小干扰RNA-TLR9对高糖下大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的探讨Toll样受体9(TLR9)对高糖下大鼠视网膜神经节细胞(RGC)-5凋亡的影响及小干扰RNA-TLR9(si-TLR9)对凋亡的抑制作用。方法将体外培养的RGC-5细胞分为正常对照组、高糖组、高糖+阴性对照组和高糖+si-TLR9组,分别行正常培养、高糖培养、高糖下空质粒转染和高糖下siRNA-TLR9质粒转染细胞。采用实时PCR法检测各组细胞中TLR9 mRNA表达;采用MTT法检测各组细胞存活率;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞中含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)活性;采用Western blot法检测TLR9及B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和磷酸化(p)-p38MAPK蛋白的表达。结果与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中TLR9 mRNA和蛋白的相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞存活率分别为(78.36±5.13)%和(75.12±4.25)%,较正常对照组的(95.48±7.25)%明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞存活率为(86.58±5.32)%,明显高于高糖+阴性对照组的(75.12±4.25)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞凋亡率分别为(13.23±1.22)%和(12.52±1.38)%,较正常对照组的(2.26±0.15)%明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞凋亡率为(7.15±0.24)%,明显低于高糖+阴性对照组的(12.52±1.38)%,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中bax蛋白表达量明显下降,bcl-2蛋白相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖+si-TLR9组细胞中caspase-3活性明显低于高糖+阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中p-p38MAPK蛋白相对表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调TLR9表达可抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活化有关。     

不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca2+的影响

目的:探讨不同浓度维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞内Ca2+浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca2+浓度的变化。方法:2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/LVer作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)测定细胞内Ca2+荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果:Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义(P>0.05),Ver可降低RPE细胞内Ca2+荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca2+荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异(P<0.05)。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca2+荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异(P>0.05)。结论:超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca2+荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca2+有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca2+荧光强度无明显作用。     

17-β雌二醇对H2O2诱导氧化损伤的晶状体上皮细胞的保护作用

目的 探讨17-β雌二醇对H2O2诱导氧化损伤的晶状体上皮细胞的保护作用.方法 将体外培乔的晶状体上皮细胞分为4组;空白对照组:以正常培养液培养;H2O2损伤组:给予培养融合状态达到80％的晶状体上皮细胞每孔加入100μmol·L-1H2O2,作用12 h;17-β雌二醇低浓度组:用10 μmol·L-1 17-β雌二醇孵育细胞24h后,加入H2O2作用12 h;17-β雌二醇高浓度组:用100 μmol·L-117-β雌二醇孵育细胞24 h后,加入H2O2作用12 h.通过CCK-8法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光探针标记法测定细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),使用721 D分光光度计测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量.结果 H2O2损伤组晶状体上皮细胞经氧化损伤处理后,细胞存活率明显下降,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).与H2 O2损伤组(59.34％)相比,17-β雌二醇低浓度组和高浓度组晶状体上皮细胞存活率分别提高到67.44％和78.52％,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2诱导损伤后,H2 O2损伤组晶状体上皮细胞凋亡率为(41.30±3.21)％,空白对照组为(1.67±0.32)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.0I).17-β雌二醇低浓度组和高浓度组晶状体上皮细胞凋亡率分别为(20.97±1.13)％和(14.27±0.90)％,与H2 O2损伤组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).采用H2 DCFDA荧光探针检测胞内ROS变化情况,H2 O2损伤组细胞内ROS表达明显升高,DCF荧光信号明显增强,ROS主峰向基线右侧移位;17-β雌二醇低浓度组和高浓度组荧光信号强度逐渐减弱,ROS主峰向基线左侧移位.H2O2损伤组晶状体上皮细胞内CAT、SOD及GSH-Px含量均降低,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05);17-β雌二醇低浓度组和高浓度组CAT、SOD及GSH-Px含量较H2O2损伤组均逐渐升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 17-β雌二醇对H2 O2诱导损伤的晶状体上皮细胞具有明显的保护作用.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

