牛膝多肽促大鼠海马神经元突起的生长

目的 研究牛膝多肽(ABPP)对体外培养的大鼠海马神经元突起生长的促进作用及其对生长相关蛋白-43 (GAP-43)和神经丝蛋白(NF-H)mRNA和蛋白表达的影响. 方法 以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测ABPP对海马神经元细胞活性的影响,通过免疫荧光细胞化学法,采用Image-Pro Express软件测量不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h,对海马神经元神经突起生长的影响;通过实时荧光定量PCR法定量分析不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药6h,对海马神经元GAP-43和NF-H基因表达的影响;采用免疫印迹法观察不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h后,对海马神经元GAP-43 和NF-H蛋白表达的影响.同时应用胞外信号调节激酶(ERK)特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养海马神经元,分析ABPP对海马神经元的作用与ERK通路的关系. 结果 ABPP可有效地促进海马神经元突起的生长,加药后24h浓度为1.0mg/L,作用最强;实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光细胞化学法和免疫印迹检测的结果表明,ABPP能增加体外培养的海马神经元GAP-43和NF-H的mRNA和蛋白表达,PD98059可抑制该过程. 结论 ABPP能促进体外培养的海马神经元神经突起的生长,其作用与上调GAP-43和NF-H 基因的表达相关,并可能与ERK通路有关.     

牛膝活性提取物对大鼠海马神经元生长的促进作用

目的:研究牛膝活性提取物(ABPPk)对体外培养的大鼠海马神经元生长的促进作用.方法:以体外原代培养的胎鼠海马神经元为模型,通过微管蛋白(β-tubulinⅢ)免疫荧光染色,采用Leica Qwin软件测量不同浓度ABPPk处理24 h对海马神经元突起延伸和突起分支的影响;通过突触结合蛋白(SYN)和突触后致密蛋白(PSD95)双标免疫荧光染色,采用LeicaQwin软件测量ABPPk(250 ng/ml)处理7d对海马神经元突触形成的影响;通过免疫印迹定量分析不同浓度ABPPk作用24 h对海马神经元生长相关蛋白(GAP-43)表达水平的影响,作用7d对PSD-95表达水平的影响,以及ABPPk(250 ng/ml)作用不同时间对磷酸化胞外信号调节激酶(ERK1/2)水平的调节.分析ABPPk对海马神经元的作用与ERK通路的关系.结果:ABPPk可有效促进海马神经元的突起延伸和突触形成,免疫印迹结果显示,ABPPk能显著增加海马神经元GAP-43和PSD-95蛋白表达,作用5 min即能显著上调ERK磷酸化水平,作用15 min ERK磷酸化水平达到峰值,PD98059可抑制该过程.结论:ABPPk能促进体外培养的海马神经元突起生长和突触形成,上调GAP-43和PSD-95蛋白水平,其作用可能与ERK通路的激活有关.     

神经再生素促进神经干细胞的生长和分化

目的:研究神经再生素对体外培养神经干细胞分化的促进作用及对其生长相关蛋白(GAP43)、神经丝蛋白(NF-H)表达的影响.方法:取出生3～5d的新生SD大鼠大脑皮层进行神经干细胞的体外培养、鉴定,神经干细胞与0、 1、 2mg/L的神经再生素(NRF)共培养8d,相差显微镜观察分析,应用Real-time PCR对与不同浓度的NRF(0、 1、 2、 4、 8mg/L)共培养8d的神经干细胞进行GAP43、 NF-H的表达量检测.结果:成功培养出具有多向分化潜能的神经干细胞;神经再生素可明显促进神经干细胞的分化,并能在一定范围内随浓度递增而有效促进GAP43、 NF-H的表达,且最佳作用浓度为4mg/L.结论:神经再生素可以促进神经干细胞的生长和分化.     

