“荧光定量PCR溶解曲线法”监测人TCRβ链CDR3谱系漂移技术的建立

目的 建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).方法 提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生.结果 正常人外周血T细胞TCR β链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"(melting curve spectratyping)呈现溶点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布;9例大肠癌患者的外周血TCR β链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,有的患者部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族.结论 "荧光定量PCR溶解曲线分析TCR CDR3谱系漂移技术",方法稳定简便,能较好的监测正常人和临床样本外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).     

强直性脊柱炎患者外周血TCR Vα CDR3谱系基因扫描分析研究

目的:探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3(TCR Vα CDR3)谱系多态性,为AS的免疫发病机制的研究提供实验基础。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增34个TCR Vα亚家族,经免疫扫描谱型技术分析AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TCR Vα CDR3的谱系漂移情况。结果:5例正常健康对照PB-MC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布。所有AS患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括:单峰、寡峰/寡峰趋势、偏峰和不规则异常峰型。34个TCR Vα亚家族中,共有17个亚家族在少数患者中的扫描谱型呈单峰即单克隆增生。结论:AS患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性,表明T细胞在AS免疫发病机理中扮演重要角色。单/寡克隆增生的T细胞有可能是AS发病中的自身反应性T细胞,将为AS的发病机制的进一步研究提供基础依据。     

抗病毒治疗对CHB患者外周血TCRβ链CDR3谱系的影响

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治疗前后T淋巴细胞受体(TCR)β链各家族互补决定区3(CDR3)谱系的变化,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化。方法:采用荧光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲线法对11例CHB患者抗病毒治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)T淋巴细胞受体β链可变区(TCR BV)基因各家族CDR3谱系进行分析,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化。分析TCR CDR3谱系与CHB患者血清病毒载量的关系。结果:11例CHB患者抗病毒治疗后多个TCR CDR3谱系均出现了不同程度偏移。低病毒载量组(HBV DNA≤104拷贝/ml)治疗后谱型偏移率显著高于高病毒载量组(HBV DNA≥105拷贝/ml)。结论:CHB患者抗病毒治疗后单寡谱型偏移率与治疗前血清HBV DNA的水平相关。     

T-ALL及T细胞株相关TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的了解T细胞-急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者外周血中的T细胞及T细胞株的TCR Vβ基因谱系及其克隆性增殖情况。方法利用RT-PCR方法扩增6个不同的T细胞株和6例初发未治T-ALL病人外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3(CDR3)，PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性，部分T细胞株的单克隆PCR产物进一步进行序列分析。结果与正常人外周血表达全部24个Vβ亚家族不同，6例T-ALL病人分别表达5～12个Vβ亚家族。6例病人均存在1个或多个Vβ亚家族的寡克隆或双克隆增殖T细胞，另外，还有一些Vβ亚家族多克隆模式发生改变，呈现寡克隆性增殖的趋势。T细胞株多显示为表达一个Vβ亚家族的单克隆T细胞，不同T细胞株的CDR3长度和序列不尽相同。结论T-ALL患者外周血T细胞的TCR Vβ谱系出现限制性改变，均可检测到克隆性增殖T细胞，尚需进一步鉴定其性质(肿瘤性或抗原特异性增殖)，对于检测微小残留病变和设计抗白血病独特型疫苗均有一定的意义。     

