寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子,克隆猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并进行表达、鉴定。方法设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴抗原GP50基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,然后在真核表达载体pBKCMV中亚克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约897bp的特异性片段,克隆质粒pGEM-GP50和真核表达质粒pBKCMV作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约36kDa大小的融合蛋白条带,Western blot结果显示其可与猪囊尾蚴病人血清起反应。结论本实验成功地克隆了猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并在原核细胞中进行了表达及鉴定,为进一步的免疫诊断研究奠定了基础。     

五条蚋细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的生物信息学分析

以五条蚋基因组DNA为模板PCR扩增其COⅠ基因序列,将所得片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆。经PCR与双酶切鉴定,获得阳性重组质粒pMT18-T-COⅠ,测序后作序列分析和同源性比较。结果表明,从五条蚋DNA中扩增出COⅠ基因及5′端tRNA-Tyr基因和3′端tRNA-Leu基因部分片段共1 621 bp,其中COⅠ基因序列长度为1 542 bp(GenBank登录号为DQ534949),与预期相符,该基因开放阅读框编码513个氨基酸,编码蛋白等电点为5.84,相对分子质量为M_r5 650,具有COⅠ基因的核心保守结构域。与GenBank已知基因(登录号为AY251520)的序列一致性为99%。     

日本血吸虫大陆株泛蛋白缀合酶E(SjUCEE)基因的A-T克隆

目的　日本血吸虫中国大陆株泛蛋白缀合酶 E (ubiquitin- conjugating enzyme E ,Sj UCEE)的基因克隆和鉴定。方法　特定寡核苷酸引物 PCR扩增目的基因 ;应用分子克隆常规操作方法将扩增产物克隆至载体 pu Cm - T中。结果　 PCR特异性扩增出 Sj UCEE编码区基因序列 ,其片段大小为 75 7bp;经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的质粒 pu Cm - T/Sj UCEE中含有所扩增的基因序列。结论　 PCR扩增的 Sj U CEE抗原编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含目的基因的原核质粒 pu Cm- T/Sj U CEE     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌(Bb)(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。方法用疏水甘氨酸接头连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成方法合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因。将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18。电穿孔法将该质粒导入Bb,构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果全基因合成789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段。从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到4 944bp的pGEX-1λT载体片段和789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,与预期结果相符;以该重组质粒为模板进行PCR扩增得到789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,经测序基因片段为789bp,与预期大小相符。结论成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

猪囊尾蚴cDNA文库的筛选与重组蛋白的初步鉴定

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中免疫学筛选阳性蛋白的编码基因,以期获得囊尾蚴病新的免疫学诊断候选分子。方法免疫学筛选cDNA文库,用PCR法扩增出猪囊尾蚴候选蛋白基因编码序列,T载体连接,鉴定后将其亚克隆入pET28a(+)载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果通过cDNA文库免疫筛选、测序和EXPASY软件分析,其一个684bp ORF DNA序列为新基因(命名为Ts1),录入号为EU009656;将Ts1基因克隆入pET28a(+)载体中诱导表达,可得到一分子量约28.0kDa融合蛋白,并能被囊尾蚴病人血清识别。结论本试验成功筛选、克隆出一个新囊尾蚴编码基因,并在原核细胞中表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

猪囊尾蚴Ts2基因的免疫筛选克隆及生物信息学分析

目的筛选并分析猪囊尾蚴新基因,为猪囊尾蚴病患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原及有效的疫苗候选分子。方法用猪囊尾蚴病患者血清抗体筛选猪囊尾蚴cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片段进行扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果筛选阳性克隆,经分析具有738bp完整开放阅读框,是1个新基因,登录号EU221317,命名为Ts2。结论成功克隆了猪囊尾蚴Ts2基因片段,为进一步实验提供了条件。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

猪带绦虫抗原基因TS76的克隆及原核表达

目的　测定和分析自猪囊尾蚴表达型cDNA文库中筛选出的cDNA克隆 (TS76 )的序列 ,并进行该片段的原核表达研究。方法　采用PCR扩增重组 (噬菌体 (TS76中的TS76cDNA片段 ,亚克隆至 pUC18,得到的重组子用于测序 ,并对测定结果进行分析及同源性比较 ;将TS76片段亚克隆到原核表达载体pGEX - 1(T中 ,免疫印迹方法筛选得到能正确表达TS76片段的重组子 pGTS76 ;制备pGTS76原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS -PAGE和Westernblotting分析。 结果　TS76克隆含 5 16对核苷酸 ,编码含 83个氨基酸残基的多肽 ,与EMBL数据库中的猪囊虫免疫原性蛋白质mRNA有 383bp的同源区域。重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为 34KD ,能与抗猪囊尾蚴兔血清产生很强的免疫反应。结论　分离到一个编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的基因。