上调NDRG1表达降低奥沙利铂耐药结肠癌细胞的存活率

目的观察上调NDRG1表达对结肠癌细胞及奥沙利铂耐药结肠癌细胞的毒性作用并探讨其机制。方法以重组真核表达质粒pEGFP-NDRG1-N3转染HCT 116及奥沙利铂耐药的OHP-HCT 116结肠癌细胞,以实时定量(qRT)-PCR法和Western blot法检测转染效率。MTT法检测奥沙利铂对不同结肠癌细胞的毒性及验证OHP-HCT 116细胞的耐药性。给予奥沙利铂干预转染pEGFP-NDRG1-N3的HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡蛋白Bcl-2及p53蛋白水平变化。结果不同浓度奥沙利铂干预下的3株结肠癌细胞中HCT 116细胞对奥沙利铂最敏感,OHP-HCT 116细胞对奥沙利铂耐药得到验证。以不同浓度梯度奥沙利铂干扰转染pEGFP-NDRG1-N3的HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞,与MOCK及siNC组比较,在HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞,转染pEGFP-NDRG1-N3细胞的存活率下降(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05),p53表达升高(P<0.05)。结论上调NDRG1表达通过调控p53表达改善结肠癌细胞奥沙利铂耐药,提高化疗敏感性。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素通过上调Slug促进结直肠癌细胞上皮-间质转化的研究

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(TSA)诱导结直肠癌细胞HCT116发生上皮-间质转化(EMT)的潜在分子机制.方法 TSA处理结直肠癌细胞HCT116,观察细胞形态变化;划痕实验观察细胞迁移侵袭能力的变化.实时定量PCR、Western blot检测HCT116细胞EMT标志物以及Slug的表达情况.siRNA敲除Slug表达,Western blot检测HCT116细胞EMT标志物表达变化,以及细胞形态变化.结果 TSA可以促进结直肠癌细胞HCT116的迁移能力,诱导HCT116细胞发生EMT转化,包括细胞形态改变,EMT标志物表达变化.TSA可以促进EMT关键转录因子Slug的表达,包括蛋白和mRNA水平;敲除Slug表达可以抑制TSA诱导的EMT转化过程.结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA通过上调Slug的表达促进结直肠癌细胞HCT116发生EMT转化,从而提高其迁移能力.     

尼卡地平对结肠癌细胞HCT116/L耐药的逆转作用研究

目的探究尼卡地平逆转耐奥沙利铂结肠癌细胞HCT116/L耐药的疗效及其机制。方法采用MTT法分别检测尼卡地平和奥沙利铂在HCT116/L和HCT116细胞上的药敏性,并检测尼卡地平能否逆转奥沙利铂耐药。采用流式细胞仪(FCM)检测HCT116/L细胞凋亡和细胞内罗丹明-123的浓度。结果奥沙利铂在耐药细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的IC50分别为(20.07±1.32)μM,(0.65±0.05)μM,具有明显的耐药差异性(P<0.001),耐药指数(RI)为(30.86±2.21)。尼卡地平在耐药细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的IC50分别为(22.76±1.52)μM,(21.65±1.35)μM,两者之间的细胞毒性没有统计学差异。FCM法检测结果显示尼卡地平和奥沙利铂联用能显著增加耐药细胞株凋亡率(P<0.001),且能明显增加耐药细胞HCT116/L内罗丹明-123的浓度。结论尼卡地平能增强HCT116/L细胞对奥沙利铂的敏感性,其逆转耐药的作用与诱导耐药细胞HCT116/L凋亡,影响转运蛋白P-gp的功能有关。     

ABC跨膜转运蛋白基因表达与乳腺癌铂类药物敏感性的相关性研究

目的：研究乳腺癌患者肿瘤细胞对3种铂类药物的体外敏感性,并进一步研究其敏感性与乳腺癌细胞中ABC跨膜转运蛋白基因表达的关系。方法：对人乳腺癌细胞进行体外培养,用MTT法检测顺铂、卡铂、奥沙利铂等药物作用后肿瘤细胞的活力变化;同时采用实时荧光定量PCR技术,对乳腺癌细胞中的11种ABC跨膜转运蛋白基因表达水平进行检测。结果：顺铂耐药组的ABCB1、ABCG2表达明显高于敏感组;卡铂耐药组的ABCB1表达明显高于敏感组;乳腺癌细胞的ABCB1、ABCC6表达水平与顺铂对肿瘤细胞的抑制率有明显相关性;ABCB1的表达水平与卡铂对肿瘤细胞的抑制率有明显相关性。奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率与ABC跨膜转运蛋白的基因表达水平无明显相关性。结论：ABC跨膜转运蛋白家族的多个蛋白的高表达与顺铂、卡铂的耐药有关,其中ABCB1的高表达与药物耐药的关系最为显著。     