ATP诱导大鼠原代培养海马神经元神经毒性及对GAP-43表达的影响

目的:观察不同浓度ATP对大鼠原代培养海马神经元的损伤作用及GAP-43表达的影响,并探讨其可能机制。方法:原代培养新生SD大鼠海马神经元至第8 d,MTT法检测不同浓度ATP作用下海马神经元的存活率,倒置相差显微镜观察海马神经元的形态学改变,免疫荧光细胞化学法观察损伤后海马神经元GAP-43的表达变化,钙离子荧光染料Flou-4/AM检测细胞内钙离子的浓度变化。结果:低浓度ATP对海马神经元无明显影响,高浓度ATP对海马神经元有毒性损伤作用,且呈剂量依赖性。P2X受体拮抗剂可阻断ATP介导的细胞毒性作用,但P2X7受体拮抗剂的阻断作用不明显。高浓度ATP作用海马神经元4 h后,GAP-43的表达水平明显上调,且表达部位发生改变,主要表达于胞体,突起表达减少甚至消失。高浓度ATP组荧光衰减速率明显减慢,说明高浓度ATP参与了海马神经元细胞内钙调节。结论:高浓度ATP对海马神经元有毒性损伤作用,损伤后GAP-43代偿性表达增多,且与细胞内钙离子浓度变化有关,P2X7受体可能不是介导ATP此作用的主要受体亚型。     

中药神经再生素作用于背根神经节细胞过程中基因的表达变化

目的 探讨中药神经再生素(NRF)作用的分子生物学机制。方法 采用半定量PCR方法，观察和比较NRF组、NGF组和空白对照组中生长相关蛋白43(GAP-43)、低分子量神经丝蛋白(NF-L)、翻译延伸因子2A3-2(EF-Ts，RRAJ5161)和锌指样蛋白DDP2(F196315)基因水平的表达变化。结果 在NRF作用于离体培养的DRG细胞过程中，GAP-43、NF-L、2A3-2和DDP2基因表达在不同时间呈不同程度的上调。结论 NRF促神经生长的作用与NGF相似，可作用于蛋白翻译水平，促进神经细胞的生长；作用于细胞骨架蛋白水平，维持神经细胞的形态和神经细胞正常生理活动；作用于神经细胞特异的蛋白水平，具有维持细胞生存及促进神经细胞突起生长的作用；还可以作用于反式因子调控水平，影响相关基因的表达，促进神经元存活和神经突起延伸。     

神经再生素促大鼠背根神经节生长作用的研究

目的研究神经再生素（NRF）对体外培养新生大鼠背根神经节生长及NF—H表达的影响。方法体外大鼠背根神经节（DRG）培养；免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR和Western blot等方法。结果免疫荧光细胞化学结果提示，NRF能促进背根神经节神经突起的生长，浓度为2．0mg／L时生长状况最佳；实时荧光定量PCR和Western blot结果提示，NRF能增加体外培养的背根神经节NF-H mRNA和蛋白的表达，在浓度为2．0mg／L时表达最高。结论NRF能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和NF—H的表达，表明NRF对发育期感觉神经元具有神经营养作用。     

氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞 connexin43表达的影响

目的: 研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白connexin43表达的影响。方法: 体外培养的内皮细胞分为4组:对照组,50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L ox-LDL干预组,干预24 h后通过RT-PCR方法检测各组connexin43 mRNA的表达有无差别;通过免疫细胞化学方法检测对照组和100 mg/L ox-LDL干预组之间connexin43蛋白的表达水平有无差别。结果: 不同浓度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL干预24 h能引起内皮细胞connexin43 mRNA的表达增加(P<0.01);100 mg/L的ox-LDL干预24 h内皮细胞connexin43蛋白表达增加(P<0.01)。结论: Ox-LDL短期干预可引起人脐静脉内皮细胞connexin43 mRNA和蛋白表达水平增加。     

