pcDNA3.1(+)—增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其在大鼠体内的转染部位及表达时间.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其在大鼠体内转染后的时空效应.结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb, EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后在大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光.对照组所有取材部位均没有绿色荧光.结论: 重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达.     

EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证

目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.     

重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率

目的　研究增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF16 5 )重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率。方法　利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad EGFP hVEGF16 5 ;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性 ;经尾静脉注射 3× 10 8PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB c小鼠 ,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF16 5的表达。结果　通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP hVEGF16 5 ;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 10 1 0 ～ 10 1 1 PFU ml。Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变。借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP ;RT PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达。各脏器未见明显毒性反应。ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(86 6 6 7± 97 13)pg ml。结论　本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,并成功介导了hVEGF16 5基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达 ,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础。     

TAT透膜肽介导VP3蛋白诱导HepG2细胞凋亡效应的研究

目的探讨TAT透膜肽介导VP3融合蛋白穿透生物膜及诱导HepG2细胞凋亡的效应,为临床应用生物大分子药物治疗肿瘤提供实验基础。方法常规构建TAT-VP3、TAT-GFP及TAT-GFP-VP3的3种融合蛋白的pET28 a原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达,经镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。通过蛋白转导实验观察其穿透生物膜的效应,利用DAPI染色及TUNEL法观察其诱导HepG2细胞凋亡的效应。结果融合蛋白TAT-GFP及TAT-GFP-VP3可进入体外培养的HepG2细胞,在荧光下可见绿色荧光,融合蛋白TAT-VP3及TAT-GFP-VP3可诱导体外培养的细胞凋亡。结论在VP3的N端加上TAT透膜肽形成的融合蛋白可有效穿透细胞膜,TAT-VP3融合蛋白能诱导HepG2细胞凋亡。     

EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达.方法:采用RT-PCR技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3-EGFP融合蛋白得到表达.结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3.将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP-N1后48 h的转染效率分别为52%和59%.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础.     

重组质粒pEGFP-C1-STAT6的构建及在HeLa细胞中表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)为报告基因的重组质粒pEGFP-C1-STAT6,观察其在HeLa细胞中的表达.方法 以重组质粒pCLNEO-STAT6为模板,PCR法扩增出目的 基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C1上,构建重组质粒pEGFP-C1-STAT6,脂质体法转染HeLa细胞,Western 印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位和分布.结果 成功构建质粒pEGFP-C1-STAT6,并在HeLa细胞中实现表达;Western 印迹检测到融合蛋白EGFP-STAT6;在荧光显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位.结论 重组质粒pEGFP-C1-STAT6构建成功,可用于标记STAT6蛋白,为进一步研究STAT6在信号转导中的作用机制奠定基础.     

结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。     

可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因的构建及真核表达

目的　可溶性人干细胞因子 (SCF)膜外活性区与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)融合基因表达载体的构建及其表达。方法　应用基因工程技术构建重组载体 ,电穿孔转染CHO K1细胞株 ,荧光分光光度计检测上清液中融合蛋白的表达 ,流式细胞仪检测其活性。结果　融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达 ,并分泌至上清 ,且SCF EGFP融合蛋白中分子标签EGFP未影响可溶性人SCF膜外活性区的结构及其生物学活性。结论　可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因载体构建成功 ,表达的融合蛋白具有生物活性 ,为进一步研究SCF对造血干细胞的生物学作用奠定了基础。     

共表达MAGE-1与EGFP基因的小鼠黑色素瘤细胞系的建立

目的 :构建黑色素瘤抗原 1(MAGE 1)基因的真核表达载体 ,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达。方法 :采用分子生物学的手段 ,构建了MAGE 1与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因共表达的质粒pIRES2 EGFP MAGE 1,通过脂质体以共表达质粒转染B16细胞 ,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达 ,用免疫组化染色法检测细胞中MAGE 1的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 1。以其转染B16细胞后 ,经荧光显微镜及免疫组化染色法检测 ,可见细胞内有EGFP及MAGE 1的表达。结论 :成功地建立了可共表达MAGE 1与EGFP基因的B16细胞 ,为MAGE 1在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