CCDC12蛋白在结直肠癌组织表达情况与肿瘤化疗药物抵抗的关系

目的 探讨结直肠癌组织中CCDC12蛋白表达与肿瘤细胞化疗效果的关系及意义.方法 留取84例结直肠癌手术患者的肿瘤及癌旁正常肠黏膜的石蜡组织及新鲜组织,免疫组化技术检测CCDC12蛋白、多药耐药蛋白1(MRP-1)、P-糖蛋白(P-gp)、生存素(Survivin)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)的表达情况;噻唑蓝(MTT)法检测氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、奥沙利铂(L-OHP)对肿瘤细胞的抑制作用.另取20例结直肠癌患者的肿瘤及癌旁正常肠黏膜新鲜标本,蛋白印迹法(Western blotting)检测CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1的表达情况.结果 免疫组化结果显示CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin在结直肠癌组织中表达均明显高于癌旁正常肠黏膜,Apaf-1在结直肠癌组织中表达降低(均P<0.05).5-Fu、L-OHP对CCDC12阳性表达的结直肠癌细胞抑制率低于阴性表达者(均P<0.05),而CDDP对肿瘤细胞的抑制作用与CCDC12表达无明显关系(P>0.05).5-Fu对结直肠癌细胞的抑制情况与MRP-1、P-gp表达有关;CDDP对肿瘤细胞的抑制情况与Survivin有关;L-OHP对肿瘤细胞的抑制作用与Survivin、Apaf-1有关(均P<0.05).相关分析显示,结直肠癌组织中CCDC12蛋白与P-gp、Survivin均呈正相关,与Apaf-1呈负相关(均P<0.05).Western blot结果与免疫组化相符.结论 CCDC12蛋白在结直肠癌组织中表达增高并与化疗药物的效果有关,CCDC12蛋白参与了结直肠癌的耐药形成并可能成为耐药性逆转的靶蛋白.     

MiR-143-5p通过靶向FGF1促进结肠癌对奥沙利铂化疗敏感性的研究

目的探讨miR-143-5p促进结肠癌对奥沙利铂的敏感性及其分子机制。方法通过荧光定量PCR检测miR-143-5p在结肠癌HCT-116细胞和奥沙利铂耐药细胞HCT-116/L中的表达,通过转染miR-143-5p mimics构建miR-143-5p过表达的HCT-116/L细胞株,通过CCK8和流式细胞术分别检测miR-143-5p和奥沙利铂对结肠癌HCT-116/L细胞活力和凋亡的影响,通过双荧光素酶报告基因检测miR-143-5p的靶基因,结肠癌HCT-116/L细胞转染miR-143-5p mimics及对照miR-NC,并转染FGF1表达载体,通过CCK8和流式细胞术分别检测FGF1对结肠癌HCT-116/L细胞活力和凋亡的影响,并通过Western blot检测miR-143-5p对FGF1和caspase 3蛋白表达的影响。结果与人结肠癌细胞HCT-116/L比较,miR-143-5p在结肠癌耐奥沙利铂细胞HCT-116/L中表达明显下调(P0.05),miR-143-5p mimics能够明显抑制结肠癌细胞活力(P0.05),促进结肠癌细胞凋亡(P0.05),双荧光素酶报告基因实验证实miR-143-5p能与FGF1 3′UTR结合,FGF1能够能够明显促进结肠癌细胞活力(P0.05),抑制结肠癌细胞凋亡(P0.05),miR-143-5p mimics明显抑制FGF1蛋白表达(P0.05),促进caspase 3蛋白表达。结论 MiR-143-5p能够通过调控靶基因FGF1的表达,抑制结肠癌耐奥沙利铂HCT-116/L细胞活力,促进细胞凋亡,促进结肠癌HCT-116/L细胞对奥沙利铂的敏感性。     

