精子携带的乙肝病毒基因在金黄地鼠胚胎中的复制与表达

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。本研究旨在探索乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)通过精子垂直传播的可能性。方法:将金黄地鼠精子与pBR322-HBVDNA重组质粒进行共培养后,与金黄地鼠正常卵母细胞受精,取2-细胞胚分别制片和提取RNA,用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)、RT-PCR和免疫荧光检测技术研究精子携带的HBV基因在胚胎细胞中的复制与表达。结果:①FISH:用全长HBVDNA探针与128个2-细胞胚进行FISH,其中3个胚胎FISH结果阳性,每个胚胎的2个间期核上均有HBVDNA杂交信号;②RT-PCR:在检测样本中可见特异的HBxDNA阳性条带,阴性对照1(模板为灭菌水)和阴性对照2(未加反转录酶)均为阴性;③免疫荧光检测:2-细胞胚经血清封闭后,分成两组。一组作检测样本,另一组用PBS代替一抗(小鼠抗人HBsAg)作为阴性对照,检测样本中可见阳性免疫荧光信号,阴性对照未见信号。结论:以精子为载体,携带到卵内的HBV基因能够在胚胎细胞中复制和表达,提示HBV能够通过男性生殖细胞由父亲垂直传递给子代。     

人精子携带的HBs和HBc基因在早期胚胎细胞中的蛋白表达

背景与目的:探讨由人精子带入受精卵中的HBs和HBc基因能否在早期胚胎细胞中进行蛋白表达.材料与方法:人精子经重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染后,与金黄地鼠去透明带卵母细胞离体受精,选择带绿色荧光的2-细胞胚,用免疫荧光技术检测HBs和HBc基因在胚胎细胞中的蛋白表达,用ELISA方法分别对HBsAg和HBcAg进行半定量和定性分析.结果:在带绿色荧光的2-细胞胚中免疫荧光检测可见清楚的HBsAg和HBcAg阳性信号;ELISA结果表明,单个2-细胞胚内HBsAg的量小于0.064 ng/ml,对HBcAg的检测得到阳性结果.结论:人精子携带到卵内的HBV基因可在早期胚胎细胞中表达表面抗原和核心抗原.     

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的 构建携带绿色荧光基因的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法 从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的ＥＢＶ潜伏膜蛋白2A（latent membrane protein 2A,LMP2A）序列,并定向克隆入pIRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞（实验组）,同时另设转染pIRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果 双酶切及测序鉴定证实真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论 成功构建了pIRES2-Zs-Green1- LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。     

pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究

目的构建PML-RARα融合基因与人白介素-2（hIL-2）基因真核双表达质粒。方法利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点（MCS）A和B中,构建真核双表达质粒。利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、ELISA检测目的蛋白的表达情况。结果Nhe I／Mlu I和Sal I／Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARa基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML—RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录。经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白。结论成功构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML-RARα和hIL-2蛋白。     

烷化剂耐药基因真核表达质粒的构建及在K562细胞中的表达

目的克隆烷化剂耐药基因MGMT，构建真核表达质粒并导入真核细胞进行表达，筛选稳定表达的细胞系。方法从人肝组织中克隆MGMT基因后重组构建真核表达粒质pIRES2-MGMT—EGFP并鉴定。通过脂质体法将目的基因导入K562细胞，应用RT—PCR及Western blot检测目的基因的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。结果成功克隆MGMT并构建了真核表达质粒pIRES2-MGMT—EGFP。转染细胞后MGMT在mRNA及蛋白水平均有表达，而对照组则为阴性。结论含烷化剂耐药基因MGMT真核表达质粒的构建及转染后表达的成功为烷化剂耐药基因的相关研究奠定了良好的基础。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人类mir-7-3基因慢病毒表达载体的构建及其在胶质瘤中的表达

