斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达

目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b( )表达载体，利用SDS-PAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA，经RT—PCR扩增及T／A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对。根据已获得的序列和pET22b( )载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T／A克隆，阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b( )载体连接并转化至BL21(DE3)菌株，收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果SDS-PAGE显示，经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异，但经诱导表达的阳性克隆菌株的22ku蛋白条带比另两菌株明显，免疫印迹证实，该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应。结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b( )载体，经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应。     

斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆及由体定位

目的克隆斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,并研究该酶在斯氏狸殖吸虫的表达部位。方法通过RT-PCR方法扩增斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,TA克隆入pUCm-T载体,鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其编码氨基酸序列,并比较分析与其相关虫种半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性。采用地高辛标记原位杂交技术检测该酶基因在斯氏狸殖吸虫成虫的表达及组织定位。结果经RT-PCR和对阳性克隆鉴定、测序后获得一cDNA序列,长495bp;同源性分析结果显示,该序列与相关虫种的半胱氨酸蛋白酶存在较高同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。原位杂交结果显示斯氏狸殖吸虫成虫的肠管上皮呈阳性着色。结论克隆获得了斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶的表达部位主要为肠管上皮。     

斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆及由体定位

目的 克隆斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,并研究该酶在斯氏狸殖吸虫的表达部位。方法 通过RT-PCR方法扩增斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,TA克隆入pUCm-T载体,鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其编码氨基酸序列,并比较分析与其相关虫种半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性。采用地高辛标记原位杂交技术检测该酶基因在斯氏狸殖吸虫成虫的表达及组织定位。结果 经RT-PCR和对阳性克隆鉴定、测序后获得一cDNA序列,长495bp;同源性分析结果显示,该序列与相关虫种的半胱氨酸蛋白酶存在较高同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。原位杂交结果显示斯氏狸殖吸虫成虫的肠管上皮呈阳性着色。结论 克隆获得了斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶的表达部位主要为肠管上皮。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆和表达

目的　克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并进行原核表达。方法　利用简并引物 ,进行RT -PCR ,扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入 pUCm -T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。将获得的cDNA片段克隆入Pin PointTMXa- 1T表达载体 ,经过筛选后 ,在大肠杆菌中进行原核表达。通过SDS -PAGE电泳和Westernblot方法鉴定表达产物 ,并检测所表达融合蛋白的免疫反应性。结果　RT -PCR扩增出了一 5 0 0bp左右的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 98bp。推导出的氨基酸序列长 16 6 ;氨基酸序列的同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺残基高度保守。原核表达中 ,对表达产物的鉴定结果和免疫反应性检测结果均显示 ,目的克隆在 33kDa处有一明显条带。结论　本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,其序列中包含了与该酶活性有关的重要位点。原核表达获得一 33kDa的融合蛋白 ,该融合蛋白具有免疫反应性。     

日本血吸虫与斯氏狸殖吸虫交叉抗原的筛选和鉴定

目的筛选和鉴定可与斯氏狸殖吸虫病患者血清产生交叉反应的日本血吸虫成虫抗原或其排泄分泌（ES）抗原组分,为筛选血吸虫病特异性诊断抗原奠定基础。方法首先采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离日本血吸虫成虫蛋白和ES蛋白,然后采用Western blot鉴定其中能够与斯氏狸殖吸虫病人血清反应的蛋白条带,最后取下对应的阳性条带进行质谱检测,对该蛋白进行分析和鉴定。结果成功采用SDS-PAGE对日本血吸虫成虫蛋白和ES蛋白进行了分离。Western blot结果显示,在ES蛋白中出现了一阳性条带,分子量约为53kDa;质谱检测结果显示该蛋白为未知蛋白。结论日本血吸虫成虫ES成分中的53kDa蛋白可能是日本血吸虫和斯氏狸殖吸虫的交叉抗原。     

斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白质分析

目的分析和检测斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原的特异抗原组分,为建立特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供理论基础。方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳(Two-dimension-al gel electrophoresis,2-DE)和免疫印迹(Western blot)等方法,对斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原进行分析。结果SDS-PAGE分离出22条蛋白带,其中主带8条,分子质量单位为13~64 ku,未见65 ku以上条带。Western blot显示20条显色带,主带6条,分子质量单位分别为13、18、22、28、35和64 ku。2-DE电泳分离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原48个多肽斑点,分子质量单位为14~70 ku,绝大部分分布于pI 3.10~7.14,少数分布于pI 8.78~9.85,在pI 7.14~8.78之间几乎未见多肽斑点。Western blot分析出其中的10个主要多肽斑点能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为集中在酸性区域的小分子多肽。结论斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经SDS-PAGE电泳分离出的22条蛋白带中,有6条蛋白含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别。2-DE电泳分离出的48个多肽斑点中,有10个含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为偏酸性的小分子多肽。     