芍药内酯苷对人卵巢癌多药耐药的逆转作用

目的 研究芍药内酯苷(albiflorin, AL)逆转人卵巢癌多药耐药的作用和潜在机制。方法 采用CCK-8试剂盒检测AL对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转作用,采用流式细胞术检测AL对P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)功能的影响,采用RT-qPCR和Western blot检测AL对SKOV3/DDP细胞中MYC、WWP1和ABCB1/P-gp的影响。采用RNA干扰技术构建MYC敲低的SKOV3/DDP细胞株,观察其耐药性、P-gp功能及相关基因和蛋白表达变化。结果 AL对SKOV3/DDP细胞有耐药逆转作用,对P-gp功能抑制作用具有浓度依赖性。AL 25、50、100μmol·L^-1对ABCB1/P-gp、MYC和WWP1的抑制作用均逐渐增强。MYC抑制剂MYCi975对ABCB1/P-gp、MYC和WWP1的抑制作用均强于或相当于AL100μmol·L-1组。SKOV3/DDP细胞敲低MYC后,细胞耐药性、P-gp功能以及相关基因和蛋白表达均受到抑制。结论AL对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转作用可能与抑制P-gp功能和ABCB1/P-...     

TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性关系的研究

目的探讨TIP30启动子CpG岛甲基化状态与大肠癌细胞对奥沙利铂敏感性的关系。方法采用MTT法检测HCT116和HT29大肠癌细胞株对L-OHP的敏感性。通过甲基化特异性PCR,检测对奥沙利铂敏感性有差异的2个大肠癌细胞株中TIP30基因启动子CpG岛甲基化状态,并用RT-PCR法检测其mRNA表达。结果 HCT116及HT29细胞中TIP30基因甲基化状态存在差异,其表达水平与启动子CpG岛甲基化状态有关,并且二者对奥沙利铂的敏感性不同。结论 TIP30基因启动子甲基化状态可能影响大肠癌细胞对化疗药物的敏感性,为大肠癌患者的个体化治疗提供了依据。     

shRNA沉默STAT3基因对结肠癌细胞增殖及顺铂敏感性的影响

目的 构建携带信号转导与转录激活子3（STAT3）基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,观察pGPU6/GFP/Neo- STAT3重组质粒对HCT116细胞顺铂化疗敏感性的影响。方法 设计并构建稳定转录shRNA STAT3的质粒,采用脂质体法转染结肠癌HCT116细胞,Western blot法检测转染后STAT3蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖变化。重组质粒联合顺铂作用于HCT116细胞后,MTT法检测细胞存活率。结果 成功构建了pGPU6/GFP/Neo-STAT3重组质粒,测序证实重组质粒构建正确。重组质粒转染HCT116细胞后,细胞增殖明显受抑制,STAT3蛋白表达降低。重组质粒联合顺铂治疗后,细胞增殖活性显著降低。结论 shRNA STAT3重组质粒能明显降低HCT116细胞中STAT3蛋白的表达,抑制细胞增殖,提高结肠癌细胞对顺铂的敏感性。     

ZNF300基因在肝癌耐药细胞HepG2/VCR中的表达及功能初探

目的建立人肝癌HepG2/VCR耐药细胞株,检测ZNF300基因在HepG2/VCR中的表达并初步分析其在肝癌多药耐药(MDR)中发挥的功能。方法采用体外低浓度梯度递增的诱导方法建立长春新碱(VCR)获得性HepG2/VCR耐药细胞株。MTT法检测确定HepG2/VCR耐药细胞株对VCR的耐药性,用Western blot方法检测人锌指蛋白ZNF300基因编码的ZNF300及多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)在HepG2和HepG2/VCR细胞中的表达差异;在HepG2/VCR细胞中转染ZNF300基因正向或反向cDNA质粒后,MTT法检测VCR对耐药细胞IC50值的变化,Westernblot方法检测细胞内P-gp表达的影响。结果 MTT检测确认HepG2/VCR耐药细胞构建成功,Western blot检测发现耐药细胞中ZNF300及P-gp的表达相对于HepG2细胞明显增高。在HepG2/VCR细胞中转染正向ZNF300 cDNA质粒后,MTT和Western blot检测发现ZNF300过表达可使VCR对耐药细胞的IC50值增高,并使细胞内P-gp表达上调;在转染反向cDNA质粒Knockdown ZNF300基因表达后得到相反的结果。结论 ZNF300基因在HepG2/VCR耐药细胞中表达明显增高,并能通过上调耐药蛋白P-gp的表达促进肝癌细胞耐药性,可以作为逆转肝癌多药耐药的分子作用靶点。     

