遗传性因子Ⅴ缺乏症的基因研究

研究了一个遗传性凝血因子V（FV）缺乏症重型患者的基因缺陷，方法：采用RT－CPR及PCR技术，对先证者FV cDNA序列全长和基因组DNA中第11和第13外显子的序列进行了PCR扩增，PCR产物回收纯化后直接测序，结果：对先证者FV基因组DNA的部分序列的PCR扩增，经DNA测序，发现有两个基因突变位点，其中2863G→A为中性多态性位点，另一个3366C→G为突变，对先证者FV cDNA序列全长进行分段扩增均未见目的条带，结论：推测先证者FV缺乏可能为FV基因某种新的突变导致mRNA不稳定或转录调控异常所致。     

遗传性第Ⅴ因子缺乏症血小板第Ⅴ因子活性分析

凝血第 Ｖ因子（ＦＶ）是分子质量为 ３３０ｕ的单链糖蛋白，正常人约７５％存在于血浆中，其余的２５％存在于血小板α颗粒中。活化的第Ｖ因子（ＦＶａ）作为辅因子，与活化的第Ｘ因子（ＦＸａ）、钙离子及磷脂共同构成凝血酶原酶复合物，参与凝血酶原的活化，是一种重要的凝血因子［１］。遗传性 ＦＶ缺乏症是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，近年发现，其出血症状的严重性与血浆中ＦＶ水平并不平行，而与血小板中 ＦＶ活性高低有更密切的关系［１］。有关血小板中ＦＶ的测定，国内尚未见报道。我们采用发色底物法，对一个遗传性…     

一例遗传性凝血因子V缺乏症发病机制研究

目的 研究遗传性凝血因子V（FV）缺乏症的发病机制。方法 通过免疫学方法和发色底物法检测血浆和血小板中的FV含量,采用PCR产物直接测序和限制性酶切分析FV基因,应用分子模建对所鉴定突变的生物结构病理学进行研究。结果 先证才血浆和血小板中FV均缺乏。先证者FV基因第1763位核苷酸存在A→C突变（1763A→C,EMBL AJ297254）。模建分析表明,该突变将导致分子内部形成空洞,并可能破坏Tyr530与Glu330之间形成的氢键。结论 1763A→C突变将导致FV稳定性降低,是致病的重要原因。     

新的双重杂合性FⅤ基因突变导致的重型遗传性FⅤ缺陷症

目的　对一个遗传性凝血因子Ⅴ (FⅤ )缺陷症家系进行FⅤ基因突变的检测。方法　用活化部分凝血活酶时间(APTT),凝血酶原时间 (PT)及FⅤ促凝活性 (FⅤ∶C)和FⅤ抗原 (FⅤ∶Ag)测定进行表型诊断;用PCR法对先证者FⅤ基因 25个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果　先证者APTT249. 2s,PT46. 6s,TT17. 9s, Fg3. 42g/L, FⅤ∶C0. 1%,FⅤ∶Ag1. 5%, FⅡ∶C99%, FⅦ∶C110%、FⅧ∶C95%、FⅨ∶C88%、FⅩ∶C120%、vWF121%;FⅤ外显子区共发现 4个与基因文库Z99572序列不同的位点,其中位于exon13区的杂合性 2238 ~2239delAG导致移码突变和终止密码子的提前出现(Asp689stop), 位于exon23区的杂合性G6410T错义突变导致Gly2079Val。家系分析表明前者遗传于母亲,后者遗传于父亲。结论　2238~2239delAG导致的移码突变和G6410T导致的错义突变,是导致先证者FⅤ缺陷的原因。这是 2个导致遗传性FⅤ缺陷症的新的FⅤ基因突变位点。     

