应用流式细胞仪测定不同来源CD34+细胞基因转移效率的实验研究

目的 :探讨流式细胞仪测定基因转移效率的可行性 ,并比较相同实验条件下脐带血和骨髓CD34 细胞中基因转移效率的差别 ,为基因治疗的临床应用提供方便、有效的靶细胞及基因转移方法。方法 :用细胞因子刺激靶细胞 ,以携带GFP和Neo基因的逆转录病毒载体GCGPXSN实施基因转移 ,流式细胞仪测定基因转移效率。结果 :病毒上清滴度为 1.9× 10 5CFU·ml-1,各实验组实施基因转移 48h后 ,骨髓CD34 细胞中的转移效率分别为 2 .97% ,4.75 % ,7.80 %。脐带血CD34 细胞中的转移效率分别为 12 .70 % ,15 .5 0 % ,17.0 0 %。两者相比P <0 .0 5。各实验组实施基因转移 96h后 ,骨髓CD34 细胞中的转移效率分别为 2 3 .30 % ,5 0 .5 0 % ,35 .90 %。脐带血CD34 细胞中的转移效率分别为 43.5 0 % ,76 .10 % ,6 3.30 %。两者相比P <0 .0 1。结论 :流式细胞仪可方便准确地测定基因转移效率 ,脐血CD34 细胞的基因转移效率高于骨髓CD34 细胞基因转移效率     

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用

目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.     

黄芪的含药血清诱导K562细胞表达^Gγ-mRNA和合成HbF

目的研究黄芪对K562细胞的^Gγ-珠蛋白基因表达的作用。方法以K562细胞为体外模型，用联苯胺染色方法来确定黄芪的含药血清诱导K562细胞向红系分化的作用；用RT—PCR方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白mRNA的表达；用Western Blot方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞HbF的合成。结果黄芪的含药血清作用于K562细胞5d后联苯胺染色阳性率达19．8％；同时伴有^Gγ-珠蛋白mRNA的表达的增加（最高可达3．6倍）和HbF的合成的增加，与丁酸钠组比较，黄芪组诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白基因mRNA的表达可以持续3～5d，而丁酸钠组只有1d。结论黄芪有望成为一种有效的γ蛋白基因诱导剂。     

mda-7/IL-24腺病毒对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的抑制作用研究

目的构建mda-7/IL-24腺病毒,检测其对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的影响。方法将mda-7/IL-24cDNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,在大肠杆菌BJ5183中将重组病毒穿梭质粒和骨架质粒重组。在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,用PCR方法鉴定后,通过TCID50法测定病毒滴度。用滴度为50pfu/细胞的重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24感染NCI-H446细胞72h后,经MTT实验检测其对细胞增殖的影响,并用Westernblot方法检测mda-7/IL-24在NCI-446中的表达。结果核酸序列测定和PCR鉴定表明成功构建Ad·mda-7/IL-24;TCID50法测定扩增的腺病毒滴度为2×1010pfu/ml。Ad·mda-7/IL-24在NCI-H446细胞中表达MDA-7/IL-24,MTT检测表明Ad·mda-7/IL-24明显抑制NCI-H446细胞生长,抑制率为21·37%。结论重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24能显著抑制NCI-H446细胞增殖,为研究mda-7/IL-24的作用机制及将其用于小细胞肺癌的基因治疗提供了条件。     

人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。     

IL-21通过 SENP1调控 NK细胞生物学特性

目的 探讨IL-21对小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)表达的影响及其对NK细胞生物学特性的调控作用.方法 以NK92细胞系为模型,采用慢病毒介导的Senp1基因干涉策略,抑制NK92细胞SENP1的表达.实时荧光定量PCR和Western印迹检测SENP1表达水平;利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定细胞增殖活性;Annexin Ⅴ-APC/PI标记检测细胞凋亡.将K562细胞与NK92细胞共培养,荧光素酶报告基因方法检测NK92细胞的杀伤活性.结果 IL-21处理上调NK92细胞SENP1的表达;慢病毒介导Senp1-shRNA转染显著降低NK92细胞内Senp1 mRNA和蛋白表达水平.Senp1干涉组NK92细胞增殖能力较对照组明显降低.同时,干涉Senp1能促进NK92细胞凋亡,但对NK92细胞杀伤K562活性无显著影响.结论 IL-21上调NK92细胞SENP1的表达;干涉Senp1能抑制NK92细胞增殖,促进细胞凋亡,同时影响穿孔素表达和对肿瘤细胞的杀伤活性.     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