虾青素对晶状体上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用及其机制北大核心CSCD

目的研究虾青素对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导晶状体上皮细胞HLEB-3氧化应激损伤的调控作用及其可能的作用机制。方法将HLEB-3细胞于不同浓度H_(2)O_(2)(0、50、100、200、500、750μmol/L)下培养,噻唑蓝(MTT)法检测细胞抑制率,计算半数抑制浓度(IC50)。将HLEB-3细胞使用不同浓度(0、5、10、20、50μmol/L)虾青素培养,MTT法检测细胞存活率。将HLEB-3细胞分为4个组,其中正常对照组用完全培养基培养、氧化应激组于250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养,10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组分别于相应浓度虾青素+250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养,各组均培养24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western bolt法检测细胞核核因子E2相关因子2(Nrf2)、细胞质Nrf2和血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白表达。另将细胞分为正常对照-小干扰RNA(NC-siRNA)组、Nrf2-siRNA组、NC-siRNA+虾青素组和Nrf2-siRNA+虾青素组,分别转染NC-siRNA或Nrf2-siRNA,转染后24 h分别于含0或10μmol/L虾青素和250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用ELISA法检测细胞NO浓度、SOD活性、GSH活性和MDA含量。结果随着H_(2)O_(2)浓度的增加,HLEB-3细胞抑制率升高,不同浓度H_(2)O_(2)处理细胞的抑制率总体比较差异有统计学意义(F=12.358,P<0.05)。H_(2)O_(2)对HLEB-3细胞的IC50为264.20μmol/L。0、5、10、20、50μmol/L虾青素处理HLEB-3细胞的存活率分别为(100.00±0.00)%,(102.20±1.34)%、(109.50±3.60)%、(115.40±4.13)%和(93.60±2.59)%,后续选取10μmol/L和20μmol/L作为实验剂量。氧化应激组细胞凋亡率为(38.50±2.38)%,高于正常对照组的(9.20±0.24)%,差异有统计学意义(P<0.05);10μmol/L虾青素组细胞凋亡率为(27.60±4.33)%,低于氧化应激组,高于20μmol/L虾青素组的(14.90±1.23)%和正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。氧化应激组细胞中NO浓度、MDA含量高于正常对照组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组,SOD、GSH活性低于正常对照组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);10μmol/L虾青素组NO浓度、MDA含量高于20μmol/L虾青素组和正常对照组,SOD、GSH活性低于20μmol/L虾青素组和正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组间细胞核Nrf2、细胞质Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=43.512、20.381、31.014、23.435,均P<0.001);正常对照组、氧化应激组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组细胞质Nrf2蛋白相对表达量逐渐下降,细胞核Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相对表达量逐渐升高,组间两两比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Nrf2-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组细胞凋亡率高于NC-siRNA组和NC-siRNA+虾青素组,NC-siRNA组细胞凋亡率高于NC-siRNA+虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);Nrf2-siRNA+虾青素组和Nrf2-siRNA组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2-siRNA组细胞NO浓度、MDA含量高于NC-siRNA组,SOD、GSH活性低于NC-siRNA组,差异均有统计学意义(均P<0.05);NC-siRNA+虾青素组NO浓度、MDA含量低于NC-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组,SOD、GSH活性高于NC-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);Nrf2-siRNA+虾青素组细胞NO浓度、SOD和GSH活性及MDA含量与Nrf2-siRNA组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论虾青素能提高晶状体上皮细胞抗H_(2)O_(2)诱导的氧化应激损伤能力,其作用可能是通过活化Nrf2相关信号通路而实现的。     