五例遗传性凝血因子V缺陷症的基因分析

目的 分别对5例遗传性凝血因子V(FV)缺陷患者进行基因分析和家系调查,鉴定导致FV缺陷症的基因突变.方法 采用一期法检测血浆FV活性,ELISA法检测血浆FV的抗原含量,PCR法扩增FV基因的25个外显子及其侧翼序列,DNA测序并与基因文库比对以确定基因异常,限制性内切酶酶切分析或直接测序患者直系家属及正常人相应的等位基因排除多态性影响.结果 5例患者血浆FV活性和抗原含量均明显降低,基因分析共发现6个致病突变,分别为G69969T(G2079V)、C45533T(R712Ter)、C46796T(R1133Ter)、G45366A(C656Y)、C46253T(R952C)及G16088C(D68H),后3个是新的突变位点,其中C46253T(R952C)是国际上首次发现的位于B区的错义突变.通过对直系亲属和正常人相应的等位基因进行扩增测序或酶切分析证实了3个新的突变不是基因多态性所致.结论 鉴定了5例Ⅰ型遗传性FV缺陷症的基因突变,其中包括2种无义突变和4种错义突变;错义突变导致FV蛋白稳定性降低,引起血浆中FV的含量减少.     

凝血因子Ⅴ突变对妊娠的影响

凝血因子Ⅴ突变是近年发现的一种基因点突变，在西方人群中有较高的发生频率，表现为激活的蛋白质Ｃ抵抗，本文综述ＦⅤ突变对妊娠的影响。     

先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的分子发病机制

先天性凝血因子Ⅴ缺陷症是一种少见的常染色体隐性遗传性出血性疾病,其出血症状的异质性较大,人们对其分子发病机制知之甚少.近年来随着FⅤ基因的破析,使人们有可能在分子水平对先天性Ⅴ因子缺乏症进行研究,并发现了多种FⅤ基因的突变形式.这将有利于阐明先天性因子Ⅴ缺陷症临床表现的差异并最终治愈这一疾病.     

四个遗传性凝血因子V缺陷症家系临床表型和基因型变化的研究

目的 研究4个遗传性凝血因子V(FV)缺陷症家系的临床表型和基因突变.方法 测定家系成员活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及FV促凝活性(FV:C)和FV抗原(FV:Ag)含量进行表型诊断;用PCR法扩增先证者F5基因的25个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.结果 4例先证者APTT、PT明显延长,血浆FV:C和FV:Ag含量均显著降低.基因分析发现,先证者1的F5基因存在G16088C(Asp68His)杂合错义突变及4种位于同一条染色体上的杂合多态性T35788C(Met385Thr)、A47295G(Hisl299Arg)、A58668G(Metl736Val)和A74083G(Asp2194Gly);先证者2的F5基因存在CA6253T(Arg952Cys)和CA6724T (Glnl 109stop)两种纯合突变;先证者3的F5基因存在C67793G(Pr02006Ala)纯合错义突变;先证者4的F5基因存在C74022T(Arg2174Cys)纯合错义突变.结论 Asp68His、Arg952Cys、Glnl109stop、Pro2006Ala和Arg2174Cys这5种突变,及Met385Thr、Hisl299Arg、Metl736Val和Asp2194Gly这4种多态性是导致相应先证者I型遗传性FV缺陷症的原因.其中,Glnl109stop、Pro2006Ala和Arg2174Cys是国际七首次报道的新突变.     

缺因子Ⅱ、Ⅴ的两种基质血浆测定Ⅱ∶C、Ⅴ∶C及其临床意义

本文使用缺因子Ⅱ、Ⅴ的两种基质血浆测定Ⅱ:C、Ⅴ:C。结果发现:枸橼酸钠抗凝血浆于-30℃保存一周后Ⅱ:C、Ⅴ:C不下降,而草酸钠抗凝血浆其活性分别下降10％,20％。不同实验室的兔脑粉对Ⅱ:C、Ⅴ:C结果影响很大,不能比较。55例正常献血员Ⅱ:C为111.07±38.55％;40例Ⅴ:C为83.07±20.9％。肝硬化Ⅱ:C、Ⅴ:C及口服抗凝剂者Ⅱ:C明显下降,P<0.001。急性非淋巴细胞白血病临床无出血者Ⅱ:C、Ⅴ:C接近正常。     

