siRNA沉默PPARα减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡

背景:多药耐药一直是遏制提高结肠癌化疗有效性的瓶颈问题。目的:探讨沉默PPARα能否减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡,从而阐明PPARα在羟喜树碱耐药中的潜在作用。方法:构建针对PPARα基因的siRNA干扰载体,并转染人结肠癌SW1116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞,以RT-PCR和蛋白质印迹法验证干扰效果。经羟喜树碱干预后,以MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。以定量RT-PCR检测不同浓度miR-506前体转染SW1116细胞后对PPARα下游调控靶基因mRNA表达的影响。结果:siRNA干扰载体Ⅲ的沉默效果最佳,PPARα mRNA和蛋白表达分别下调了约94.1%±3.4%和70.8%±8.6%。稳定转染siRNA的SW1116细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为(332±19)μg/L,亲本SW1116细胞为(152±12)μg/L。在相同浓度羟喜树碱的作用下,亲本SW1116细胞的凋亡率显著高于稳定转染siRNA的SW1116细胞(150μg/L:7.0%±2.5%对2.8%±1.6%;300μg/L:32.4%±7.1%对18.5%±2.7%)。miR-506前体下调HMGCS-2表达,上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达,其中上调CCND1的作用最为明显。结论:成功构建了针对PPARα的siRNA干扰载体;沉默PPARα能增强SW1116细胞对羟喜树碱的抵抗性,可能与下调HMGCS-2表达并上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达有关。     

应用芯片技术筛查人结肠癌羟基喜树碱多药耐药相关微RNA的研究

目的 探讨新一类调控分子微RNA(miRNA)在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的作用,为逆转肿瘤化学治疗的多药耐药性提供新的靶点.方法 运用miRCURYTM LNA Array V8.1版芯片检测人结肠癌细胞SW1116和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/HCPT的miRNA表达谱,筛选出具有表达差异的miRNA(2倍以上).通过PiTcar,Targetscan,MIRanda等算法在线搜寻差异表达miRNA的靶基因.利用茎环特异miRNA引物反转录特异的miRNA,并采用荧光定量PCR法对个别差异表达的miRNA进行验证.结果 用于芯片分析的总RNA的吸光度比值分别为1.93(SW1116)和1.94(SW1116/HCPT).琼脂糖变性凝胶电泳进一步验证总RNA质量符合芯片要求.通过芯片检测后发现SW1116/HCPT相比SW1116表达下调的miRNA共有28条,表达上调的有36条.根据靶基因预测结果,我们选取其中2条表达下调hsa-miR-452,hsa-miR-373*和1条表达上调hsa-miR-506进行荧光定量PCR验证,hsa-miR-452和hsa-miR-506的结果与芯片相符合,但hsa-miR-373*表达量不足以由荧光定量PCR检测出.结论 miRNA表达量的改变可能在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中起有关键作用.     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

抑癌基因Pdcd4的表达对羟基喜树碱细胞毒活性的影响

目的:探讨抑癌基因Pdcd4的表达对羟基喜树碱细胞毒活性的影响及其机制.方法:采用脂质体转染法将带有全长Pdcd4cDNA的质粒转入BGC-823细胞,MTT法测定羟基喜树碱对Pdcd4cDNA转染BGC-823细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测羟基喜树碱作用前后细胞周期和凋亡率的变化,Western blot蛋白印迹法检测Pdcd4蛋白表达.结果:建立了稳定转染Pdcd4cDNA的BGC823细胞系:羟基喜树碱作用转染细胞24,72 h后,药物对Pdcd4cDNA转染组细胞的半数抑制浓度均低于两对照组(pCDNA3.1与pCDNA-Pdcd4-D418A)(74.48 μmol/L vs 87.67,102-30 μmol/L;14.30 μmol/L vs 40.59,29.54μmol/L,均P＜0.05);流式细胞仪测定结果表明,80 μmol/L羟基喜树碱作用转染细胞24h,处于细胞周期G0/G1期的细胞比例下降,S期细胞比例升高,出现细胞周期S期阻滞,72h,细胞凋亡率显著升高(pCDNA3.1:45.40%vs 5.65%:pCDNA-Pdcd4-D418A:36.21%vs 3.07%;pCDNA-Pdcd4:46.17% vs 4.25%,P＜0.05):Westem blot结果表明80 μmol/L羟基喜树碱作用转染细胞72 h,Pdcd4蛋白表达水平升高.结论:提高人胃腺癌细胞BGC-823中Pdcd4蛋白的表达能增强其对羟基喜树碱的敏感性:羟基喜树碱能引起BGC-823细胞s期阻滞,并能诱导细胞凋亡;羟基喜树碱本身也可上调BGC-823中Pdcd4的表达.     

