体外培养大鼠触须毛囊真皮鞘细胞的生物学特性及其超微结构

目的：探讨大鼠触须毛囊真皮鞘细胞体外培养生长特性和电镜下超微结构特征。方法：显微分离大鼠触须毛囊真皮鞘，组织块法原代培养获得真皮鞘细胞，免疫组化和免疫荧光染色进行细胞鉴定，MTT法测定细胞生长曲线，并通过扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果：真皮鞘细胞原代培养5—7d仅有少量细胞由组织块中长出，培养14d方可传代。传代后细胞呈克隆样丛状生长，细胞丛相互连接呈网状，3～5d传一代，可连续传10代以上。扫描电镜见毛囊真皮鞘内有许多散在的纺锤形细胞，胞体丰满，表面不光滑，有较长的细胞突起。透射电镜下见细胞核大，富含常染色质，核仁明显，胞浆中细胞器少，胞膜下可见由细丝样结构组成的致密斑。结论：大鼠触须毛囊真皮鞘细胞原代生长迟缓，传代后细胞增殖旺盛，其超微结构特点提示该细胞分化程度较低，属于成体中较为幼稚的间充质细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

新生SD大鼠心肌细胞分离培养的快速简单方法及鉴定

目的：探讨心肌组织块体外原代培养新生大鼠心肌细胞的方法。方法：将剪成1mm^3左右小块心肌组织，采用体外贴块种植原代培养新生大鼠心肌细胞。结果：成功地培养出原代心肌细胞，并能够传代；倒置相差显微镜下证实培养的细胞为心肌细胞，免疫组化染色鉴定为心肌细胞特异性蛋白cTnT表达阳性，同时具有心肌细胞节律收缩特性。结论：心肌组织块体外原代培养操作简单，可以获得较多单个心肌细胞，所获得的细胞具有良好的功能状态。     

兔半月板纤维软骨细胞的体外去分化研究

目的:比较研究不同代次间兔半月板纤维软骨细胞生物学特性的改变,为构建组织工程半月板和细胞治疗中的种子细胞优选提供进一步的理论和实践基础。方法:采用机械分离与酶连续消化相结合的方法体外分离兔半月板纤维软骨细胞,单层培养传代至第5代。采用相差倒置显微镜和SEM观察各代细胞的形态变化和超微结构,MTT法检测细胞增殖情况并描绘生长曲线,采用细胞化学染色和免疫组化鉴定细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白。结果:半月板纤维软骨细胞原代接种后8~12 h开始贴壁,48~72h大部分细胞贴壁,胞质逐渐展开,细胞变大伸长,形成突起,呈多角形,细胞形态规则,轮廓清晰,镜下观察有立体感,7~10 d后,细胞长满传代。传代后细胞贴壁生长能力和增殖速度明显加快,原代至第2代细胞形态较规则,多呈多角形,大小均一。第3代后随着传代次数的增加,细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。第5代分裂相少见,密度稀疏,细胞形态不佳,约80%呈长梭形,分泌和增殖能力下降。SEM示第1代半月板细胞形态规则,呈多极性,表面有突起;第5代细胞形态不规则,多呈梭形。生长曲线可见第4代前半月板细胞生长速度及生长周期均相似,第5代后细胞生长速度减慢,增殖减缓。细胞化学和免疫组化染色分析胶原和蛋白聚糖的表达:随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减弱而Ⅰ型胶原表达逐渐增强。结论:体外单层培养条件下,随着传代的进行,细胞活力逐渐下降,生长速度减慢,传代周期延长,逐渐变为梭形,形态不规则。体外单层培养系统中半月板纤维软骨细胞表型随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减少而Ⅰ型胶原表达逐渐增多,体外单层培养条件下培养的半月板纤维软骨细胞从第3代开始逐渐失去其特异性表型,发生去分化,逐渐变为成纤维细胞的表型。体外单层分离培养的第5代前半月板细胞基本维持纤维软骨细胞的表型和生物学特性,可作为组织工程半月板的种子细胞。     