凝血因子Ⅴ及凝血因子Ⅷ联合缺陷患者四例的基因诊断

目的 对4例FⅤ及FⅧ联合缺陷患者及其家系成员进行基因诊断及分子发病机制研究.方法 测定先证者及家系成员APTT、PT、FⅧ:C及FⅤ:C等进行表型诊断;采用凝血酶生成试验检测先证者及健康对照者的凝血酶生成情况;Tiangen试剂盒法抽提先证者及家系成员全血基因组DNA;平衡酚-乙醚法抽提羊水DNA;PCR扩增4例先证者及家系成员的LMAN1基因及MCFD2基因,用末端标记双脱氧法检测核酸序列查找基因突变.结果 先证者1的APTT显著延长,为88.2 s,PT 延长至19.6 s,FⅧ:C降至24.2%,FⅤ:C为9.1%.先证者2与先证者3为亲姐妹,两人的APTF均明显延长,分别为71.6 s及74.6 s,PT分别延长至22.1 s及18.3 s,FⅧ:C均降低,分别为25%及19.6%,FⅤ:C分别降至7.6%及14.5%.先证者4的AFTT及PT均延长,分别为70.3 s及18.2 s,其FⅦ:C降至15.7%,FV:C降至9.4%,4例先证者的其余实验室表型检测指标均正常,临床诊断为FⅤ及FⅧ联合缺陷性疾病.对先证者1进行LMAN1及MCFD2基因直接测序,显示其LMAN1基因存在双杂合突变:突变1位于第8号外显子,为插入突变:nt912insA(X71661.1),导致第305位氨基酸发生移码突变,并在编码20个氨基酸后终止,其母亲该位点亦为杂合突变;先证者1的另一个杂合突变位于第11号外显子:nt1366C>CT(X71661.1),导致第456位精氨酸发生无义突变(p.Arg456X),其父亲及胎儿该位点均为杂合突变.先证者1及其父母的MCFD2基因测序均未发现突变.先证者2及3的LMAN1基因测序均未发现突变,MCFD2基因直接测序检测发现两者均在该基因的第4号外显子处存在1个纯合突变:nt411T>C(NM_139279),导致第136位异亮氨酸突变成苏氨酸(p.Ile136Thr).先证者2的女儿该位点为杂合突变.先证者4的LMAN1基因测序显示其在该基因的第5号外显子存在1个纯合突变:nt615C>T,导致第202位的精氨酸无义突变;其MCFD2基因测序未发现突变.凝血酶生成试验检测显示4例FⅤ及FⅧ联合缺陷患者的凝血酶生成潜力较健康对照者均有不同程度的下降.结论 先证者1是由LMAN1基因的双杂合突变nt1366C>CT及nt912insA引起,突变分别遗传自其父亲及母亲,对其母亲进行产前基因诊断发现胎儿为1名女性携带者,该胎儿遗传了其父亲的1个杂合突变nt1366C>CT.先证者2及3是由MCFD2基因上的纯合突变(nt411T>C,p.ne136Thr)所导致的.先证者2的女儿遗传了其母亲的一个杂合突变,为携带者.先证者4是由LMAN1基因的纯合无义突变(nt615C>T,p.Arg202X)所导致的.     

人血浆凝血因子V双抗体夹心ELISA测定

目的建立一种新的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),以测定人血浆凝血因子V(FV)抗原含量.方法采用兔抗人FV抗体为包被抗体,FV单抗为检测抗体,首次对中国正常人(n=26)和一个遗传性FV缺乏家系的有关成员血浆中的FV抗原进行了检测.结果所建方法线性范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好,与FV活性测定有很好的相关性;正常人血浆FV抗原呈偏态分布;FV缺乏家系纯合子血浆FV抗原量只有正常人的2%,证实该家系为Ⅰ型遗传性FV缺乏症.结论该法是一种较好的FV蛋白定量测定法,可以对FV缺乏症进行辅助诊断和分型.     

