聚乙二醇化——药物输送的成功方法

聚乙二醇化是指用一个或多个聚乙烯乙二醇链连接起来针对蛋白质、多肽或非肽分子的一种修饰方法。这种聚合物是无毒,无免疫原性,无抗原性,高度溶于水,已得到美国食品药品管理局﹙FDA﹚的批准。聚乙二醇偶联药物有几个优点:在体内长期滞留性;更不易被代谢酶降解;减少或消除蛋白质免疫原性。由于这些性质,聚乙二醇提高了多肽和蛋白质作为治疗药物的潜力,从而在药物输送系统中发挥重要作用。综述了聚乙二醇修饰的原理与方法,聚乙二醇化在使用中的限制及应用。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α2a的研究

目的 探讨聚乙二醇（mPEG-ssMr5000和Mr20000)修饰重组人干扰素α2a（rhIFNα2a）的最佳反应条件。方法 在不同反应条件下，用聚乙二醇修饰rhIFNα2a，采用VSV－Wish细胞病变抑制法测定修饰后rhIFNα2a的体外抗病毒活性。结果 随着PEG对rhIFNα2a摩尔比增加和修饰反应时间的延长，rhIFNα2a修饰产物相对分子质量和不均一性增加，且随着rhIFNα2a修饰度的提高，其体外抗病毒活性逐渐降低。结论 初步确立了PEG修饰rhIFNα2a的反应条件，表明反应摩尔比与聚乙二醇的相对分子量是影响反应的关键因素。     

聚乙二醇化重组人生长激素对去垂体幼鼠胰岛分泌的影响及其机制

目的观测长效生长激素聚乙二醇化重组人生长激素（PEG-rhGH）是否引起胰岛素抵抗及其与短效生长激素注射用重组人生长激素（rhGH）的差异。方法3周龄SD雄性幼鼠106只,随机取88只进行去垂体手术造模,取成模的幼鼠54只分为模型组、rhGH组、PEG-rhGH组,另18只假手术组为对照组。分别给予生理盐水（0．25mg·kg-1．d-1）、rhGH（0．25mg·kg-1．d-1）、PEG-rhGH（1．4mg·kg-1周-1）处理。4周后进行糖耐量实验和胰岛素释放试验,计算胰岛素曲线面积与葡萄糖曲线面积比值,胰岛素稳态模型（HOMA-IR）;检测血清生长抑素水平;免疫组织化学法检测胰岛胰岛素（INs）、胰高血糖素（GLU）、生长抑素（SS）、胰多肽（PP）。结果PEG-rhGH组HOMA-IR较对照组、模型组低（P〈0．05）,与rhGH组比较无差异。AUCI／AUCG值组间比较显示PEG-rhGH组高于rhGH组,但无统计学差异。PEG-rhGH组GLU蛋白表达与模型组表达无差异。PEG-rhGH组INS表达较模型组表达上升（P〈0．05）。PEG-rhGH组SS、PP表达与rhGH无差异。血清SS各组间均无明显差异。结论未观察到PEG-rhGH引起去垂体大鼠胰岛素抵抗和胰岛D细胞分泌能力下降,对胰岛分泌蛋白的表达无明显影响。     

聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学研究

 目的研究聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学。方法用rhGH及其两种mPEG修饰物PGH₁、PGH₂免疫家兔,检测兔血清中的抗体滴度;对家兔单次背部皮下给药,定时取血清,建立rhGH及其修饰物的ELISA双抗夹心检测法,检测血清中的药物浓度,并计算药动学参数。结果经过mPEG修饰后,明显降低了rhGH的抗体滴度,缩短了抗体持续时间。在药动学研究中发现,其t_1/2β从3.1h显著延长到PGH₁的9.9h和PGH₂的22.5h,其AUC也有很大的提高。结论mPEG修饰后可明显降低rhGH的免疫原性,延长药物在动物体内的半衰期,降低清除率,改善其药动学性质。且改善程度随mPEG相对分子质量的增大而增强。     

麦冬多糖MDG-1聚乙二醇修饰物的合成与药动学研究

 目的 探索通过聚乙二醇修饰技术以改善麦冬多糖MDG-1的药动学性质。方法 以氨基聚乙二醇单甲醚作为修饰剂,研究聚乙二醇修饰MDG-1的合成反应条件,用高效凝胶色谱法测定修饰物的表观相对分子质量与接枝率,并考察其药动学性质。结果 确定了优化的合成条件,制得多种用不同相对分子质量聚乙二醇修饰的具有不同接枝率的MDG-1聚乙二醇修饰物,其生物半衰期较原药有明显的延长,延长程度与修饰剂的相对分子质量和修饰物的接枝率有关。结论 聚乙二醇修饰技术是一个具有进一步研究前景的改善MDG-1药动学性质的方法。     