慢病毒介导miR-34a表达对视网膜母细胞瘤自噬的影响及机制研究

目的　探讨慢病毒介导miR-34a表达对视网膜母细胞瘤自噬的影响并对其机制进行研究。方法　取对数生长期的Y79细胞，将转染miR-34a的慢病毒载体、转染高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）载体、共转染miR-34a+HMGB1的慢病毒载体及培养液接种至Y79细胞构建转染miR-34a细胞系。按照接种载体分组，将Y79细胞株分为4组，分别为转染miR-34a组、转染HMGB1组、共转染miR-34a+HMGB1组及阴性对照组。用qRT-PCR检测miR-34a的表达，采用Capase3检测试剂盒检测Caspase3活性。采用流式细胞仪及单丹磺酰尸胺（monodansyl cadaverin，MDC）试剂盒在488 nm荧光下检测MDC荧光率，利用透射电子显微镜观察自噬超微结构。结果　miR-34a转染结果显示，转染miR-34a组miR-34a的相对表达量（2.04±0.46）显著高于阴性对照组（1.03±0.21）（P<0.05），共转染miR-34a+HMGB1组的HMGB1的相对表达量（0.42±0.08）显著低于转染HMGB1组（1.08±0.16），差异有统计学意义（P<0.05）。Caspase3活性测试显示，转染miR-34a组Caspase3活性（10.75±2.87）明显高于阴性对照组（3.48±0.74），转染HMGB1组Caspase3活性（2.46±0.94）低于共转染miR-34a+HMGB1组（6.21±1.74），差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，转染miR-34a组MDC阳性率（56.94%）明显高于阴性对照组（2.15%），共转染miR-34a+HMGB1组的MDC阳性率（43.11%）明显高于转染HMGB1组（10.32%）（P<0.05）。透射电子显微镜观察自噬超微结构显示，阴性对照组无明显改变，共转染miR-34a+HMGB1组可见Y79细胞双层膜结构，转染miR-34a组可见自噬溶酶体结构。结论　miR-34a促进视网膜母细胞瘤的自噬凋亡，其机制可能为抑制HMGB1的表达。     

小檗胺诱导体外培养的视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡的研究

[目的]观察探讨小檗胺(BBM)对体外培养的视网膜母细胞瘤(RB) HXO-RB44细胞增生和凋亡的影响及其机制.[方法]体外培养RB细胞,取对数生长期细胞分为BBM处理组和空白对照组.BBM处理组分别加入2、4、8、16、32 mg/L BBM,作用24、48、72 h后,四氮唑(MTT)比色法检测细胞增生活性;4、8、16 mg/L BBM作用24 h后,流式细胞仪检测细胞早期细胞凋亡率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞内B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、Bax蛋白的表达,比色法检测半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)的活性.[结果]BBM以时间-剂量依赖方式显著抑制RB细胞的增生(24 h:F=70.547,48 h:F=603.438,72 h:F=577.521;P＜0.01).作用24、48、72 h,半数抑制浓度分别为25.26、10.94、6.25 mg/L.空白对照组和不同浓度BBM处理组细胞坏死率分别为(1.25±0.45)％、(4.10±2.95)％、(4.39±0.21)％、(10.54±4.38)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=6.527,P＜0.05);晚期凋亡和坏死率分别为(2.13±0.71)％、(5.45±2.31)％、(9.86±3.18)％、(11.10±1.70)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=10.845,P＜0.05):早期凋亡率分别为(0.51±0.26)％、(2.68±0.35)％、(5.97±0.50)％、(11.22±1.17)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=144.976,P＜0.01).BBM剂量依赖性地减少bc1-2的表达,增加Bax的表达,降低bcl-2/Bax比值,增强Caspase-3活性,差异均有统计学意义(bcl-2:F=835.726,Bax:F=111.963,Caspase-3:F=298.058;P＜0.01).[结论]BBM体外能抑制RB细胞增生并诱导细胞凋亡或坏死.其机制可能与下调bcl-2的表达,上调Bax的表达,并增强Cspase-3的活性有关.     