血浆凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和抗凝血酶Ⅲ在2型糖尿病早期干预中的应用

<正>2型糖尿病属于一组代谢性紊乱性疾病,极易发生血管并发症,累及冠状动脉、眼底静脉等很多重要组织及器官血管,因此具有极高的致残率及死亡率[1]。针对这一情况,对糖尿病患者血管病变的发生进行有效地防止具有极为重要的临床意义。为此须对患者的血液高凝状态及血栓形成进行有效的预防。有研究[2-3]表明,血浆凝血因子Ⅴ(FV)、凝血因子Ⅷ(FVⅢ)、纤维蛋白原(FBG)、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)与血栓形成及血液高凝     

人血浆凝血因子V双抗体夹心ELISA测定

目的 建立一种新的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），以测定人血浆凝血因子V（FV）抗原含量。方法 采用兔抗人FV抗体为包被抗体，FV单抗为检测抗体，首次对中国正常人（n=26)和一个遗传性FV缺乏家系的有关成员血浆中的FV抗原进行了检测。结果 所建方法线性范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好，与FV活性测定有很好的相关性；正常人血浆FV抗原呈偏态分布；FV缺乏家系纯合子血浆FV抗原量只有正常人的2％，证实该家系为I型遗传性FV缺乏症。结论 该法是一种较好的FV蛋白定量测定法，可以对FV缺乏症进行辅助诊断和分型。     

一例遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症发病机制研究

目的研究遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺乏症的发病机制.方法通过免疫学方法和发色底物法检测血浆和血小板中的FⅤ含量,采用PCR产物直接测序和限制性酶切分析FⅤ基因,应用分子模建对所鉴定突变的生物结构病理学进行研究.结果先证者血浆和血小板中FⅤ均缺乏.先证者FⅤ基因第1?763位核苷酸存在A→C突变(1?763A→C,EMBL AJ297254).模建分析表明,该突变将导致分子内部形成空洞,并可能破坏Tyr530与Glu330之间形成的氢键.结论 1?763A→C 突变将导致FⅤ稳定性降低,是致病的重要原因.     

遗传性凝血因子V缺乏1例

目的:通过对遗传性凝血因子V(FV)缺乏患者诊疗过程的介绍为临床提供对凝血功能异常患者的诊断思路。方法:对一例APTT明显延长伴出血体征患者进行APTT血浆纠正试验,依据纠正试验结果进行血浆蛋白C(PC)、血管性假血友病因子(vWF)及相关凝血因子活性检测。结果:APTT血浆纠正实验(即刻和37℃2h)均纠正;PC活性为96%,vWF抗原、活性为145.6%、134%,均提示正;凝血因子活性检测提示FV活性为:2.5%,明显降低,其它因子活性无异常。结论:血浆纠正试验为凝血功能异常患者的临床诊断提供价值依据,凝血因子活性检测是诊断因子缺乏直接证据。对于凝血因子V缺乏的患者,一旦出血需要及时止血并补充凝血因子。     

遗传性凝血因子V缺陷症的实验室诊断

目的　探讨遗传性凝血因子V(FV)缺陷症家系的实验室诊断和分子发病机制。方法　对 1个FⅤ缺陷症家系进行研究。采用活化部分凝血活酶时间 (APTT) ,凝血酶原时间 (PT)及FV促凝活性 (FV :C)和FV抗原 (FV :Ag)测定进行表型诊断 ;用PCR法对先证者FV基因 2 5个外显子及其侧翼序列进行扩增 ,PCR产物纯化后直接测序 ,检测其基因突变。通过cDNA测序分析剪切位点突变引起编码序列的变化。结果　先证者APTT 12 3s ,PT 4 3 4s ,FV :C 1 6 % ,FV :Ag 7 2 %。基因分析发现 ,先证者第 8内含子受点发生AG→GG突变 ;cDNA分析发现 ,该突变导致剪切位点前移 2 4bp ,即在编码序列中 ,于第 8外显子和第 9外显子间插入了 2 4bp ,插入序列未引起读码框架漂移 ,使编码的FV蛋白插入了 8个氨基酸。结论　先证者为I型遗传性FV缺陷症 ,第 8内含子 3′端剪切位点突变 ,引起编码序列 2 4bp插入是导致该例先证者发生FV缺陷症的分子机制。     