高效液相色谱法检测PEG-rhGH注射液中rhGH残留

生长激素（Growth hormone，GH）是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的非糖基化蛋白质。具有调节代谢、刺激蛋白质合成和加速脂肪代谢等生理功能，能促进骨骼和肌肉组织的生长发育，目前广泛用于治疗儿童因内源性生长激素缺乏或不足而导致的身材矮小，也用于损伤、严重烧伤的外科治疗和外科手术中。现在应用基因工程技术生产的重组人生长激素已经替代由人脑垂体提取的生长激素广泛应用于临床。为了延长其半衰期，降低药物的免疫原性，减少给药次数，人们采用聚乙二醇（PEG）对重组人生长激素进行修饰。     

壳聚糖修饰的雷公藤甲素聚乙二醇-聚乳酸纳米粒的制备及质量评价

 目的制备壳聚糖修饰的雷公藤甲素聚乙二醇-聚乳酸纳米粒,并对其质量进行评价。方法通过降解反应合成低相对分子质量壳聚糖,采用黏度测定法和酸碱滴定法测定其黏均相对分子质量和脱乙酰度;以聚乙二醇-聚乳酸为载体材料,低相对分子质量壳聚糖为修饰剂,采用乳化溶剂挥发法制备壳聚糖修饰的雷公藤甲素聚乙二醇-聚乳酸纳米粒;并比较壳聚糖修饰前后纳米粒的性质;以纳米粒形态、粒径、Zeta电位、包封率、载药量及体外释放度为指标评价其质量。结果壳聚糖的黏均相对分子质量为20000,脱乙酰度为90%;经壳聚糖修饰后,纳米粒的粒径和Zeta电位均增大,包封率几无变化;所制备的纳米粒外观呈圆形或类圆形,平均粒径、Zeta电位、包封率和载药量分别为（202.62±1.52）nm、（0.17±0.12）mV、（58.20±2.43）%和（1.25±0.13）%。体外释放实验表明,纳米粒体外释放t_1/2为1.1h,在10.0h累积释放率达到74.0%。结论壳聚糖修饰对纳米粒的粒径及Zeta电位影响较大;制备的纳米粒包封率较高,粒径小,体外释放具有一定缓释特征。     

1H-NMR法测定单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的表面单甲氧基聚乙二醇含量及链密度

 目的 采用¹H-NMR定量地测定单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒（MePEG-PLGA-NP） 表面单甲氧基聚乙二醇（MePEG）的含量及链密度,并研究了不同相对分子质量及不同比例的单甲氧基聚乙二醇对单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒表面的物理化学性质影响。方法 以单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（MePEG-PLGA）为载体,自乳化溶剂扩散法制备了聚乙二醇化聚乳酸-羟基乙酸纳米粒,并对其平均粒径和Zeta电位进行表征。¹H-NMR用于确定单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸的结构组成并测定了单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒表面的单甲氧基聚乙二醇的含量及链密度,并与比色法进行比较。结果 单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物共聚物的结构组成与标示量基本一致;聚乙二醇的相对分子质量相同时,随着单甲氧基聚乙二醇比例的增加,单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的平均粒径逐渐减小,Zeta电位的绝对值也逐渐减小,粒子表面的单甲氧基聚乙二醇含量（α）逐渐增加,其表面单甲氧基聚乙二醇的链密度（δ）逐渐增大,相邻两单甲氧基聚乙二醇分子链间的距离（D）逐渐减小;相同比例,随着单甲氧基聚乙二醇链长度的增加,单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的平均粒径与Zeta电位都无明显差别,而α逐渐增加,δ逐渐减小,D逐渐增大;同种单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒,比色法测定的α值比¹H-NMR测定的值偏高。结论 ¹H-NMR能够定量地测定单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒表面的单甲氧基聚乙二醇含量及链密度;与比色法相比,¹H-NMR测定的粒子表面单甲氧基聚乙二醇的含量更准确;实验范围内,单甲氧基聚乙二醇的相对分子质量和比例可以对纳米粒的平均粒径,Zeta电位和表面单甲氧基聚乙二醇含量及链密度等物理化学性质产生影响。     