兔骨髓间质干细胞的体外生物学特性及超微结构研究

目的 对兔骨髓问质干细胞进行体外分离培养并观察其生物学特性.方法 无菌条件下抽取健康幼年新西兰兔胫骨骨髓2ml,经密度梯度离心后获取骨髓间质十细胞,接种至100ml玻璃培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率和超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标记物及细胞生长周期,并进行成骨诱导反向证明,对细胞体外的生物学行为进行研究.结果 兔骨髓间质干细胞在体外培养2h后开始贴壁,20h后细胞基本贴壁完全,15d左右细胞融合达90%以上.透射电镜观察显示分离培养的兔骨髓问质干细胞表面可见许多微绒毛,主要分布于胞体一侧,胞核不规则,有切迹,细胞器丰富,具有典型未分化细胞特点;流式细胞仪检测显示分离培养的兔骨髓间质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD4S表达呈阴性,且绝大多数(约占细胞总数的97%)细胞的生长周期处于G1或G2期;成骨性诱导3周后,骨髓间质干细胞逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色阳性,VonKossa染色显示细胞聚集处存在大量钙盐,呈黑色沉积.结论 密度梯度离心法获取的兔骨髓问质干细胞纯度较高,生长稳定,传代多次后仍保持干细胞特性,因取材及体外扩增较简单易行,适合作为组织工程椎间盘髓核退变缺损修复的种子细胞来源.     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进

目的：改进大鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）原代培养方法,以获取纯化的大鼠肺微血管内皮细胞。方法：应用Wistar大鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养肺微血管内皮细胞;光镜观察细胞形态;Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学法及植物凝集素BSI结合实验鉴定培养的PMVECs。结果：体外培养的原代PMVECs在光镜下呈短梭形或多角形,形成单层后呈铺路石样排列,但随着传代或培养条件的改变,细胞形态发生变化;Ⅷ因子相关抗原染色阴性,异植物凝集素BSI结合实验阳性。结论：通过改进的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,纯度高,且能够稳定地传代培养。细胞形态观察结合免疫细胞化学法是目前较为理想的PMVECs鉴定方法。     

改良胎鼠视网膜干细胞的分离培养方法

目的 对大鼠胚胎视网膜干细胞的培养方法进行改良,并观察其生长及分化特性,以期寻求有效的视网膜干细胞培养方法. 方法 取18d孕龄的SD大鼠视网膜睫状缘(CMZ)色素上皮层组织,通过剪切、吹打、胰酶消化、过滤、离心后,在DMEM/F12培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),用无血清培养技术扩增视网膜干细胞;传代后离心收集培养细胞,以5%胎牛血清诱导细胞分化;用免疫细胞化学技术对十细胞及诱导分化的细胞进行鉴定,确定所培养细胞是否为干细胞且具有分化潜能. 结果 从SD胚胎大鼠视网膜中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能够牛成新的细胞团,免疫细胞化学染色显示原代和传代细胞中Nestin和掺入BrDU均呈阳性表达.诱导分化后的细胞经鉴定证明部分表达胸腺细胞表面糖蛋白(Thy1.1). 结论 SD胎鼠视网膜内存在视网膜干细胞,通过改良方法可以进行体外培养和扩增,产生分化,部分分化细胞具有视网膜神经细胞特性,包括分化形成节细胞.     

兔肝癌改良接种模型的生长特性研究

目的通过改良接种方式建立兔肝癌模型,分析并观察该肿瘤的生长特性。方法经肝包膜植入瘤组织块(约106～108个瘤细胞)接种于20只兔的肝左叶,建立兔肝癌模型。观察:①肿瘤在实验兔中生长7、10、14、17和21d时的体积(B超测),并计算肿瘤生长率。②大体及光镜下观察瘤组织形态特征。结果瘤体呈指数性生长,在接种17d后生长迅速。组织病理表明该瘤在肝组织中浸润式生长,肿瘤体积增长快于直径增长,其性状与VX2鳞状细胞癌特征相似。结论瘤块种植是建立兔肝癌模型的首选方式,该模型是肝癌的基础及临床的理想动物模型。     