褪黑素联合锌对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨褪黑素（MT）联合锌（Zn）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE细胞株（ARPE-19）,利用不同浓度H₂O₂处理ARPE-19细胞,将细胞存活率接近50%的H₂O₂浓度作为氧化损伤浓度。将ARPE-19细胞分为:不同浓度MT（10^-5 mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-7mol·L^-1）+ZnCl₂（15 μmol·L^-1）组,ZnCl₂组（采用15 μmol·L^-1 ZnCl₂培养细胞）,H₂O₂组（不添加MT和ZnCl₂培养细胞）,空白对照组（细胞不做任何处理）。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用试剂盒测量各组细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。ELISA检测各组细胞内白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。结果　当H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1时,细胞存活率为(54.31±1.91)%,此时细胞存活率接近50%,后续实验中均选择该浓度作为氧化损伤浓度。ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞凋亡率分别为3.05%、1.17%、1.50%、1.71%,与空白对照组（0）相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.76倍、1.59倍、1.41倍,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.13倍和1.25倍,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组细胞内MDA的含量较空白对照组显著提高 （P<0.05）;ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内MDA的含量均较空白对照组稍增加,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1MT+ZnCl₂组和10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均略高于空白对照组,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　MT联合Zn能有效降低H₂O₂损伤所致ARPE-19细胞内ROS的含量,随之减少细胞内MDA的含量,同时也能抑制IL-6和TNF-α的表达量,从而起到保护RPE细胞的作用。     

细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞存活的影响

目的 研究细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活的影响,并探讨其潜在的分子机制.方法 采用视神经横断手术构建大鼠视神经损伤模型,术后分离RGCs.实验分为视神经损伤组(optic nerve transection,ONT组)和假手术组.采用Western blot和RT-PCR检测SOCS3在两组细胞中的表达.随后将SOCS3 siRNA分别转染假手术组和ONT组RGCs,实验进一步分为空白对照组、阴性对照组和SOCS3沉默组.CCK8和MTT法检测细胞存活,Hoechst 33342荧光染色法和流式细胞技术检测细胞凋亡.进一步将mTOR siRNA和SOCS3 siRNA共转染RGCs,检测细胞存活和细胞凋亡.结果 视神经损伤3d后,ONT组SOCS3表达水平显著高于假手术组(P =0.049),且随损伤时间延长而升高.与空白对照组相比,SOCS3沉默可显著提高视神经损伤后RGCs的存活率[空白对照组与SOCS3沉默组分别为(49.47±7.35)％和(73.24±8.70)％],降低细胞凋亡率[2组分别为(27.25±0.75)％和(10.96±1.07)％]和细胞生长抑制率[2组分别为(23.06±1.43)％和(10.65±1.77)％].Hoechst染色也表明SOCS3沉默可改善视神经损伤诱导的细胞凋亡.同时,SOCS3沉默可显著提高视神经损伤后2周mTOR活性标志蛋白pS6的表达;且与单独沉默SOCS3相比,共同沉默mTOR和SOCS3可降低细胞存活率,提高细胞生长抑制率和细胞凋亡率.结论 SOCS3沉默可以通过上调损伤后期mTOR的活性而促进损伤RGCs的存活并抑制其凋亡.     