甲磺酸阿帕替尼通过p53抑制结肠癌细胞HCT116增殖的作用及机制

摘要：目的 探讨阿帕替尼对人结肠癌细胞HCT116及敲除野生型p53的HCT116细胞抑制作用的差异并探讨 其机制。方法 以0、15、30、60 μmol/L阿帕替尼处理HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞24、48 h,以CCK-8法检测阿 帕替尼对两株细胞增殖的抑制作用;流式细胞术（Annexin V/PI法）检测0、15、30 μmol/L阿帕替尼处理细胞24 h后凋 亡率变化;实时荧光定量PCR法和Western blot法检测0、15、30 μmol/L阿帕替尼处理细胞24 h后,p53、NF-κB p65、 Caspase-3 mRNA和蛋白表达变化。结果 CCK-8结果显示,阿帕替尼能抑制HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞的增 殖,抑制作用具有剂量依赖性（P＜0.01）。流式细胞术结果显示,阿帕替尼干预后,HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞 凋亡率升高（P＜0.01）。与HCT116 p53+/+细胞相比,阿帕替尼处理后HCT116 p53-/-细胞的凋亡率较低（P＜0.05）。阿 帕替尼处理后,HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞中 p53、NF-κB p65、capsase-3 mRNA 和 Caspase-3 蛋白表达升高 （P＜0.05）。阿帕替尼干预后,HCT116 p53+/+细胞中 p53、NF-κB p65 蛋白表达下调而 HCT116 p53-/-细胞中 NF-κB p65蛋白表达上调（P＜0.01）。结论 阿帕替尼可能通过p53/NF-κB通路抑制HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-细胞增殖 并促进细胞凋亡,结肠癌细胞可能通过野生型p53对阿帕替尼产生耐药。     

紫草素对人结肠癌细胞HCT116自噬和凋亡的影响

目的:研究紫草素对人结肠癌细胞HCT116自噬和凋亡的影响。方法:以0(空白对照)、10、20、40μg/mL紫草素作用于HCT116细胞48 h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和Western blotting法检测细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)和自噬相关蛋白Beclin-1、p62的mRNA及其蛋白表达水平。结果:与空白对照比较,10、20、40μg/mL紫草素作用48 h后HCT116细胞的增殖抑制率和凋亡率均显著升高(P<0.05或P<0.01)。10、20、40μg/mL紫草素作用于HCT116细胞48 h后均可不同程度地升高细胞中LC3、Beclin-1、p62 mRNA及其蛋白的表达水平,除10μg/mL紫草素作用后细胞中LC3 m RNA表达水平升高不显著外,其余指标水平与空白对照比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:紫草素可诱导人结肠癌细胞HCT116发生凋亡,并激活其自噬途径。     

基于结肠癌HCT116细胞三维培养模型的灵芝组分抗肿瘤活性研究

目的 基于结肠癌HCT116细胞的二维(2D)和三维(3D)培养模型研究灵芝组分(Ganoderma components,Gc)的抗肿瘤作用。方法 采用UPLC-Q-TOF-MS鉴定3种Gc的化学组成;以Matrigel基质胶为基质材料建立体外HCT116细胞3D培养模型,评价Gc1、Gc2、Gc3和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对2D和3D培养的HCT116细胞增殖的影响,并在HCT116细胞3D培养模型中分析Gc3对周期、凋亡、耐药、脂代谢及5-FU抗肿瘤活性的影响;采用CCK-8法检测细胞活力;Real-time PCR检测细胞mRNA表达水平;Western blotting检测细胞蛋白表达水平;采用HPLC检测细胞内5-FU含量。结果 从Gc1、Gc2和Gc3中分别鉴定出76,69和17个化合物;与2D培养相比,3D培养的HCT116细胞增殖率更低,周期促进蛋白CDK2、CDK4、CDK6及脂肪酸合成蛋白FASN、SREBP1的表达显著下调,周期抑制蛋白p21和p27、脂滴分解蛋白ATGL及药物抵抗基因ITGB1、CDH1、ABCB1、ABCC1 m...     