神经生长颗粒含药血清对大鼠背根神经节生长的影响

目的: 研究神经生长颗粒(NGG)含药血清对体外培养新生大鼠背根神经节生长及高分子量神经丝蛋白(NF-H)和生长相关蛋白43(GAP43)表达的影响.方法: 采用体外大鼠背根神经节(DRG)植块培养,通过免疫荧光细胞化学法,观察不同剂量的含药血清对DRG神经突起生长的影响;采用DRG单细胞分离培养,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别观察不同剂量的含药血清对DRG细胞NF-H和GAP43基因及蛋白表达的影响.结果: 免疫荧光细胞化学法提示NGG含药血清能促进DRG神经突起的生长;实时荧光定量PCR和免疫印迹法结果提示NGG含药血清能增加体外培养的DRG细胞NF-H、 GAP43 mRNA和蛋白的表达.结论: NGG含药血清能促进体外培养DRG神经突起的生长并促进NF-H和GAP43的表达,表明NGG对发育期感觉神经元具有一定的神经营养作用.     

激活的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白及其对海马神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨切割穹隆海马伞的侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（CLU）及体外CLU诱导海马神经干细胞分化为神经元的情况。
方法 分别用切割穹隆海马伞的海马提取液、正常海马提取液、DMEM/F12 培养基培养星形胶质细胞,制备切割12h、24h、48h组,正常组和对照组条件培养基;ELISA检测比较不同条件培养基中CLU蛋白的浓度;体外细胞培养采用CLU诱导海马神经干细胞分化,设诱导组和空白对照组,7d后通过微管相关蛋白2（MAP-2）免疫荧光及Hoechst标记观察海马神经干细胞向神经元的分化情况。 结果 正常组和对照组条件培养基中CLU浓度较低,约为（0.1037±0.0119）ng/L和（0.1170±0.0078）ng/L;切割组12h、24h、48h条件培养基中其浓度明显增高,分别为（0.1940±0.0364）ng/L、（0.4250±0.0724）ng/L和（0.2903±0.0472）ng/L,以24h组最高,约为正常组和对照组的4倍。CLU诱导组中MAP-2阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.05）,其占总细胞数的百分比分别为(11.67±2.57)%和（4.52±1.54）%,且诱导组中MAP-2阳性细胞突起更长、更丰富。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞可分泌更多的CLU,体外细胞培养中CLU可促进海马神经干细胞向成熟的神经元分化。     

不同强度运动预处理对全脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白-43、轴突生长抑制因子Nogo-A表达的影响

目的:探讨不同强度运动预处理对脑缺血大鼠脑组织海马区生长相关蛋白-43(GAP-43)、轴突生长抑制因子-A(Nogo-A)表达的影响。方法:用改良的Pulsinelli四血管阻断(4-VO)法制备SD大鼠全脑缺血再灌注模型,大鼠分为假手术组、脑缺血再灌注组、运动强度1预处理组、运动强度2预处理组。分别在缺血6h、1d、3d、7d时应用H-E染色观察大鼠脑组织海马CA1区神经细胞形态变化;免疫组织化学检测GAP-43、Nogo-A的表达;RT-PCR法检测GAP-43、Nogo-A mRNA的表达。结果:全脑缺血再灌注组神经元密度显著低于运动强度1预处理组,高于运动强度2预处理组;脑缺血再灌注组GAP-43的表达水平显著低于运动强度1预处理组,高于运动强度2预处理组;脑缺血再灌注组Nogo-A的表达水平显著高于运动强度1预处理组,低于运动强度2预处理组。结论:运动强度1预处理可促进神经元细胞的存活;而运动强度2预处理加重神经元细胞的损伤和丢失,其机制与调控脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区GAP-43、Nogo-A的表达有关。     