槲皮素对高压氧诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

背景 氧化应激诱导的晶状体上皮细胞( LECs)凋亡与c-Jun氨基末端激酶(JNK)细胞信号通路有关;槲皮素能抑制JNK细胞信号通路并且有显著的抗氧化作用,但其对高压氧诱导的人LECs损伤有无保护作用有待研究. 目的 研究高压氧诱导人LECs凋亡的作用及槲皮素对高压氧处理的人LECs的保护作用,探讨JNK细胞信号通路在上述过程中的作用.方法 人LECs细胞系SRA01/04在MEM培养基中进行培养,传至第3代进行实验.实验细胞分为空白对照组、高压氧组(体积分数99％ O2+体积分数1％ CO2)、高压氧+SP600125组和高压氧+槲皮素组,实验前2h分别在后2个组人LECs培养基中加入20μmol/L JNK2特异性抑制剂(SP600125)或1μmol/L槲皮素预孵育,除空白对照组外,其他3个组于588 kPa高压氧舱处理6h后收集人LECs.应用MTT法检测各组人LECs的细胞活力,以570 nm处吸光度(A)值表示.用流式细胞仪以Annexin V-FITC试剂盒检测人LECs处理后各组细胞的凋亡率,通过Western blot法检测各组人LECs中JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase-3、caspase-9的蛋白表达情况. 结果 实验6h后,高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力分别为0.450±0.083、0.654±0.079、0.649±0.090,明显低于空白对照组(0.835±0.082),差异均有统计学意义(P=0.001);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力明显高于高压氧组(P=0.003、0.002).高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs凋亡数分别为19.77±1.44、8.45±0.93、7.79±0.78,明显高于空白对照组的3.17±0.74,差异有统计学意义(P=0.000);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs细胞凋亡数明显少于高压氧组,差异均有统计学意义(P=0.000).同时,高压氧组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P=0.000),而高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显低于高压氧组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 JNK细胞信号通路在高压氧诱导的人LECs凋亡发生发展中起重要作用,SP600125和低浓度的槲皮素能抑制JNK细胞通路和细胞内源性凋亡途径,减轻高压氧引起的人LECs损伤.     

miR-21对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及作用机制

目的　探讨MicroRNA-21（miR-21）对视网膜母细胞瘤(RB)细胞增殖的影响及作用机制。方法　采用Real-time PCR技术检测miR-21在正常视网膜组织和确诊RB组织中的表达情况；然后在转染的基础上运用MTT检查RB细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡率。Western blot法检测与细胞凋亡相关蛋白PDCD4、Bax、Bcl-2的表达。结果　与正常视网膜组织miR-21表达 （0.703±0.071）相比，RB组织miR-21为高表达（2.214±0.162），差异有统计学意义（P<0.01）。在Weri-Rb-1细胞中，与NC组(2.245±0.213)相比，miR-21抑制剂转染后明显降低了miR-21的表达水平，miR-21 inhibitor组为0.683±0.075,差异有统计学意义 （P<0.01）。两组细胞转染后24 h、48 h、72 h、96 h，MTT测定法检测细胞活力结果显示:两组24 h的A值比较，差异无统计学意义 （P>0.05），miR-21 inhibitor 组在 48 h、72 h、 96 h的A值均低于 NC 组，差异均有统计学意义 （均为P<0.01）。流式细胞术检测结果显示:NC组凋亡细胞在总细胞中百分比为（3.045±0.301）%和（4.832±0.493）%，miR-21 inhibitor组凋亡细胞在总细胞中百分比为（2.593±0.257）%和（40.167±4.014）%，miR-21 inhibitor组Weri-Rb-1细胞的凋亡率明显高于miR-21 NC组(P<0.01)。Western blot检测结果显示:NC组PDCD4表达（0.192±0.045）相比miR-21 inhibitor组（0.683±0.091）表达明显减少，NC组Bax的蛋白表达水平（0.143±0.036）相比miR-21 inhibitor组（1.192±0.054）也明显减少，差异均有统计学意义（P<0.01)，NC组Bcl-2蛋白表达（0.864±0.038）相比miR-21 inhibitor组（0.257±0.026）明显增多，差异有统计学意义（P<0.05)。结论　miR-21是RB的促癌基因，miR-21抑制剂可以通过降低miR-21表达抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡，这一过程与PDCD4、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白有关。     