采用杆状病毒表达系统表达EGFP标记的HPV-16L1病毒样颗粒

目的制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)病毒样颗粒,为研究HPV-16L1的生物学活性提供一种方法。方法采用Xbal HindⅢ双酶切pGEM-T-HPV-16质粒,获得HPV-16L1基因片段,用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因片段,NcoⅠ SalⅠ双酶切,依次克隆入杆状病毒转移载体,获得重组pFB-EGFP-HPV-16L1转移载体;在DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,获得重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒;感染Sf-9昆虫细胞;荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法确定融合蛋白的荧光特性及细胞学定位;利用Western blot分析融合蛋白的表达;电子显微镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成;利用小鼠红细胞凝集试验及凝集抑制试验分析生物学活性。结果重组pFB-EGFP-HPV-16L1辅助表达载体及重组杆状病毒中EGFP-HPV-16L1融合基因构建正确;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒Ac-EGFP-HPV-16L1的Sf-9细胞核内可见耀眼的绿色荧光,免疫组织化学证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白主要位于Sf-9细胞核内;Western blot证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白相对分子质量(M_r)为83×10~3,与理论值一致;透射电子显微镜观察发现感染重组Ac-EGFP-HPV- 16L1杆状病毒的Sf-9细胞核内和裂解上清内均可发现大量形态均一的VLP形成;小鼠红细胞凝集试验证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白可引起小鼠红细胞凝集,且可被抗HPV-16L1单克隆抗体抑制。结论杆状病毒表达系统表达的EGFP标记的HPV-16L1蛋白既能自组装成病毒样颗粒、具有构象依赖性生物学活性,又能发射易于检测的绿色荧光,有可能用于HPV-16L1蛋白的生物行为研究,并实时可视化追踪其在宿主细胞内的转运过程。     

蛋白转导在基因治疗中的应用

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景。     

蛋白质转导技术及其应用

蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)是指一类能将其他生物大分子导入多种哺乳动物细胞的小分子阳离子多肽,它可以用于研究细胞内某些蛋白质的功能,还可以与具有治疗作用的蛋白质、多肽等生物大分子偶联,在缺血、肿瘤等多种疾病的治疗中有潜在的应用价值。     

Ras鸟苷酸结合蛋白超家族新成员RhoE/Rnd3

RhoE/Rnd3是Ras鸟苷酸结合蛋白超家族的新成员,调节细胞骨架的重组,影响细胞的生长和迁移。核糖基转移酶C3Stau可以修饰并改变RhoE/Rnd3蛋白的活性,下游效应蛋白Soc ius、ROCK I以及p190 RhoGAP则参与信号的传导。RhoE/Rnd3与疾病,尤其是肿瘤的发生发展有关。     

新型神经营养因子TAT-BDNF生物合成及生物活性研究

目的：合成新型神经营养因子TAT-BDNF并验证其生物活性，为进一步应用功能蛋白质治疗中枢神经损伤提供研究方法。方法：采用分子克隆方法构建带有TAT蛋白转导区序列及无信号肽序列人BDNF基因的原核表达载体pTAT—HA-DNF。经原核表达系统表达、纯化、复性获得纯净TAT—BDNF融合蛋白。利用体外培养的新生大鼠小脑颗粒细胞，通过双重免疫荧光细胞染色检测其蛋白转导活性；Hoechst33342染色观察TAT-BDNF对颗粒细胞谷氨酸兴奋性毒性损伤神经保护作用。结果：重组质粒能有效的通过原核表达系统表达并获得高纯度TAT-BDNF。免疫荧光细胞染色显示TAT-BDNF能快速转导入小脑颗粒细胞中，并能显著减少由谷氨酸诱导的细胞凋亡坏死的比例，改善神经元的存活状态。结论：合成的新型神经营养因子TAT-BDNF具有蛋白转导活性及神经保护作用。     

精—甘—天冬—丝氨酸肽抑制血小板活化的胞内信号转导机制

本工作在凝血酶活化的大鼠血小板上,观察ＲＧＤＳ肽对血小板聚集,蛋白磷酸化及丝裂素活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）活性的影响,结果发现,ＩＵ／ｍＬ凝血酶明显引起血小板聚集,９５和６６ｋＤ蛋白磷酸化及ＭＡＰＫ活性的增加,应用５０、１００、２００μｍｏｌ／ＬＲＧＤＳ肽共向孵育,呈浓度依赖地抑制凝血酶引起的血小板聚集和ＭＡＰＫ活性,且两者呈正相关（ｒ＝０．８１,Ｐ＜０．０１）。ＲＧＤＳ肽亦呈浓度依赖地抑制凝血酶诱导的９５和６６ＫＤ蛋白磷酸化,与其抑制ＭＡＰＫ活性呈明显正相关（ｒ＝０．４１,Ｐ＜０．０５和ｄ．５３,Ｐ＜０．０１）。提示,ＭＡＰＫ系统参与了凝血酶引起的Ｗ小板聚集,ＲＧＤＳ肽抑制血小板聚集机理之一可能是通过干预血小板内信号传导途径所致。     

激酶调控PKB/Akt活性的机制

PKB/Akt是胞内信号转导通路网络的中心分子。活化的PKB参与多种生物学效应的调控过程,调控PKB活性作用机制的研究一直是信号转导通路领域的难点。新近的研究结果确定了若干新的调控PKB活性的激酶,从多方面解释了PKB活化和作用的分子机制。其中mTORC2、ATM和DNA-PK均通过磷酸化PKB的Ser473位点以依赖于PI3K的方式全面活化PKB;此外,其它以不依赖PI3K的方式调控PKB活性的激酶包括,RET/PTC通过磷酸化PKB的Tyr315位点、JNK通过磷酸化PKB的Thr450位点以及CK2通过磷酸化PKB的Ser129位点活化PKB,Brk通过磷酸化PKB的Tyr474位点以及GRK2均可通过磷酸化PKB抑制其活性。     