白藜芦醇预处理对大鼠皮质神经元氧糖剥夺/再复氧损伤后神经元突起生长的影响

目的探讨白藜芦醇预处理对大鼠皮质神经元氧糖剥夺/再复氧损伤后神经元突起生长的影响。方法体外皮质神经元氧糖剥夺150min,复氧培养24 h。实验分为正常组、对照组和5μmol/L白藜芦醇预处理组。免疫荧光法鉴定神经元,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光法和Western blotting检测微管相关蛋白2(MAP-2)和生长相关蛋白43(GAP-43)的表达,并计数神经元突起的长度和数目。结果培养细胞均高表达神经元特异性标记物MAP-2。白藜芦醇组细胞活力较对照组明显增加(0.551±0.009比0.436±0.013,P0.01),而凋亡则明显降低(18.3%±1.3%比35.3%±1.9%,P0.01),上调MAP-2(0.790±0.102比0.462±0.063,P0.01)和GAP-43(0.768±0.084比0.424±0.065,P0.01)蛋白的表达,增加神经元突起的长度(89.510±6.939比61.538±9.14,P0.01)和数目(6.347±1.002比3.040±0.608,P0.01)。结论白藜芦醇预处理能减轻氧糖剥夺/再复氧对神经元的损伤,促进神经元突起的生长。     

β-淀粉样蛋白对原代培养大鼠海马神经细胞Sorcin、RyR2mRNA基因表达的影响

目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养的大鼠脑海马神经细胞内钙稳态相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的影响.方法 新生1-3天的Wistar大鼠,取其海马组织,原代培养8d后,用已老化过的Aβ25-35对海马神经细胞进行1μmol/L,10μmol/L和20 μmol/L剂量的染毒,培养24和48 h后分别观察海马神经细胞形态、和海马神经细胞内钙调节相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的基因表达水平.结果 随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长,可发现随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长,海马细胞出现细胞凋亡的比例增加,其中Aβ25-35 20 μmol/L染毒48 h培养海马细胞中出现了大量早期凋亡细胞和少量中期凋亡细胞.实时定量PCR结果显示,10 μmol/L Aβ5-35在对原代细胞染毒24和48 h后Sorcin mRNA的相对表达量为(1.42±0.03)和(1.63±0.02),与对照组相比,表达增加(P＜0.05);20μmol/L Aβ25-35在对原代细胞染毒24h和48 h后Sorcin mRNA的相对表达量(2.11±0.05)和(2.23±0.05),与对照组相比,表达增加(P＜0.05);20 μmo]/L Aβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后RyR2mRNA的相对表达量为(1.64±0.03)和(1.95±0.03),表达显著高于对照组相(P＜0.05).结论 Aβ具有神经毒性,可抑制海马神经细胞的生长,可通过作用于钙调节相关蛋白的表达,诱发阿尔茨海默氏病(AD)的发生.     

色素上皮源性因子对海马神经元的营养和促突起生长作用

目的:了解色素上皮源性因子(PEDF)对海马神经元的营养和促突起生长作用。方法:采用胚胎大鼠海马神经元体外培养技术,观察不同浓度的PEDF在不同培养条件下神经元的存活和突起生长的影响。结果:在无血清接种,后期培养液含B27条件下,PEDF可提高神经元的存活率,并对存活细胞的活力和突起生长有明显促进作用。但在血清接种,培养液无B27的培养条件下,PEDF不能替代B27维持神经元的生长。而在培养液有B27条件下,PEDF可以促进突起生长并具有一定的剂量依赖性。低浓度(25ng/ml)PEDF相对有利于轴突生长,而高浓度(100ng/ml)PEDF相对有利于树突生长。结论:PEDF对海马神经元具有营养作用,可以促进神经元突起的生长。PEDF的不同浓度可以影响海马神经元树突和轴突的生长。     