Regulation of gamma-H2AX and securin contribute to apoptosis by oxaliplatin via a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human colorectal cancer cells

Oxaliplatin, a chemotherapeutic drug, induces DNA strand breaks leading to apoptosis in colorectal cancer cells. gamma-H2AX is a phosphorylated histone H2AX that can act as a marker of DNA double-strand breaks (DSBs). It has been shown that securin proteins were over-expressed in a variety of cancer cells. However, the roles of gamma-H2AX and securin on the oxaliplatin-induced apoptosis in human colorectal cancer cells remain unclear. Treatment of oxaliplatin (1-10muM for 6-24h) persistently induced gamma-H2AX formation and inhibited securin protein expression via a time- and concentration-dependent manner in HCT116 securin-wild type colorectal cancer cells. Compared with HCT116 securin-wild type cells, the induction of apoptosis and persistent gamma-H2AX formation by oxaliplatin was reduced in the HCT116 securin-null colorectal cancer cells. Furthermore, the blockage of caspases by specific caspase inhibitors reduced the levels of gamma-H2AX proteins and cytotoxicity but increased securin protein expression in the oxaliplatin-exposed cells. The gene knockdown of H2AX by transfection with a short interfering RNA of H2AX enhanced the oxaliplatin-induced cell death. Interestingly, the phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) was markedly increased by oxaliplatin. Pre-treatment of a specific p38 MAPK inhibitor SB202190 reduced gamma-H2AX proteins and increased securin protein expression in the oxaliplatin-treated cells. Our findings suggest that p38 MAPK may oppositely regulate securin protein expression and gamma-H2AX formation in the oxaliplatin-induced apoptosis of human colorectal cancer cells.     

microRNA-21促进人肺腺癌细胞A549对顺铂耐药性的研究

目的 研究microRNA-21(miR-21)对人肺腺癌细胞A549对于顺铂耐药性的影响及分子机制.方法 MTT法检测A549和顺铂耐药株A549/CDDP对于顺铂的敏感性,以及在A549细胞中过表达miR-21和在A549/CDDP细胞中抑制miR-21表达后对顺铂敏感性的影响;RT-PCR方法检测A549和A549/CDDP中miR-21表达情况;Western blotting检测PI3K/AKT,核因子-κB (NF-κB)信号通路的激活情况以及在过表达miR-21和抑制miR-21表达后细胞中AKT信号通路的活性变化情况.结果 相对于A549细胞,A549/CDDP对顺铂的敏感性有明显降低,而细胞中miR-21表达则明显增多.Western blotting结果表明:与A549细胞相比,A549/CDDP细胞PI3K/AKT通路被激活,NF-κB通路没有明显变化.过表达miR-21可以激活PI3K/AKT信号通路并提高A549细胞对顺铂的耐药性,相反地,抑制miR-21表达抑制了A549/CDDP细胞中的AKT通路的活化情况并降低了A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性.结论 miR-21可以促进肺癌细胞A549对顺铂的耐药性,其机制与PI3K/AKT信号通路的激活有关.     

小檗碱抑制HCT116细胞生长与Wnt/β-catenin信号的关系研究

目的研究小檗碱对结肠癌细胞的增殖抑制作用与Wnt/β-catenin信号的关系。方法结晶紫染色法检测小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用,采用流式分析及West-ern blot研究小檗碱诱导HCT116细胞凋亡;Western blot检测β-catenin蛋白表达、RT-PCR法检测β-catenin mRNA表达,确定小檗碱对其表达的影响;采用外源性过表达β-cate-nin研究小檗碱抑制HCT116细胞增殖与β-catenin的关系。结果小檗碱处理组细胞较对照组细胞增殖明显受到抑制,并诱导HCT116细胞凋亡。小檗碱处理组全细胞、胞质及核内β-catenin蛋白水平均明显较对照组低。外源性过表达β-catenin能减弱小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用。小檗碱处理组β-catenin mRNA表达明显受到抑制。结论小檗碱能抑制HCT116细胞增殖并抑制Wnt/β-catenin信号转导,其机制可能与下调β-catenin mRNA表达有关。