斯氏狸殖吸虫抗原分析和血清学诊断方法的研究

[目的 ]分析斯氏狸殖吸虫囊蚴、童虫和成虫各期抗原和建立特异性抗原的斯氏狸殖吸虫病血清学诊断方法。 [方法 ]用SDS PAGE分离斯氏狸殖吸虫的各虫期抗原 ,经免疫印迹识别成虫期特异性诊断抗原。采用电洗脱技术分离 10～ 30kDa蛋白组分 ,建立纯化抗原的dot ELISA血清学诊断斯氏狸殖吸虫病。 [结果 ]斯氏狸殖吸虫病患者血清与成虫抗原的 10～ 30kDa显示较多免疫识别带 ,主带为 2 2、2 4和 2 6kDa。与血吸虫病和华支睾吸虫病患者血清的交叉反应带出现于 6 0～ 90kDa。斯氏狸殖吸虫成虫 10～ 30kDa抗原的dot ELISA与成虫粗抗原的ELISA检测 2 8例疑诊病人血清 ,两法阳性率间差异无显著性。而检测 38例感染其它吸虫和肺部疾病患者血清 ,粗抗原的ELISA交叉反应率为 13 2 % (5 /38)。 [结论 ]斯氏狸殖吸虫成虫 10～ 30kDa抗原的dot ELISA为斯氏狸殖吸虫病高度特异和敏感的血清学诊断方法。     

衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能.方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测.结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确.SDS-PAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右.结论 经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础.     

斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白质分析

目的分析和检测斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原的特异抗原组分。为建立特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供理论基础。方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）、双向电泳（Two—dimensional gel eleetrophoresis，2-DE）和免疫印迹（Western blot）等方法，对斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原进行分析。结果SDS-PAGE分离出22条蛋白带，其中主带8条，分子质量单位为13～64ku，未见65ku以上条带。Western blot显示20条显色带，主带6条，分子质量单位分别为13、18、22、28、35和64ku。2-DE电泳分离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原48个多肽斑点，分子质量单位为14～70ku，绝大部分分布于pI3．10～7．14，少数分布于pI8．78～9．85，在pI7．14～8．78之间几乎未见多肽斑点。Western blot分析出其中的10个主要多肽斑点能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别，大部分为集中在酸性区域的小分子多肽。结论斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经SDS-PAGE电泳分离出的22条蛋白带中，有6条蛋白含量较高，能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别。2-DE电泳分离出的48个多肽斑点中，有10个含量较高，能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别，大部分为偏酸性的小分子多肽。     

一维和二维电泳分析斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原

人不是斯氏狸殖吸虫的适宜宿主，幼虫寄生后可引起多种肺外型感染，病原学检查困难［1］，临床诊断主要依靠免疫学检查，除检测方法外,诊断用抗原的特异性是影响检测效果的关键因素。故分析和检测并殖吸虫的特异抗原组分，在并殖吸虫病的免疫诊断和抗原的分离纯化方面均具有重要意义。本文采用一维、二维电泳和免疫印迹技术分析斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原，试图鉴别特异的、高免疫原性斯氏狸殖吸虫蛋白和多肽，为开发特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供参考资料。     

模拟抗原表位基因测定及合成多肽的血吸虫病诊断价值的研究

目的测定能用于血吸虫病诊断及疗效考核的噬菌体展示肽基因序列,研究合成多肽抗原的血吸虫病诊断价值.方法扩增目的噬菌体,制备和纯化噬菌体DNA,对目的噬菌体中外源性肽的基因序列进行测定和演绎氨基酸序列分析.根据血清反应强度和演绎氨基酸序列选择2个噬菌体的展示肽段进行人工多肽合成.以合成的多肽为抗原,建立血吸虫病诊断方法,检测急、慢性血吸虫病人血清,观察方法的敏感性及特异性;同时检测治疗前及治愈后的血吸虫病人血清,观察该合成抗原的血吸虫病疗效考核价值.结果测定了14个噬菌体展示外源肽的基因序列,序列分析表明,其中有6个噬茵体的外源肽基因序列完全相同,其余8个噬菌体展示肽的基因序列不相同.分析演绎氨基酸序列,发现1个噬菌体展示肽中的3个连续的氨基酸(GVK)残基与血吸虫23 kDa分子氨基酸残基相同.合成多肽抗原检测急、慢性血吸虫病人血清,敏感性分别为92.3%和91.1%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为7.5%,检测健康人血清,特异性为95.5%.检测治愈后0.5年的同一病人血清,阴转率为55.3%,治愈后1年的病人血清中IgG抗体的阴转率为63.2%.结论 9个具有血吸虫病诊断价值的噬菌体展示表位的基因序列被确定,并证明了合成多肽抗原有较好的血吸虫病诊断及疗效考核价值.     