冬凌草甲素抑制BGC823细胞的生长及MMP-2MMP-9的表达

目的探讨冬凌草甲素（oridonin,Ori）在体内、外对胃癌BGC823细胞生长的影响,及对BGC823移植瘤MMP-2、MMP-9表达的影响。方法MTT法检测Ori对BGC823细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测其对BGC823细胞周期的影响,体内抑瘤实验观察其对BGC823移植瘤生长的影响,免疫组织化学染色法观察Ori对移植瘤组织中MMP-2、MMP-9表达的影响。结果Ori在体外显著抑制细胞的增殖,引起细胞G2/M期阻滞;体内实验表明,Ori显著抑制肿瘤组织的生长,抑制率达70.7%;免疫组化染色结果显示,Ori显著抑制移植瘤MMP-2及MMP-9的表达。结论Ori在体内、外显著抑制胃癌BGC823细胞的生长,减少移植瘤MMP-2、MMP-9的表达,提示Ori可能具有抑制肿瘤侵袭转移及血管生成的作用。     

转EGF基因表皮细胞的生物学活性及移植实验

为探讨转表皮细胞生长因子(EGF）基因的人表皮细胞在体外培养条件下及移植后EGF的表达，于体外培养转EGF基因的人表皮细胞，采用ELISA法测定不同培养时间及不同传代数时培养上清中EGF的含量。然后将转基因的人表皮细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养后形成复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面，移植后3周以抗EGF抗体免疫组化染色观察移植后EGF的表达。结果显示，转EGF基因表皮细胞传至第5代仍可分泌EGF，达pg级水平；含转基因表皮细胞的复合皮移植后1—3周、抗EGF染色阳性。提示转EGF基因表皮细胞在体内与体外均可稳定地表达外源基因产物，可望应用于组织工程皮肤的构建。     

Radioimmunoassay for carcinoembryonic antigen and alpha 1-fetoprotein in the qualitative evaluation of focal hepatic lesions in Japan

The combined tests of serum alpha 1-fetoprotein (AFP) and carcinoembryonic antigen (CEA) were routinely performed in 210 patients with focal hepatic lesions on a 99mTc-colloid liver scan in order to determine whether these could provide more useful information that AFP test alone in the qualitative evaluation of focal hepatic lesions. The predictive value of hepatoma with positive AFP alone remained 80%. However, when the negative CEA was combined with positive AFP, the predictive value of hepatoma (91%) with both was greatly increased. On the other hand, the predictive value of metastatic liver cancer with positive CEA showed 92%. The combined test of AFP and CEA may be useful for preserving high predictive values of hepatoma and metastatic liver disease.     

Is anti-alphafetoprotein immunoscintigraphy a promising approach for the diagnosis of hepatoma? Implications of a quantitative study in 41 patients

The actual interest of immunoscintigraphy for the detection of liver tumours was investigated by both visual examination and quantitative analysis in 41 patients with hepatoma (HCC, 21 cases, 13 AFP-secreting), other primary or secondary liver cancer (9 cases), testicular cancer (2 cases) and cancer free cirrhosis (9 cases). All patients were injected with 123I-anti-alphafetoprotein (AFP) monoclonal antibodies (MAbs) and scans were performed after 28 +/- 2 h. In the hepatoma-bearing patients, 11 positive anti AFP scans were found; 9 of them had an enhanced serum; besides, 3 non HCC tumours were also detected. With respect to hepatoma diagnosis, sensitivity was 52.5% and specificity 66.5%. For all hepatomas, it was striking that the positivity rate was 2/10 and 9/11, respectively, when HCC was and was not associated with cirrhosis. Among 6 patients with a positive anti AFP scan who were also injected with control anti hCG 123I-MAb, 5 positive anti hCG scans were surprisingly found, with specificity indices ranging between 1.00 and 1.75. The quantitative study also highlighted the importance for hepatoma detection of specific and non specific factors such as serum AFP, tumoural vascularization, non tumoural liver uptake and intrahepatic distribution of HCC. Anti AFP immunoscintigraphy appears as a poorly sensitive and moderately specific method for hepatoma diagnosis. In contrast, non tumoural liver uptake level could be more useful for discriminating HCC from liver metastases and perhaps to detect the early extension of HCC.     