自制流动转染体系提高逆转录病毒介导的基因导入效率的研究

逆转录病毒是最常用的基因治疗载体 ,但对人类细胞的基因导入率较低。本研究建立了一个流动转染体系 ,利用电动流速调节装置控制带有重组逆转录病毒的培养液 ,以一定速度缓慢流过生物半透膜 ,迫使病毒与在膜上生长的K5 6 2细胞充分接触 ,从而提高基因导入效率。经半固体培养NeoR基因 /G418抗性集落法测定 ,无须筛选 ,单次基因导入率达 80 % ,与常规静止转染法相比 ,差异十分显著 (P <0 .0 1)。该装置简便、高效 ,可广泛地应用于基因治疗的基础和临床。     

慢性粒细胞性白血病中SHIP1基因的表达变化及机制探讨

目的观察SHIP1基因在慢性粒细胞性白血病(CML)患者中的表达变化,并通过特异性小干扰RNA(siRNA)封闭K562细胞株BCR-ABL基因的表达,探讨BCR-ABL基因表达对SHIP1基因的影响。方法应用RQ-PCR方法检测CML患者骨髓、正常人外周血白细胞及白血病细胞株K562中SHIP1基因表达的差异。另取K562细胞分为3组:空白对照组(不加任何干扰成分);非特异性siRNA处理组(加非特异性siRNA);特异性siRNA处理组(加入特异性siRNA封闭BCR/ABL融合基因),应用RQ-PCR及Western blot方法分别检测3组中BCR/ABL、SHIP1基因的mRNA及其相应蛋白P210(BCR/ABL编码)、P145(SHIP1基因编码)的表达,并比较各组中表达水平的变化。结果CML患者骨髓白细胞和K562细胞中SHIP1基因的表达明显低于正常人的外周血白细胞。特异性siRNA处理组中BCR-ABL基因mRNA和P210蛋白的表达水平明显下降,SHIP1基因mRNA和P145蛋白表达水平随BCR-ABL表达下降而增加;非特异性siRNA处理组与空白组相比无明显差异。结论CML患者SHIP1基因的表达低于正常人;特异性siRNA能够抑制BCR-ABL基因的表达;BCR-ABL基因能抑制SHIP1基因及其蛋白表达。     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Ab1的抑制作用观察

目的探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Abl定位的关系,以及对Bcr-Abl寡聚化和Bcr-Abl酪氨酸激酶活性的影响。方法采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Abl的相互作用,Western blotting检测Bcr-Abl的磷酸化水平。结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性。PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Abl共定位,且能与Bcr-Abl蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Abl同源寡聚化,并可降低Bcr-Abl的磷酸化水平。结论在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Abl同源寡聚化及磷酸化水平。     