 目的　构建人类mir-7-3基因慢病毒表达载体,为进一步研究mir-7-3基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用奠定基础。方法　采用反转录-聚合酶链（RT-PCR）技术从含有mir-7-3基因的质粒pENTR-MIRNA VECTOR扩增目的基因mir-7-3,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-RNAi VECTOR [含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因]中,构建慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-mir-7-3,酶切、测序验证mir-7-3基因后,将Lenti-GFP-mir-7-3质粒和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共同转染人类胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带mir-7-3基因和EGFP基因的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP- mir-7-3,取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和人类胶质瘤细胞U251,荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定U251细胞中mir-7-3基因的表达水平。结果　Lenti-GFP-mir-7-3共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,FIV-CMV-EGFP-mir-7-3中携有正确的mir-7-3基因,目的基因mir-7-3能被重组慢病毒高效地转导入U251。结论　成功构建了携带mir-7-3基因的重组慢病毒载体;为进一步从分子水平探讨mir-7-3基因治疗胶质瘤奠定了基础。     

基因CGI-100真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的 构建CGI-100基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法 采用DNA重组技术,将CGI-100基因亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒中,重组为pIRES2-EGFP- CGI-100,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的 基因CGI-100的表达,采用体外培养技术,通过pIRES2EGFP- CGI-100质粒转染K562细胞前后的生长曲线.结果 pIRES2-EGFP- CGI-100在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论 CGI-100表达产物可能是1个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,CGI-100基因可能是1个具有生物学功能的白血病未知基因.     

外源DNA转染精子的实验研究

背景与目的:探索精子作为外源基因载体的可行性及阳离子脂质体的存在对精子转染率的影响.材料与方法:取性成熟雄性金黄地鼠附睾内精子,采用共培养及脂质体介导两种方法与外源DNA共孵育后,用PCR、Southern blot及荧光原位杂交(FISH)等技术检测外源基因在精子细胞中的存在及存在部位,并对两种方法进行比较分析.结果:金黄地鼠附睾内的活精子具有主动捕获外源基因的能力,荧光原位杂交证明部分外源基因进入了精子头部,脂质体介导组精子外源基因携带率较共培养组高,两组精子用DNA酶处理前后外源基因携带率间差异也有统计学意义,且观察发现死精子经洗涤后没有携带外源基因者.结论:即是在没有脂质体存在的情况下,活的精子细胞仍然能被外源基因所转染,这一过程涉及到精子对外源基因的主动性捕获,脂质体的存在能提高精子外源基因的转染率.     

Inhibition of c-mos protein kinase blocks mouse zygotes at the pronuclei stage.

The c-mos gene product is required for activation of the maturation-promoting factor (MPF) during oocyte maturation. The c-mos protein also acts as a cytostatic factor which is responsible for meiotic metaphase arrest of vertebrate eggs via stabilization of MPF. Here we show that mouse zygotes contain the c-mos protein. Introduction of a kinase-inhibitory anti-mos antibody into mouse zygotes 12 h after fertilization prevented the first cleavage of zygotes at the pronuclei stage. A second anti-mos antibody, known to allow the mos kinase to function, did not interfere with the formation of two-cell embryos. In addition to its known role in MPF activation in oocyte maturation and meiotic metaphase arrest, our findings indicate that the c-mos protein kinase is also required for completion of pronuclei breakdown following fertilization of mouse eggs.     

乙型肝炎病毒对精子染色体的影响

乙型肝炎病毒感染者的精子与去透明带金黄地鼠卵受精制备染色体。并以ＨＢＶ全长ＤＮＡ作探针对精子染色体进行荧光原位杂交。结果发现慢性迁延型肝炎患者,慢性活动型肝炎患者ＨＢＶ携带者的精子染色体畸变率分别为１２．３３％（０／７３）、１６．１８％（１１／６８）和１５．４８％（１３／４８）,均显著高于健康对照者精子畸变率（４．３５％,５／１１５）,进一步ＦＩＳＨ显示,在１例慢性迁延型肝炎患者的精子染色体上有待     