缺氧条件下1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞的促增生和抗凋亡作用

背景 1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有生物活性的脂质,是细胞内重要的信使分子,参与多种生物过程的调节,如细胞增生、迁移、分化、凋亡等.缺氧不仅是脉络膜新生血管(CNV)的关键始发因素,也是许多眼部疾病的病理基础,而视网膜色素上皮(RPE)细胞也参与缺氧后新生血管的形成,缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响尚不清楚. 目的 观察缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响,从而揭示S1P在CNV中的作用机制.方法 体外培养人RPE细胞株并进行传代,3～5代的RPE细胞分为6个组,空白对照组细胞进行常规培养,缺氧组细胞用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h,不同浓度S1P干预组(0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L)用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h后加入相应浓度的S1P,采用WST-1试剂盒检测各组细胞的吸光度(A)值;采用Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况,计算并比较各组细胞的凋亡率.结果 培养的细胞生长良好,可见细胞质内的色素颗粒.WST-1试剂盒检测显示,空白对照组细胞增生值(A值)为0.91 ±0.08,缺氧组为0.37±0.09,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组分别为0.46±0.08、0.52±0.09、0.61 ±0.06和0.70±0.10,各组间的差异有统计学意义(F=21.104,P=0.000),不同浓度S1P组A值均明显高于缺氧组,且随S1P浓度的升高而增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);不同浓度的S1P组细胞存活率均明显高于缺氧组.Hoechst染色显示,空白对照组RPE形态正常,可见少数凋亡细胞;缺氧组可见大量凋亡细胞,细胞核呈淡蓝色,染色质浓缩;S1P干预后凋亡细胞数较缺氧组减少,随着S1P浓度的增加,凋亡细胞数逐渐减少.空白对照组凋亡率为(1.21±0.08)％,缺氧组为(8.99±0.09)％,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组的细胞凋亡率分别为(6.60±0.08)％、(5.95±0.09)％、(4.81±0.06)％和(3.96±0.10)％,6个组间细胞凋亡率的总体差异有统计学意义(F=25.070,P=0.000),与缺氧组比较,各S1P组细胞凋亡率均明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05),且随S1P的浓度升高其凋亡率逐渐降低.结论 缺氧条件下S1P对人RPE细胞的增生有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用.     

糖基化终末产物对体外培养牛眼小梁细胞氧化应激及凋亡的影响

目的通过观察糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGE)对体外培养牛眼小梁细胞凋亡的影响,研究AGE与原发性开角型青光眼(primaryopenangleglaucoma,POAG)之间的关系,进一步探讨其发病机制。方法 体外培养牛眼小梁细胞,通过形态学观察和神经元特异性烯醇化酶染色对培养的细胞进行鉴定。将第3代小梁细胞接种于6孔培养板,在培养基中加入不同浓度(0μgmL-1、50μgmL-1、100μgmL-1、200μgmL-1)的AGEBSA培养96h。终浓度(200μgmL-1)的AGEBSA培养液处理细胞不同时间(48h、72h、96h)。应用流式细胞仪检测小梁细胞凋亡率;活性氧荧光探针2’,7’二氯荧光黄双乙酸盐检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果 50μgmL-1、100μgmL-1、200μgmL-1AGEBSA作用96h后细胞凋亡率分别为(5.60±0.25)%、(9.57±0.08)%、(17.68±0.21)%,与对照组(0μgmL-1AGEBSA)细胞凋亡率(445±0.12)%相比均明显增高,且差异均有统计学意义(均为P<0.05);200μgmL-1AGEBSA作用细胞48h、72h、96h后凋亡率分别为(10.51±0.28)%、(13.47±0.42)%、(17.68±0.21)%,与对照组相比也均明显增高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组比较,AGEBSA处理后细胞内ROS水平显著提高,差异有统计学意义(P<0.05),BSA组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在体外培养的条件下,AGE可能通过刺激牛眼小梁细胞产生大量ROS介导小梁细胞凋亡。     