凝血因子V、Ⅷ和组织因子与2型糖尿病合并冠心病的关系

目的探讨凝血因子V活性（FV：C）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）和组织因子（TF）在2型糖尿病（T2DM）合并冠心病（HD）诊断中的应用价值。方法测定85例T2DM合并CHD患者[T2DM合并CHD组,根据CHD不同类型再分为T2DM合并急性心肌梗死（AMI）组（19例）、T2DM合并陈旧性心肌梗死（OMI）组（23例）、T2DM合并不稳定型心绞痛（UAP）组（25例）、T2DM合并稳定型心绞痛（SAP）组（18例）]、29例无合并症的单纯T2DM患者（单纯T2DM组）和24名健康对照者（正常对照组）FV：C、FⅧ：C、血浆TF和血管性血友病因子（VwF）活性及血小板聚集率（PAR）,并分析FV：C、FⅧ：C、TF与VwF、PAR的相关性。结果T2DM合并CHD组和单纯T2DM组FV：C、FVIU：C和TF水平均明显高于正常对照组（P〈0．001）,且T2DM合并CHD组明显高于单纯T2DM组（P〈0．01）。T2DM合并CHD组中,T2DM合并AMI组和T2DM合并UAP组FV：C、FⅧ：C和TF水平均明显高于单纯T2DM组（P〈0．001）,且T2DM合并AMI组明显高于T2DM合并UAP组（P〈0．01）;T2DM合并OMI组和T2DM合并SAP组TF水平明显高于单纯T2DM组（P〈0．01）,但FV：C和FⅧ：C水平3组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。FV：C、Fvm：C、TF与VwF、PAR均呈明显正相关（P〈0．01）。结论FV：C和FVIH：C及TF水平可作为T2DM患者并发CHD的诊断指标。TF对判断T2DM合并CHD患者病情的进展有重要价值。     

遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症研究进展

凝血因子Ⅴ是凝血过程中重要的辅因子。除了凝血功能,FⅤ也通过辅助活化蛋白C下调活化因子Ⅷ间接参与生理性抗凝旁路途径。FⅤ的这一双重作用,使得FⅤ基因缺陷可能导致出血或血栓,形成两种完全相反的表型。本文着重就FⅤ引起遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症的分子发病机制及其与临床表型的关系作一综述。     

一种新的突变引起遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症

目的 研究一个遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺乏症家系的基因缺陷。方法 采用比浊法测定凝血酶原时间、凝血酶时间、活化的部分凝血活酶时间；采用凝血因子活性测定法(一步法)和BAELISA法对先证及其家系成员血浆FⅤ活性和抗原进行测定；采用PCR及DNA序列测定技术，对FⅤ基因组DNA中25个外显子和5′非翻译端的序列进行了：PCR扩增，PCR产物回收纯化后直接测序，并经T／A克隆测序对所发现突变进行证实。结果 先证血浆FⅤ严重缺乏，FⅤ活性为1％，FⅤ抗原为1．54％。基因研究显示为复合杂合子，其基因组DNA第4外显子675位核苷酸发生单个碱基A缺失，呈杂合状态，该致病基因来自先证母亲，与来自父方的另外一条等位基因的未知缺陷，共同导致先证血浆FⅤ严重缺乏。结论发现一种新的突变675delA，该缺失引起移码，导致转录提前终止，引起遗传性FⅤ缺乏症。