细胞因子聚乙二醇修饰物的研究进展

 目的综述细胞因子聚乙二醇(PEG)修饰物的研究进展。方法通过查阅近年来国内外的相关文献，从制备、产物稳定性及药物动力学等方面进行了总结。结果与结论细胞因子聚乙二醇修饰物的稳定性与体内药动学特性均有改善，其生物活性的发挥则受多种因素的影响，但可通过定点选择性修饰、优化反应条件等手段提高PEG修饰物的生物活性。     

聚乙二醇维生素E琥珀酸酯修饰的姜黄素脂质体的药代动力学及在体肠吸收

目的考察聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)修饰的姜黄素脂质体的药代动力学和在体肠吸收。方法大鼠灌胃给药,高效液相色谱法测定各时间点的血药浓度,应用DAS软件处理数据;采用大鼠在体单向灌流模型,考察TPGS修饰的姜黄素脂质体在不同肠段的吸收情况。结果 TPGS修饰的姜黄素脂质体的血药浓度-时间曲线下面积(AUC),最大血药浓度(Cmax)分别为游离药物的2.13、2.61倍;其十二指肠、空肠、回肠、结肠各肠段的吸收速率常数(Ka)相对于游离药物分别提高了0.84、1.77、1.48、4.99倍,有效渗透率(Peff)相对于游离药物分别提高了1.56、2.06、2.82、7.17倍。结论 TPGS修饰的姜黄素脂质体有良好的促吸收效果,并能提高姜黄素的生物利用度。     

肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量控制中的应用

 目的通过肽图谱分析,鉴定重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性。方法采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法测定肽图;用LC-MS/MS和N端氨基酸测序鉴定产品氨基酸序列。结果建立重组人甲状旁腺素1-34产品肽图测定法,并鉴定出肽图异常产品的氨基酸序列。结论肽图分析能有效地控制重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性,对该产品的质量控制具有重要意义。     

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??OBJECTIVE To establish the quality control system for the recombinant human GLP-1 analogue fusion protein.METHODS The potency of the fusion protein was determined by luciferase reporter gene assay. The purity was analyzed by non-reduced SDS-PAGE and SEC-HPLC respectively. RP-HPLC was used for the peptide mapping. ELISA was used to analyze the identification of the final products. The molecular mass and peptide mass spectra were analyzed by LC-ESI-MS technique. Other control tests were performed according to the requirements in the Chinese Pharmacopoeia (Volume ??, 2010 edition). RESULTS Control tests were performed on three different lots of bulks and final products of recombinant GLP-1 analog fusion protein by the developed methods. The results showed that all the indexes met the requirements in the Guideline for Quality Control of Recombinant DNA Products for Human Use and Chinese Pharmacopoeia (Volume ??, 2010 edition). The molecular weight of the recombinant human GLP-1 analogue fusion protein was 71 361.0, which was in conformity with the theoretical value. CONCLUSION The developed methods and standard may assure the safety, effectiveness, and controllability of the recombinant human GLP-1 analogue fusion protein, which might be used for the routine quality control of products of the same kind.     

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??OBJECTIVE To develop the quality control methods of a recombinant CTLA4-Fc fusion protein. METHODS Mehtods for quality research of CTLA4-Fc fusion protein were established, such as reporter gene assay for bioassay based on CTLA4/IL-2-Luciferace/Jurkat cells, binding activity with B7 by SPR, purity by SEC-HPLC and CE-SDS, charge heterogeneity analysis by IEF, identity by peptide mapping and MECK, determination of sialic acid by RP-HPLC and content analysis of N-glycan by HILIC-HPLC. RESULTS The bioactivity EC₅₀ of CTLA4-Fc fusion protein was (0.40??0.08) ??g??mL^-1, and the RSD was 20.00%. The relative binding activity with B7 by BIAcore test was (91.72??0.12)%,and the RSD was 0.14%. The purity determined by SEC-HPLC was(99.09??0.01)%,and the RSD was 0.01%. The purity determined by reduced CE-SDS was(100??0.00)%. The purity determined by non-reduced CE-SDS was(98.50??0.17)%, and the RSD was 0.18%. The pI of its major zone ranged from 4.6 to 5.9, which was consistent with the reference substance in peptide mapping. CTLA4-Fc fusion protein and its variant could be identified by MECK. The content of sialic acid determined by RP-HPLC was (10.16??0.41)mol/mol protein and the RSD was 4.07%. The contents of major N-glycoforms were as follows:G0F was 7.5%,G1F was 15.0%,G2F was 17.1%,G1FS1 was 4.2%,G2FS1 was 19.5% and G2FS2 was 9.6%. CONCLUSION The evaluation methods for critical quality attribute of CTLA4-Fc fusion protein were been initially established and provide reference for the quality control of this product.     