EVOLUTION OF FITNESS, V. RATE OF EVOLUTION OF IRRADIATED POPULATIONS OF Drosophila

Measurable evolution occurs in laboratory populations of Drosophila under strong natural selection. The rate of adaptation to the experimental environment is significantly greater in populations with genetic variability increased by radiation than in the control, nonirradiated populations.     

内镜下Oddi括约肌测压的临床意义

为观察胆石症、胆囊切除术后等胆系疾病及功能性消化不良（ＦＤ）、糖尿病胃轻瘫（ＤＧＰ）等非胆系疾病Ｏｄｄｉ括约肌（ＳＯ）功能变化，通过内镜采用灌注式高分辨多道胃肠功能测定仪，对１５例胆系疾病患者、１３例非胆系疾病患者进行Ｏｄｄｉ括约肌测压。结果显示，胆系疾病组的胆总管压力、ＳＯ基础压及蠕动波振幅明显高于非胆系疾病组（６．８６±０．６３ｋＰａ与１．２７±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；７．３１±０．９５ｋＰａ与１．８７±０．１６ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３２．００±１．２ｋＰａ与２４．１４±１．５ｋＰａ，Ｐ＜０．０５）；同时，非胆系疾病组的十二指肠压、ＳＯ蠕动频率及间期较胆系疾病组明显降低、减慢及延长（１．４２±０．２６ｋＰａ与０．３０±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３．６±１．２次／分与２．２±０．４次／分，Ｐ＜０．０５；７．４±１．２秒与１１．０±１．８秒，Ｐ＜０．０５）。结果显示，无论是胆系疾病还是ＦＤ及ＤＧＰ等非胆系疾病均有ＳＯ功能紊乱，但表现形式相反，对指导临床诊断与治疗有一定价值。     

血吸虫病疫苗研究进展

在全球范围的传染病中 ,寄生虫的感染率可能要超过其它任何病原所致的感染 ,而血吸虫在许多方面都是一种不寻常的寄生虫 ,如雌雄异体、性染色体异配 ,寄生于宿主的门脉系统及有性和无性生殖的生活史等 ,这些特点 ,使其成为医学和兽医学中研究最为深入的虫种之一。据统计 ,目前大概有 2 - 3亿人有血吸虫感染 ,全球有 74个国家 6亿左右的人口受到血吸虫病的威胁 ,尽管已有不少血吸虫病的防治经验 ,但要把人畜共患的血吸虫病危害减至最少 ,仍有相当长的一段路要走。我国 5 0年来的血吸虫病防治工作虽然取得一定成效 ,但并未得到彻底控制 ,究其…     

PATHOGENESIS OF HYPERCALCAEMIA OF MALIGNANCY

The hypercalcaemia of malignancy is multi-factorial, even within individual tumours. In most cases, hypercalcaemia is due to a combination of increased bone resorption associated with decreased renal capacity to excrete the increased extracellular fluid calcium. In solid tumours such as carcinoma of the lung, tumour-derived growth factors are probably primarily responsible for the increased bone resorption, and a separate family of factors which interact with some parathyroid hormone (PTH) receptors cause increased renal tubular calcium reabsorption. PTH production by non-parathyroid tumours rarely if ever occurs. In contrast, haematological malignancies such as myeloma and T-cell lymphomas produce locally acting bone resorbing lymphokines in excessive amounts. Some T-cell lymphomas in addition have the capacity to metabolize 25-hydroxyvitamin D to 1,25-dihydroxyvitamin D. In myeloma, impaired glomerular filtration frequently contributes to the pathogenesis of hypercalcaemia by impairing renal compensatory mechanisms for maintaining normal serum calcium concentrations in the presence of increased bone resorption.