黄芪多糖对过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的观察黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)氧化损伤的保护作用。方法培养的人RPE细胞系ARPE-19分为正常对照组、过氧化氢损伤组和不同浓度(1000 mg·L-1、500mg·L-1)APS干预组,正常对照组不作任何处理,过氧化氢损伤组加入200μmol·L-1过氧化氢,APS干预组加入不同浓度(1000 mg·L-1、500 mg·L-1)APS后加入200μmol·L-1过氧化氢。用倒置荧光显微镜观察各组细胞形态变化;MTT检测各组细胞活性;DAPI染色观察各组细胞核形态学变化;实时细胞电子分析系统(real-time cell electronic sensing system,RT-CES)实时记录细胞生长状态;应用caspase-3活性检测试剂盒测定各组细胞中caspase-3的活性。结果过氧化氢损伤组细胞皱缩,悬浮细胞增多,APS干预后细胞状态改善。MTT检测结果显示:1000 mg·L-1、500 mg·L-1APS孵育24 h后细胞存活率分别为(99.86±3.64)%和(101.03±3.52)%,与正常对照组(100%)相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05),过氧化氢损伤组细胞存活率为(56.49±2.30)%,与正常对照组相比显著降低(P<0.01),1000 mg·L-1、500 mg·L-1APS干预后,细胞存活率升高到(88.14±2.97)%和(80.75±3.13)%,与过氧化氢损伤组相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。DAPI染色显示正常细胞核均匀淡染,过氧化氢损伤组出现强荧光点和致密的细胞核,APS处理后凋亡程度减轻。RT-CES显示,APS处理可以减少过氧化氢造成的细胞损伤。Caspase-3检测发现过氧化氢造成细胞caspase-3水平升高,APS处理后caspase-3水平下降。结论 APS可以抑制过氧化氢诱导的人RPE细胞系ARPE-19的凋亡,这为APS的临床应用提供了一定的实验基础。     

miR-370通过FoxM1相关通路调控人视网膜母细胞瘤细胞凋亡机制研究

目的　探讨miR-370对人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine TM 2000将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor转染至Y79细胞内,分别建立miR-370过表达组（mimics组）、对照组（NC组）和抑制组（inhibitor组）,三组转染24 h、48 h、72 h和96 h时,均使用CCK-8检测各组细胞增殖活性;转染48 h后,RT-PCR检测各组细胞内miR-370表达;Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Western Blot检测各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达。结果　mimics组细胞miR-370 mRNA表达远高于其他两组（均为P<0.05）,inhibitor组细胞miR-370 mRNA表达显著低于其他两组（均为P<0.05）。自转染48 h起,inhibitor组细胞增殖活性显著高于其他两组（均为P<0.05）,而mimics组细胞增殖活性显著低于其他两组（均为P<0.05）,这种趋势一直持续至转染后96 h。mimics组细胞早期凋亡率显著高于其它两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞早期凋亡率在三组中最低（P<0.05）。mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达均显著低于其他两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达显著高于其他两组（均为P<0.05）。结论　miR-370能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖,促进其凋亡,这种影响可能是通过降低PI3K/AKT/FoxM1信号通路的活性实现的。     

黄芪甲苷对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制

目的　探讨黄芪甲苷（AS-IV）对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制。方法　将传代后的ARPE-19细胞分为5组。空白组:在暗环境中培养细胞,不采用蓝光照射;光照组:采用辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm^-2的蓝光照射细胞4 h;光照+AS-IV组:采用相同辐射强度的蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siNC组:将细胞转染对照siRNA后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siPINK1组:将细胞转染siPINK1后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,DHE荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）含量,Western blot检测蛋白表达。结果　当连续蓝光照射4 h以上,ARPE-19细胞存活率均低于80%,故选择照射时间为4 h进行后续实验。光照+AS-IV组细胞存活率明显高于光照组［（93.85±1.79）%、（79.24±3.25）%,t=11.141、P<0.001］。光照+AS-IV组细胞凋亡率明显低于光照组［（11.03±1.65）%、（27.85±3.44）%,t=12.472、P<0.001］。光照组细胞线粒体膜电位高于空白组（绿/红色荧光强度比值分别为1.72±0.25、0.58±0.07,t=12.418、P<0.001）,但是光照+AS-IV组细胞线粒体膜电位（绿/红色荧光强度比值为0.81±0.10)则低于光照组（t=9.559、P<0.001）。光照+AS-IV组细胞ROS含量少于光照组（t=6.341、P<0.001）。蓝光照射4 h后,光照+AS-IV组ARPE-19细胞PINK1蛋白（1.18±0.14,t=9.035、P<0.001）和Parkin蛋白（0.77±0.09,t=8.106、P<0.001）相对表达量则明显高于光照组。与光照组相比,光照+AS-IV组ARPE-19细胞的细胞质细胞色素C（Cyt C）蛋白相对表达量降低至0.67±0.08（t=17.059、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量升高至0.16±0.03（t=5.491、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值升高至3.44±0.27（t=34.047、P<0.001）。与光照+AS-IV组相比,光照+AS-IV+siNC组ARPE-19细胞的细胞质和线粒体Cyt C蛋白相对表达量（0.70±0.09、0.15±0.03）、总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值（3.26±0.33）差异均无统计学意义（均为P>0.05）,而光照+AS-IV+siPINK1组ARPE-19细胞的细胞质Cyt C蛋白相对表达量（1.20±0.15）较光照+AS-IV+siNC组升高（t=8.085、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量降低至0.02±0.01（t=11.628、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值则降低至0.85±0.13（t=19.224、P<0.001）。结论　AS-IV对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞具有一定的保护作用,可抑制细胞产生大量ROS,缓解细胞线粒体损伤和细胞凋亡,维持细胞活力和自噬过程,其机制可能与AS-IV上调细胞PINK1/Parkin信号通路有关。     