葡萄膜炎患者外周血TCR Vα谱系多态性分析

目的 探讨葡萄膜炎患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3 (TCR Vα CDR3)谱系特点及多态性.方法 采用RT-PCR扩增葡萄膜炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中TCR Vα 34个亚家族,经免疫扫描谱型技术分析34个亚家族谱型.结果 5例正常健康人PBMC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布,4例葡萄膜炎患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括单峰、寡峰/寡峰趋势,偏峰和不规则异常蜂型.34个TCR Vα亚家族中,不同亚家族异常峰型出现的频率不同,非正态异常峰型出现频率较高的亚家族有Vα13和Vα17(均为3/4),而Vα1.1、Vα10、Vα20、Vα28和Vα28亚家族均未出现异常峰型.TCR Vα7在HLA-B27阴性的患者(U2)中出现异常峰型,在HLA-B27阳性的3个患者(U1、U3、U4)中并未出现这个亚家族的异常;TCR Vα13则相反,即在HLA-B27阳性的3个患者中均出现异常峰型,而在HLA-B27阴性的患者中正常.结论 葡萄膜炎患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性特点,单/寡克隆增生的T细胞有可能是葡萄膜炎发病中的自身反应性T细胞.     

苯中毒工人外周血TCR Vβ克隆性T细胞利用特点

目的:分析苯中毒工人外周血中克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点.方法:利用RT-PCR方法扩增11例苯中毒工人外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的CDR3, 阳性产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而了解其克隆性.结果:健康者外周血中可检测到24个Vβ亚家族, 11例苯中毒工人仅检测到2～10个Vβ亚家族.11例苯中毒工人均存在1个或多个Vβ亚家族T细胞出现寡克隆及寡克隆趋势.Vβ2、4、5、6和Vβ21的寡克隆T细胞出现频率较高.结论:苯中毒工人外周血TCR Vβ亚家族T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖, 这可能是机体苯中毒后所引起的特异性免疫反应.     

APL相关TCRVα6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周m TCR Vα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点.方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析.结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219).结论:APL患者外周血T细胞出现的TCR Vα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料.     

慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化的研究

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化特征。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8例CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果:基因扫描显示所有8例CHB患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生。Vβ8、Vβ11、Vβ12出现单克隆增生的频率相对较高。8例健康者TCR Vβ基因亚家族均为多克隆。结论:CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ亚家族存在克隆性增生。     

不同HBV感染状态患者外周血CD4~+CD25~+Tregs TCR CDR3谱系漂移特征分析

目的探讨慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)及急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)这3种不同HBV感染状态下患者外周血中CD4~+ CD25~+调节性T细胞(T regulatory cells,Tregs)T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链各家族互补决定区3(complementarity-determining region 3,CDR3)谱系漂移特征。方法采集3例正常人、5例慢性HBV携带者、12例CHB及5例AHB患者外周抗凝静脉血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);磁珠分选法分选CD4~+ CD25~+Tregs,提取总RNA,逆转录合成c DNA;根据TCRβ链24个可变区基因(TRBV)家族设计相应的上游引物,并在β链恒定区(BC)设计1条共用的FAM荧光标记下游引物及对照引物。PCR扩增出24个包含完整CDR3区的TRBV家族的PCR产物,电泳鉴定目的片段;PCR产物送上海基康用毛细管电泳法进行基因扫描;用Peak Scanner Software v1.0软件分析TRBV家族CDR3谱系特征。结果不同HBV感染状态下24个TRBV家族CDR3谱系图均呈现一个或者多个形态不一、数量不等的单峰、寡峰、偏峰谱型,其中一些家族表达极低或缺失,在1.5%琼脂糖凝胶电泳图上多数家族于预测范围大小处呈现1条模糊条带,部分家族出现清晰条带或无条带;对不同HBV感染者间各TRBV家族CDR3谱系偏移率进行比较发现:慢性HBV携带者中BV7谱系偏移率明显高于CHB及AHB患者(P均0.05),CHB患者中BV15谱系偏移率明显高于慢性HBV携带者及AHB患者(P均0.05),AHB患者中BV23谱系偏移率明显高于CHB及慢性HBV携带者(P均0.05)。CHB患者外周血CD4~+ CD25~+Tregs TRBV家族CDR3克隆增生总体异常率与HBV DNA载量呈正相关关系(r=0.576 5,P=0.049 8)。结论部分优势利用的TRBV家族可能在感染HBV后免疫耐受以及清除病毒中发挥重要作用。     