The role of protein tyrosine phosphatases in the regulation of allergic asthma: implication of TC-PTP and PTP-1B in the modulation of disease development

Protein tyrosine phosphorylation is an important early event in the signal transduction of numerous cell receptors involved in the immune response. The implication of protein tyrosine kinases in allergic asthma is well recognized, but the role of protein tyrosine phosphatases (PTPs) remains poorly understood. However, we recently reported that global inhibition of PTPs during either the allergen-sensitization phase or the allergen-challenge phase reduced the development of asthma and that this correlated with an increased T helper 1 (Th1) response in both lung and spleen tissues. Therefore, in this study we investigated individual roles of PTPs involved in regulating the immune response. We observed that genetic deficiency for PTP-1B resulted in increased recruitment of lung inflammatory cells, while protein tyrosine phosphatase-phosphatase and tensin homologue deleted (PTP-PEST)-deficient mice exhibited a phenotype similar to that of wild-type mice. Importantly, we found that a heterozygous mutation of T cell PTP (TC-PTP) dramatically abrogates immunoglobulin E production and reduces the recruitment of inflammatory cells to the lung, conferring an important role for TC-PTP in the development of allergic asthma. As opposed to other studies on Src homology phosphatase-1 (SHP-1) deficiency, specific acute SHP-1 inhibition during allergen challenge did not affect disease outcome. Collectively, our results underscore the importance of PTPs in the development of allergic asthma.     

粘附蛋白介导粘附信号传导的机理探讨

为了探讨粘附蛋白介导粘附信号传导的机制 ,我们进行了一系列的实验。首先观察了 CD4 4,Vn在单核细胞粘附于内皮表面过程的作用 ,然后观察了细胞因子 IL- 1、IL- 6、TNF和 IFN对 CD4 4和 Vn表达的调节作用 ,进一步观察了细胞色素 B对 CD4 4、Vn表达和单核细胞粘附的抑制作用 ,最后观察了细胞粘附对单核细胞增殖特性的影响。结果表明 CD4 4和 Vn可介导单核细胞粘附于内皮表面 ,细胞因子可上调 CD4 4和 Vn的表达并促进单核细胞的粘附 ,细胞骨架参与单核细胞的粘附过程 ,细胞粘附过程中单核细胞内 DNA含量和 PCNA表达增加。因此 ,我们推测粘附信号可通过细胞因子作用于粘附蛋白 ,继而通过细胞骨架引起细胞内生物学功能的变化     

磷酸化ERK1/2对大鼠体外血小板聚集的可能作用

目的：观察两种激动剂诱导下，MEK1/2抑制剂PD098059对大鼠体外血小板聚集及磷酸化ERK1/2的影响。方法： 采用比浊法测定血小板最大聚集率，并观察最大聚集率发生时间，以及PD098059对血小板聚集的抑制率；采用Westernblot测定ERK1/2磷酸化表达。结果： 凝血酶和ADP均可诱导血小板聚集及 ERK1/2磷酸化的表达；PD098059ADP降低血小板最大聚集率及ERK1/2磷酸化表达；凝血酶与ADP诱导的血小板最大聚集率、最大聚集率发生时间及对PDO98059的反应均有差异。结论： ERK1/2为血小板聚集的信号转导途径之一；但在不同激活剂引起的血小板聚集中所起的作用不尽相同。     

Mutations of signal-transducing G proteins in human disease

Heterotrimeric guanine nucleotide binding proteins (G proteins) couple a large number of cell surface receptors to their intracellular effector molecules, such as enzymes or ion channels. Mutations of G proteins can lead to either activation or inactivation of the corresponding signal transduction pathway and thus cause clinical symptoms. Mutations of heterotrimeric G proteins have been found in a number of endocrine tumors, the McCune-Albright syndrome, Albright's hereditary osteodystrophy, and a combination of precocious puberty and pseudohypoparathyroidism Ia. The identification of the molecular defects underlying the above disorders and the investigation of their functional consequences for metabolism and growth regulation have been the subject of many studies over the past few years. A close understanding of these pathophysiologic mechanisms is crucial for the development of therapeutic strategies.Abbreviations AHO Albright's hereditary osteodystrophy - G protein Guanine nucleotide binding proteins - Gs protein Stimulatory G protein - Gi protein Inhibitory G protein - GHRH Growth hormone releasing hormone - MAS McCune-Albright syndrome - PHP Pseudohypoparathyroidism - PPHP Pseudopseudohypoparathyroidismus - PTH Parathormone