薏苡仁醇溶蛋白水解工艺优化及其ACE 抑制活性的研究

目的：对薏苡仁中含量最丰富的醇溶蛋白水解条件进行优化,并对其水解产物进行血管紧张素转化酶（ACE）体外活性评价。方法：利用胃蛋白酶水解薏苡仁醇溶蛋白,邻苯二甲醛法测定水解度,通过正交实验优化醇溶蛋白酶解条件。酶解液超滤（截留分子量3 kD）冻干得到小分子量多肽,采用高效液相色谱法对其ACE 抑制活性进行测定。结果：薏苡仁醇溶蛋白酶解的最佳条件为：底物浓度1%,酶与底物浓度比1颐5,水解时间48 h;酶解物在0.1 mg·mL-1 浓度下体外ACE 抑制率为83.40%依0.93%。结论：醇溶蛋白水解产物表现出较强的体外ACE 抑制作用,为薏苡仁降压作用的进一步研究及功能食品的开发提供了理论支持。     

加味痛泻要方对肠易激综合征机制的探讨

目的观察加味痛泻要方联合匹维溴铵治疗肝郁脾虚证腹泻型肠易激综合征的有效性。方法将符合纳入标准的100例患者按随机数字表法分为对照组和治疗组各50例,对照组给予西药匹维溴铵,治疗组在此基础上联合加味痛泻要方治疗,两组疗程均为4周。观察各组临床总有效率、临床症状积分评分(腹痛、腹泻、腹胀、排便次数、黏液便)、血浆脑肠肽水平。结果治疗组临床总疗效率(94%)明显高于对照组(72%)(P0.05),治疗组临床各症状积分显著优于对照组(P0.05);两组脑肠肽水平均明显下降(P0.05),以治疗组下降更为显著(P0.05)。结论加味痛泻要方联合匹维溴铵对肝郁脾虚证腹泻型肠易激综合征疗效显著,其机制可能是通过调节脑肠肽物质5-HT3R、CGRP水平来起到治疗肝郁脾虚证腹泻型肠易激综合征的作用。     

RP-HPLC法测定草香胃康片中大黄素的含量

目的建立草香胃康片中大黄素的RP-HPLC测定方法。方法色谱柱为ZORBAX XDB—C18（4．6×150mm，5um），以甲醇-水-磷酸（80：20：0．1）为流动相，柱温为室温，流速为1mL·min^-1。结果大黄素在0．11μg～1．1μg范围内与峰面积有良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率为99.93％，RSD为2．01％。结论该测定方法精密度高，重现性好，可用于测定大黄素的含量。     

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??OBJECTIVE To establish a RP-HPLC method for the determination of sodium lactate in compound sodium lactate and glucose injection and provide reference for revision of method recorded in Chinese Pharmacopoeia. METHODS The separation was performed on a Shim-pack VP-ODS C₁₈ analytical column(4.6 mm??250 mm, 5 ??m), and the mobile phase was formic acid-dicyclohexylamine-water (1??1??998, V/V) at a flow rate of 1.0 mL??min^-1. The detection wavelength was set at 210 nm and the column temperature was maintained at 40 ??. The loading volume was 20 ??L. The RP-HPLC method and the cation exchange resin method adopted by Chinese Pharmacopoeia were both used to determine the content of sodium lactate in compound sodium lactate and glucose injection, and the RESULTS were compared. RESULTS The linear range of the RP-HPLC method was 0.51-6.07 mg??mL^-1(r=0.999 9). The average recovery was 99.47% (RSD = 0.75%, n=9). CONCLUSION The established method of RP-HPLC can be used for the determination of sodium lactate in compound sodium lactate and glucose injection.     

新型小肽偶联物的合成及对T淋巴细胞增殖的影响

目的:合成新型小肽偶联物,寻找具有抗肿瘤活性及肝靶向性的新化合物。方法:以齐墩果酸和胆酸为母核,分别与活性小肽偶联,考察此类偶联物对T淋巴细胞增殖的影响。结果与结论:合成了8个新型小肽偶联物(Z1～Z8),其结构经IR,1HNMR和MS确证。初步药理结果表明,目标物Z1、Z2、Z4、Z8可不同程度地促进T淋巴细胞增殖,与对照药酪丝亮肽相比有显著性差异,其中化合物Z4最优,具有进一步研究的价值。