激光激发5-氨基乙酰丙酸己酯对人红白血病耐药/非耐药细胞株的杀伤效应研究

目的探讨5-氨基乙酰丙酸己酯-光动力疗法(He-ALA-PDT)对人红白血病细胞株K562及其耐阿霉素细胞株K562/ADM的杀伤效应。方法实验设4组:PDT组(加光敏剂并接受光照)、激光组(不加光敏剂只接受光照)、暗毒性组(只加光敏剂而不接受光照)、正常对照组(不加光敏剂且不接受光照)。用不同浓度(0.025、0.1、0.4、1.6mmol/L)的He-ALA避光孵育细胞,给予不同功率密度(4.5、9、18、36J/cm2)的630nm波长激光照射后,继续培养12h,观察细胞形态学变化,以CCK8法测定细胞存活率,采用甲基纤维素培养体系分析白血病细胞克隆形成能力的变化。结果暗毒性组、激光组均未对细胞产生明显杀伤作用,而PDT组能明显杀伤白血病细胞,且细胞存活率随He-ALA浓度和激光功率密度的增加而降低,且在相同条件下,K562细胞的存活率显著低于K562/ADM细胞(P<0.05)。PDT组的集落形成率明显低于正常对照组(P<0.001),且与K562/ADM细胞相比,K562细胞的集落形成率降低程度更为显著(P<0.001)。结论He-ALA-PDT可杀伤K562、K562/ADM细胞,并显著降低白血病细胞的克隆形成能力;K562/ADM细胞对PDT的反应不如K562细胞敏感。     

葛根素对黑火药烟雾诱导支气管上皮细胞IL-8和IL-6基因表达的抑制作用

目的研究葛根素对黑火药烟雾诱导支气管上皮细胞表达IL-8及IL-6基因的抑制作用。方法用黑火药烟雾刺激支气管上皮细胞,用实时PCR方法定量检测黑火药烟雾刺激后支气管上皮细胞中IL-8及IL-6基因表达水平的变化;黑火药烟雾刺激前支气管上皮细胞培养液中加入葛根素,观察葛根素对黑火药烟雾刺激支气管上皮细胞表达IL-8及IL-6基因的抑制作用。结果烟雾刺激24 h后,IL-6及IL-8基因表达分别增加1.534±0.653倍和2.231±0.054倍;支气管上皮细胞在烟雾刺激前8 h加入不同浓度葛根素培养,黑火药烟雾诱导IL-6和IL-8的基因表达被显著抑制,并呈剂量依赖性。结论黑火药烟雾可诱导支气管上皮细胞炎性细胞因子IL-6、IL-8 mRNA表达增加,葛根素可抑制黑火药烟雾刺激支气管上皮细胞炎性细胞因子IL-6、IL-8 mRNA表达。     

Loss of mitochondrial membrane potential and caspase activation enhance apoptosis in irradiated K562 cells treated with herbimycin A

PURPOSE: We previously reported that herbimycin A (HMA) alters the mode of cell death of K562 cells induced by radiation and enhanced their radiosensitivity. In the present study, we explored the apoptosis-inducing activity of HMA and the fundamental mechanism via which it regulates radiation-induced cell death. MATERIALS AND METHODS: Chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K562 was used. For X-irradiation and drug treatment, cells were plated at approximately 2x10(5) cells/ml. Exponentially growing cells were treated with 10 Gy of X-ray using a 6-MeV X-ray machine at a dose rate of 200-300 cGy/min. The cells were treated with 0.25 microM HMA immediately after irradiation and HMA remained for the entire culture period. The modes of cell death were discriminated by morphological changes, analysis of cell cycle, analysis of the mitochondrial events, and the expression of apoptosis-related proteins. RESULTS: Our data demonstrates that radiation induced a significant time-dependent increase of cell death and failed to sustain a prolonged G2 arrest in K562 cells. Radiation-induced cell death caused the accumulation of cyclinB1 and weak nuclear fragmentation, suggesting a mitotic catastrophe. This mitotic catastrophe was dependent upon the mitochondrial permeability transition pore (PTP) opening and was independent of caspase-3. In contrast, K562 cells treated with radiation and HMA had an accelerated cell death and induced a p53-independent apoptosis. This apoptotic pathway was dependent upon an initial hyperpolarization of the mitochondrial inner membrane, following the release of cytochrome c and subsequent caspase-3 activation. CONCLUSIONS: Two mechanisms of radiation-induced cell death in K562 cells, mitotic catastrophe and apoptosis, are regulated through distinct pathways, mitochondria and caspase-independent and -dependent, respectively. The findings of this study may provide new insights into improving the efficiency of radiotherapy in CML patients.