FTY720通过miR-494/MST1抑制结肠癌细胞并增加吉西他滨敏感性的分子机制

背景结肠癌在我国恶性肿瘤中发病率和死亡率均居第5位,化疗是其主要治疗方式,有研究表明免疫抑制剂FT Y720对癌症细胞增殖起一定的抑制作用,抑制剂联合化疗药物可提高癌症治疗效果.本研究使用免疫抑制剂FTY720与吉西他滨联合处理结肠癌细胞,并探索miR-494/哺乳动物Ste20样激酶1 (mammalian Ste20-like kinase 1,MST1)对在此过程中对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响,以期为结肠癌的治疗提供新的思路.目的研究FT Y720和吉西他滨对结肠癌细胞存活率和凋亡的影响和潜在的分子机制.方法用0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL的吉西他滨和2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L的FTY720处理结肠癌SW1116细胞,CCK8法和流式细胞术检测SW1116细胞存活率和凋亡率,实时定量聚合酶链式反应检测miR-494和MST1 mRNA的含量,Western blot检测MST1、p21和Caspase-3蛋白表达水平,双荧光素酶报告系统验证miR-494与MST1的调控关系.结果吉西他滨(0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL)和FTY720 (2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L)均可降低结肠癌SW1116细胞的存活率,且具有浓度依赖性,根据结果选取抑制率约为50%的0.1μg/mL吉西他滨和10μmol/L的FTY720进行后续实验,吉西他滨和FT Y720均可抑制细胞存活并促进细胞凋亡,且联合使用比单独使用效果更好;过表达miR-494可逆转FTY720、吉西他滨对SW1116细胞存活率和凋亡的作用;miR-494靶向调控MST1;抑制MST1可逆转FTY720和吉西他滨对SW1116细胞存活率和凋亡的影响.结论FTY720和吉西他滨通过miR-494/MST1抑制SW1116细胞存活,促进细胞凋亡.FTY720和吉西他滨对结肠癌SW1116具有抑制作用,且联合使用效果更佳.     

5-脂氧合酶抑制TNF-α诱导的胰腺癌细胞凋亡

目的:检测胰腺癌细胞中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)及其代谢产物的表达情况,分析高表达5-LOX及LTB4对胰腺癌细胞生长凋亡的影响.方法:体外培养人胰腺癌细胞株ASPC-1,PANC-1和SW1990,并构建5-LOX基因稳定转染细胞株.用RT-PCR和Western blot检测细胞5-LOX mRNA和蛋白的表达,ELISA检测细胞培养上清中LTB4的含量,采用流式细胞仪、Annexin V/PI双染法检测TNF-α诱导细胞的细胞凋亡.结果:三种胰腺癌细胞株均表达5-LOX mRNA和蛋白,细胞上清中也都检测到一定量LTB4分泌.5-LOX基因稳定转染细胞株表达5-LOX和LTB4的水平上升.TNF-α(20μg/L)处理野生型SW1990细胞,12和24 h后凋亡率分别为25.4%±3.65%和43.5%±5.23%,但该效应在高表达5-LOX的细胞株中明显减弱,分别为13.2%±2.01%和21.7%±3.65%.在野生型SW1990细胞培养中加入外源性LTB4(10 nmol/L)能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,野生型与处理组细胞24 h后凋亡率有显著性差异(47.6%±5.32%vs 18.5%±5.69%,P<0.01).用LTB4受体阻断剂处理5-LOX高表达细胞株,能恢复其对凋亡诱导的敏感性.结论:胰腺癌细胞均能表达5-LOX并产生LTB4,高表达5-LOX能抑制TNF-α诱导的胰腺癌细胞凋亡.     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

Ufd1基因沉默逆转SW1116／HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究

泛素融合降解1样蛋白（Ufd1）在蛋白质逆向转运中发挥一定作用。前期研究发现羟基喜树碱（HCPT）耐药人结肠癌细胞株SW1116／HCPTUfd1表达增高。目的：探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用。方法：干扰组SW1116／HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因．对照组转染非特异性siRNA。体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况。结果：干扰组SW1116／HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组（P〈0．05）。经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显。结论：以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关。     

SATB2与miR-31、182对结直肠癌的靶向调控

目的探讨结直肠癌中靶向调控特定富含AT碱基DNA序列结合蛋白(SATB)2有关的miR-31和miR-182表达水平,并分析其与SATB2的关系。方法根据候选miRNAs的预测结果,构建SATB2基因3′UTR突变性和野生型的荧光素酶载体,与miRNA抑制物转染、报告基因检测和miRNA模拟物等技术手段相结合,检验候选miRNA是否对SATB2基因的表达具有靶向调控作用,确定miRNA对调控结直肠癌转移相关基因SATB2的靶效性。结果 miR-31和miR-182是靶向调控SATB2的候选基因。结直肠癌组织中miR-31和miR-182表达明显增高(P0.05),与未转移比较,结直肠癌转移的miR-31和miR-182表达明显增高(P0.05)。慢病毒感染结直肠癌细胞SW480得到稳定过表达。miR-31和miR-182的结直肠癌细胞株SW480/miR-31和SW480/miR-182的增殖能力明显高于对照SW480/Con(P0.05)。SW480/miR-31和SW480/miR-182细胞形成的克隆较对照SW480/Con细胞明显多(P0.05),SW480/miR-31,停留在G0/G1期的细胞减少,S期的细胞增多,G2/M期细胞增多,SW480/miR-182,G0/G1期的细胞减少,S期细胞增多,G2/M期细胞增多。与对照SW480/Con细胞比较,SW480/miR-31和SW480/miR-182的细胞内荧光素酶的活性明显降低(P0.05)。SATB2基因转染后,miR-31和miR-182细胞体外增殖能力均明显降低(P0.05)。SATB2基因转染后,SW480/miR-31和SW480/miR-182细胞进入G0/G1期,S期细胞减少,G2/M期细胞减少,SATB2基因转染后,miR-31和miR-182细胞运动能力明显降低(P0.05)。与对照组比较,实验组裸鼠的瘤体积和瘤重量均明显增高(P0.05)。与对照组比较,实验组裸鼠瘤的miR-31和miR-182表达均明显增高(P0.05)。结论结直肠癌中靶向调控SATB2细胞的miR-31和miR-182在结直肠癌中的表达水平高低与癌细胞转移、克隆及预后相关,miR-31和miR-182能反向调控SATB2的表达。