Is anti-alphafetoprotein immunoscintigraphy a promising approach for the diagnosis of hepatoma?

The actual interest of immunoscintigraphy for the detection of liver tumours was investigated by both visual examination and quantitative analysis in 41 patients with hepatoma (HCC, 21 cases, 13 AFP-secreting), other primary or secondary liver cancer (9 cases), testicular cancer (2 cases) and cancer free cirrhosis (9 cases). All patients were injected with ¹²³I-anti-alphafetoprotein (AFP) monoclonal antibodies (MAbs) and scans were performed after 28±2 h. In the hepatoma-bearing patients, 11 positive anti AFP scans were found; 9 of them had an enhanced serum; besides, 3 non HCC tumours were also detected. With respect to hepatoma diagnosis, sensitivity was 52.5% and specificity 66.5%. For all hepatomas, it was striking that the positivity rate was 2/10 and 9/11, respectively, when HCC was and was not associated with cirrhosis. Among 6 patients with a positive anti AFP scan who were also injected with control anti hCG ¹²³I-MAb, 5 positive anti hCG scans were surprisingly found, with specificity indices ranging between 1.00 and 1.75. The quantitative study also highlighted the importance for hepatoma detection of specific and non specific factors such as serum AFP, tumoural vascularization, non tumoural liver uptake and intrahepatic distribution of HCC.Anti AFP immunoscintigraphy appears as a poorly sensitive and moderately specific method for hepatoma diagnosis. In contrast, non tumoural liver uptake level could be more useful for discriminating HCC from liver metastases and perhaps to detect the early extension of HCC.This work was partly supported by the ARC grant nr 6265     

Radioimmunoassay for carcinoembryonic antigen and alpha1-fetoprotein in the qualitative evaluation of focal hepatic lesions in Japan

The combined tests of serum alpha₁-fetoprotein (AFP) and carcinoembryonic antigen (CEA) were routinely performed in 210 patients with focal hepatic lesions on a ^99mTc-colloid liver scan in order to determine whether these could provide more useful information that AFP test alone in the qualitative evaluation of focal hepatic lesions. The predictive value of hepatoma with positive AFP alone remained 80%. However, when the negative CEA was combined with positive AFP, the predictive value of hepatoma (91%) with both was greatly increased. On the other hand, the predictive value of metastatic liver cancer with positive CEA showed 92%.The combined test of AFP and CEA may be useful for preserving high predictive values of hepatoma and metastatic liver disease.     

肝癌单克隆抗体的制备与免疫组化定位

用新鲜人肝癌组织细胞悬液免疫，获得2株抗人肝癌细胞单克隆抗体（Hab-20,Hab-21)，应用免疫组化方法对部分正常肝、肝硬变、原发性肝癌等组织进行定位。结果原发性肝癌阳性率分别为91．1％和63．1％，而在正常肝、肝硬化无相应抗原表达。2株抗体在胆管上皮、胃癌及结肠癌等组织存在不同程度的交叉，结果表明2株抗体对肝癌组织具有明显的相关性。     

碘化甲胎蛋白抗体在大鼠肝癌中选择性定位研究

本文用亲和层析法纯化的抗体,研究碘化甲胎蛋白(AFP)抗体在大鼠移植性肝癌中的定位和放射免疫显像。做全身扫描的荷瘤鼠27只有肿瘤37个,阳性显像36个,弱阳性1个。荷瘤鼠全身放射性核素含量以每日减少约50％的速率下降,第7天还剩3.6％。肿瘤碘化抗体含量持续保持较高水平,第5天肿瘤放射强度分别是血、脑、肌肉、心、肝、脾、肾的2.49、46.60、15.16、6.21、6.17、5.33、3.03倍。组织切片放射自显影显示碘化抗体在肿瘤内呈特异性浓集。本文还就碘化抗体选择性定位和放射性非靶分布的机理进行了免疫病理学探讨。     