蝎毒耐热蛋白对原代培养海马神经元NPY表达的影响

探讨具有抗癫痫反复发作作用的蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat-resistant protein,SVHRP)对大鼠海马神经元神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达的影响。采用免疫细胞化学ABC法与HPIAS系列彩色病理图文定量分析系统相结合,检测NPY-免疫阳性产物(NPY-IR)表达的变化,用RT-PCR技术观察NPY mRNA表达水平的变化。终浓度范围为0.2、2、20和200μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育24h后,NPY阳性神经元的反应强度明显增强,具有剂量-反应关系。终浓度为20μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育3、6、9、12和24h,NPY阳性反应强度增强,并呈时间-反应关系。RT-PCR结果显示,20μg/ml的SVHRP与原代培养海马神经元共孵育24h后,NPY mRNA的表达明显增加。以上结果提示SVHRP可诱导原代培养海马神经元NPY阳性反应和NPY mRNA的表达。     

睫状神经营养因子及神经突起素上调莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点1表达促进受损神经元样细胞突起再生

目的 探讨莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点1(Pim-1)基因在体外受损神经元中的表达变化，以及神经营养因子调节Pim-1表达进而促进受损神经元突起再生的相关分子基础。方法 用反式视黄酸将Neuro-2a（N-2a）细胞诱导成为神经元样N-2a（N-2a-N）细胞，用去铁胺亚磺酸盐(DFO)抑制N-2a细胞增殖，用丙烯酰胺（ACR）损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、损伤组、睫状神经营养因子（CNTF）及神经突起素（Nrn1）组,每组4个样本。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达；用Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。用Western blotting检测调节Pim-1活性的相关分子，细胞存活、凋亡相关分子及轴突再生相关分子的表达变化。结果 细胞免疫荧光显示，N-2a-N细胞表达神经元标志分子β Ⅲ-微管蛋白（β-Ⅲ tubulin）和neurofilament-200，并表达Pim-1。50 μmol DFO有效抑制N-2a细胞的增殖。应用 -1 mmol/L-的ACR成功建立N-2a-N细胞突起损伤模型。N-2a-N细胞损伤后，Pim-1基因表达呈现先降低后升高，再降低的趋势。与损伤组相比，CNTF组和Nrn1组最长神经突起所占比例明显增加，细胞内信号转导分子细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、磷酸化信号转导及转录激活因子3（p-STAT3）及Pim-1表达上调，凋亡相关分子cleaved Caspase-3及Bax表达下调，抗凋亡相关分子Bcl-2表达上调，神经突起生长相关分子生长相关蛋白43（GAP-43）表达上调.结论 修复受损N-2a-N细胞需要过表达Pim-1基因。神经营养因子CNTF、Nrn1可激活受损N-2a-N细胞ERK1/2及STAT3信号通路，进而上调Pim-1及GAP-43表达，并促进细胞突起再生。     

The effect of gallium nitride on long-term culture induced aging of neuritic function in cerebellar granule cells

Gallium nitride (GaN) has been developed for a variety of microelectronic and optical applications due to its unique electric property and chemical stability. In the present study, n-type and p-type GaN were used as substrates to culture cerebellar granule neurons to examine the effect of GaN on cell response for a long-term culture period. It was found that GaN could rapidly induce cultured neurons to exhibit a high phosphorylated Akt level after 20h of incubation. It was assumed that the anti-apoptotic effect of Akt phosphorylation could be correlated with cell survival, neurite growth and neuronal function for up to 35 days of incubation. Morphological studies showed GaN induced larger neuronal aggregates and neurite fasciculation to exhibit a dense fiber network after 8 days of incubation. Western blot analysis and immunocytochemical characterization showed that GaN still exhibited the expression of neurite growth and function, such as high levels of GAP-43, synapsin I and synaptophysin even after 35 days of incubation. In addition, survival of cerebellar granule neurons on GaN was improved by the analysis of lactate dehydrogenase (LDH) release from damaged cells. These results indicated that neuronal connections were formed on GaN by a gradual process from Akt activation and cell aggregation to develop neurite growth, fasciculation and function. Therefore, GaN offers a good model system to identify a well-characterized pattern of neuronal behavior for a long-term culture period, consistent with the development of a neurochip requiring the integration of biological system and semiconductor material.