雷公藤甲素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的抑制作用

目的　探讨雷公藤甲素对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化损伤的抑制作用及其机制。方法　RPE细胞传代培养,分为对照组、氧化损伤组（100 μmol·L^-1 H₂O₂）和雷公藤甲素（100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1）干预组。应用MTT比色法检测细胞增殖率,流式细胞技术测定细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,Hoechst33258染色观察细胞凋亡,Western-blot检测RPE细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）蛋白的表达水平。结果　雷公藤甲素能明显抑制H₂O₂诱导的RPE细胞活性的下降,用不同浓度雷公藤甲素处理后,RPE细胞存活率分别提高到（56.00±2.76）%和（70.33±3.85）%,与氧化损伤组［（32.67±3.08）%］相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。雷公藤甲素能减少细胞内ROS生成,抑制细胞凋亡,不同浓度雷公藤甲素处理后,RPE细胞凋亡率分别下降到（50.33±4.61）%和（46.67±4.73）%,与氧化损伤组（67.00%±3.42%）相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。雷公藤甲素组SOD蛋白表达显著高于氧化损伤组,MDA蛋白表达显著低于氧化损伤组（P<0.05）。结论　雷公藤甲素对RPE细胞氧化损伤具有抑制作用,其作用机制与上调SOD的表达及下调MDA的表达有关;雷公藤甲素有望成为治疗视网膜病变的有效药物。     

胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）基因表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的调控作用

目的　探讨胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）基因表达对脉络膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的调控作用。方法　参照Lipofectamine^TM2000说明将干扰IGF-1R表达的siRNA转染人CM细胞OCM-1作为IGF-1R-siRNA组，并设置无干扰作用的siRNA及加入脂质体的细胞作为阴性对照组和空白对照组，AG490作为STAT3信号通路抑制剂，收集转染48 h的细胞，通过CCK8法及流式细胞仪分别检测细胞活力及细胞凋亡率；Western blot检测STAT3信号通路磷酸化的p-JAK2和p-STAT3及下游靶基因Cyclin D1和Bcl-xL的表达。结果　阴性对照组IGF-1R表达量（0.243±0.036）与空白对照组（0.228±0.030）差异无统计学意义（P>0.05），IGF-1R-siRNA组IGF-1R表达量（0.071±0.010）低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。IGF-1R-siRNA转染的OCM-1细胞IGF-1R的表达明显降低；与空白对照组比较，IGF-1R-siRNA组细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA组p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-xL的蛋白表达均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA+AG490组细胞活力低于IGF-1R-siRNA组，细胞凋亡率高于IGF-1R-siRNA组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA组p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-xL的蛋白表达均高于IGF-1R-siRNA+AG490组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　下调 IGF-1R基因表达可通过抑制STAT3信号通路降低CM细胞增殖并诱导细胞凋亡。