人结肠癌HCT116细胞系肿瘤干细胞特性研究

目的 探讨结肠癌HCT116细胞系的肿瘤干细胞相关特性,为结肠癌干细胞功能研究奠定基础.方法取HCT116细胞在无血清条件下培养,观察细胞在无血清培养基中的增殖分化情况,采用限量稀释法计数细胞的克隆球形成率,并观察细胞及克隆球的生长、增殖、分化情况.取HCT116细胞(5×10~3、5×10~4个)接种4周龄雌性NOD-SCID小鼠,观察3～8周,分析其致瘤性和病理学特征.采用流式细胞仪和免疫荧光染色法分别检测HCT116细胞CD133、CD44、ABCG2的表达,RT-PCR和Western blotting 检测CD133的mRNA和蛋白表达.采用免疫组化法检测分化过程中HCY116克隆球上CK20的表达.结果 41.47%±1.28%的HCT116细胞能在无血清培养基中形成克隆球,第二代克隆球形成率仍保持在较高水平(32.53%±2.32%).HCT116细胞在无血清条件下培养72h可形成克隆球,且至少可传15代以上.5×10~3个HCT116细胞接种至小鼠皮下5～6周后即可形成移植瘤.大部分HCT116细胞为CD133~+ CD44~+,并表达ABCG32蛋白.HCT116细胞的克隆球分化至第4天即可检测到CK20表达.结论 大部分HCT116细胞具有肿瘤干细胞特性,可作为肿瘤干细胞研究的理想对象.     

AFP、CEA和CA199联合检测在原发性肝癌诊断中的应用

目的：探讨多种血清肿瘤标志物联合检测对原发性肝癌的诊断价值。方法：采集110例原发性肝癌和152例良性肝病（肝硬化和慢性肝炎）患者血液,用化学发光法测定AFP、CEA和CA199水平。结果：原发性肝癌患者血清中AFP、CEA和CA199水平分别为（60.6±80.5）μg/L、（22.2±13.9）μg/L、（47.2±28.3）U/L,明显高于良性肝病患者血清水平;原发性肝癌患者中AFP、CEA和CA199阳性率分别为74.6%、49.1%和45.5%,显著高于良性肝病患者;三者联合检测将原发性肝癌检测敏感率提升至92.7%。结论：联合检测可提高原发性肝癌诊断的敏感率,在原发性肝癌的筛查中有一定的应用价值。     

肝癌合并动门静脉瘘的DSA表现及介入治疗

目的 :探讨肝癌合并动门静脉瘘的 DSA表现及介入治疗方案选择。方法 :对由 AFP、B超、CT诊断的原发性肝癌 95例施行了肝动脉内化疗栓塞治疗 ,治疗前均有 DSA检查。结果 :46例合并动门静脉瘘 (48.4% ) ,其中 1 7例有门脉癌栓。治疗后 AFP均有下降 ,2 7例肿瘤缩小 (58.7% ) ,1 2例肿瘤增大 (2 6.1 % ) ,7例改变不明显 (1 5.2 % )。均未发生严重肝功能损害。结论 :DSA显示动门静脉瘘准确、直观。肝癌合并动门静脉瘘影响疗效 ,但对其仍应积极治疗     

超声引导下穿刺种植制作大鼠肝癌模型的方法学探讨

目的 :探讨超声引导下大鼠肝癌模型的制作方法。方法 :用60 Co照射和氢化可的松联合免疫抑制 13只Wis tar大鼠。将CBRH 7919大鼠肝癌细胞悬液注入 1只大鼠皮下 ,2周后将生成的肿瘤组织剪成小瘤块 ,匀浆后制成细胞悬液 ,在超声引导下将细胞悬液接种于 12只大鼠肝脏 ,并用超声观察肿瘤生长。 2周后处死动物 ,进行病理学检查。结果 :12只肝脏种植的大鼠中有 1只在实验中死亡 ,接种 2周后超声检查发现 10只肝内有肿块生成 ,1只肝内接种失败。病理类型均为肝细胞性肝癌。大鼠肝癌原位模型成功率为 83 .3 %。结论 :超声引导下在免疫抑制大鼠内穿刺接种制作大鼠肝细胞癌模型 ,是一种操作方便、简单、成功率高的方法 ,便于肝癌影像学的诊断和治疗。