Jurkat(E6-1)细胞TCR alpha和beta链重排基因家族取用分析

目的 探讨人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat(E6-1)TCR alpha和beta链的重排基因家族的取用及基因、氨基酸序列与结构,为Jurkat细胞做为单克隆T细胞研究的模型提供基础.方法 采用T细胞TCR的免疫扫描谱型分析技术(im-munoscope spectratyping),监测Jurkat细胞的alpha和beta链各基因家族的取用,ABI测序仪测序出各取用家族基因的序列,并分析其氨基酸组成(DNA tools软件),模拟H{TCR的结构(CPH modle 2.0 Server和Informax 9.0).结果 Jurkat细胞TCR alpha链的基因家族取用为:可变区为TRAV1,连接区为TRAJ3;beta链的基因家族取用为:可变区为TRBV8S1,连接区为TRBJIS2.结论 Jurkat(F6-1)细胞的TCR alpha和beta链基因、氨基酸序列和结构的确定,将为Jurkat做为效应T细胞、TCR重排模型等方面的研究提供基础.     

Evaluation of the Copan Myco-TB kit for the decontamination of respiratory samples for the detection of Mycobacteria

The purpose of this study was to test a newly developed decontamination and fluidization kit for processing respiratory specimens for the detection of mycobacteria: the Myco-TB procedure (developed by Copan (Brescia, Italy)). This technique was compared with the Zephiran decontamination method in use in our hospital. Respiratory specimens (n?=?387: 130 endotracheal/bronchial aspirates, 172 bronchoalveolar lavages and 55 sputa) submitted to the University Hospital of Brussels between January 2016 and March 2017 were included. All samples were divided into two aliquots: one was subjected to the Myco-TB method and one to the Zephiran technique prior to culture. The sensitivities for culture for the Zephiran technique on solid media, the Myco-TB method on solid media and Myco-TB combined with the MGIT? system were respectively 67%, 87% and 89%. The contamination rates were 22% with both the Zephiran and Myco-TB method on solid media and only 4% with the Myco-TB kit combined with the MGIT? system. For direct microscopy, the sensitivities of the Zephiran method and the Myco-TB method were equal (40%) when the centrifugation time was 20 min. The Myco-TB decontamination method is easy and rapid to perform. It is more sensitive for culture as compared to the Zephiran method and gives lower contamination levels when combined with the MGIT? technique. When increasing the centrifugation step to 20 min, the sensitivity of direct microscopy is equal to the Zephiran method.     

Recommendations for the selection and alignment techniques for the determination of creatinine

In 2010, a working group from the French Society of Clinical Chemistry (Société fran?aise de biologie clinique -?SFBC) and the French Society of Nephrologie (SN) make a proposal to up-date the guidelines for measuring plasma creatinine.     

Cytogenetic evidence for the localisation of the gene for congenital adrenal hyperplasia

In the course of a study of the close linkage between the gene locus for the autosomal recessive disease, Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH), and the major histocompatibility compIex (MHC), a cytogenetic survey was undertaken. In one family, where a crossover might have occurred between some loci in the MHC complex and the locus for the 21–hydroxylase gene, there was also a crossover between the MHC locus and the centromere of chromosome 6.     

Strategies for the development of PSA-based vaccines for the treatment of advanced prostate cancer

Prostate cancer is the second leading cause of cancer death in males in the USA. Vaccine strategies represent a novel therapeutic approach. One potential target for a prostate cancer vaccine is prostate-specific antigen (PSA), due to its restricted expression in prostate cancer and normal prostatic epithelial cells. A number of PSAspecific epitopes have been identified that can activate cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and in turn lead to the killing of tumor targets by the peptide-specific CTLs. Strategies have now been employed in clinical trials using RNA-pulsed dendritic cell vaccines, recombinant protein vaccines, and recombinant viral vector delivery of vaccines. Newer approaches incorporating costimulatory molecules that enhance Tcell activation are also being investigated.