正常人240个人精子染色体核型分析

应用人精子与去透明带金黄地鼠卵受精技术制备人精子染色体标本，对正常男性２４０个精子核型进行了分析。结果显示，数目畸变精子率为３．３４％，结构畸变精子率为６．６７％。所观察到的结构畸变类型为无着丝粒断片，染色体断裂、双着丝粒体、易位和染色单体断裂。在正常男性精子染色体组中，Ｘ一精子与Ｙ一精子的比例为４９．１７％：５０．８３％；近端着丝粒染色体随体联合显随机分布，随体联合频率为０．０９６。对上述实验结果的意义进行了讨论。     

51. Mutagenicity Study of Cyclophoshpamide on Human Sperm

Whether Cyclophoshpamide(CP) has mutagenicity on germ cell or not is paid close attention to. This paper studied the mutagenicity of CP on germ cell by adopting human sperm chromosome and micronuclus in two-cell embryo. Semen samples obtained from healthy male were liquefied、dealed with Ca2+, and exposed to four     

重组氨基脲敏感型胺氧化酶在293T 细胞中的定位及 酶活性测定

目的：构建氨基脲敏感型胺氧化酶（SSAO）基因真核表达载体,并在293T细胞中进行瞬时表达,确定SSAO体外表达效率、亚细胞定位及酶活性。方法：以pcDNA3-SSAO质粒为模板,PCR扩增获取SSAO编码区全序列,分别构建SSAO与绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达质粒pEGFP-N3-SSAO和共表达质粒pIRES2-EGFP-SSAO,并通过酶切和测序验证。再分别将pcDNA3-SSAO、pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcFLAG-SSAO重组质粒瞬时转染293T细胞,在荧光显微镜下观察目的蛋白的分布及表达情况。采用高效液相色谱法（HPLC）测定转染上述4种重组质粒及相应空质粒细胞的SSAO活性。结果：测序结果表明重组真核表达质粒构建正确。在瞬时转染pEGFP-N3-SSAO和pIRES2-EGFP-SSAO重组质粒的293T细胞中,转染后3~36 h各组均可观察到绿色荧光,且转染36 h为最佳观察时间点。转染pIRES2-EGFP-SSAO质粒的绿色荧光分布于细胞质中;转染pEGFP-N3-SSAO和pcFLAG-SSAO质粒的绿色荧光及红色荧光均分布于细胞膜上。酶活性检测结果显示转染pcFLAG-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcDNA3-SSAO载体质粒的293T细胞中的SSAO活性分别为111.50±7.07、117.22±9.54、215.74±21.44 nmoL/（mg·h）,较各自的空白质粒对照组均显著升高（P均 < 0.01）,但转染pEGFP-N3-SSAO质粒的细胞SSAO活性极低,仅为2.09±0.29 nmoL/（mg·h）。结论：293T细胞中,体外重组表达的SSAO蛋白主要分布于细胞膜上,以pcDNA3为载体外源表达的天然状态SSAO活性最高。     

Interleukin 3 like activity secreted from human ras or myc transfected rodent cells

We have examined the secretion of IL-3 like activity from recipient normal mouse, rat and Chinese or Syrian hamster cells and their derivative cell lines obtained after transfection with recombinant plasmids carrying an exogenous human ras or myc gene. IL-3 like activity was determined by two cell proliferation assays which employed the FDC-P1 and 32D IL-3 dependent mouse cell lines. The colorimetric MTT assay, where a tetrazolium salt is employed, and the trypan blue dye exclusion assay were used. Low serum containing supernatants from rat or Syrian hamster lines expressing an exogenous human normal or mutant T24 H-ras1 gene supported the proliferation of the IL-3 dependent FDC-P1 or 32D cells. However, supernatants from mouse BalbC or Chinese hamster cells expressing the normal or mutant T24 H-ras1 gene failed to support the proliferation of these cells. In addition, supernatants from rat 208F or BalbC cells transfected with recombinant plasmids carrying a human myc gene supported the proliferation of the two IL-3 dependent cell lines. Our results suggest that introduction of the human Ha-ras1 or human myc gene can trigger the secretion of IL-3 like growth factors in some but not all rodent cells.