结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

PCR—SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌rpoB基因突变检测

本文用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法直接检测痰标本中结核分支杆菌ｒｐｏ基在变，评价此方法用于结核分支杆菌利福平耐性试验的意义，以期建立一种直接检测分支杆菌耐利福平的快速方法。本文用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法分析了３０例结核病人和２０例非结核性肺部疾病病人痰标本。３０份肺结核病人的痰用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测痰中结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变：２１份痰ＰＣＲ扩增阳性，其中１３份ＳＳＣＰ图谱与参考株Ｈ３７ＲｖＳＳＣＰ图谱有     

结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测

目的了解结核分支杆菌链霉素（Ｓｍ）耐药基因突变情况，建立快速检测耐药突变株的方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析了２２株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｓＬ基因，并应用ＰＣＲ－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）进一步分析其突变的部位和性质。结果以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，５株敏感株的ｒｐｓＬ基因未见ＳＳＣＰ泳动异常、有ＭｂｏⅡ酶切位点；１３株耐Ｓｍ株中，１１株（８６％）有ｒｐｓＬ基因泳动异常、无ＭｂｏⅡ酶切位点；４株耐其它抗结核药物株中，也有１株ＳＳＣＰ泳动异常、并无ＭｂｏⅡ酶切位点。结论大多数结核分支杆菌Ｓｍ耐药分离株有ｒｐｓＬ突变，而突变位点大多位于第４３位密码子。应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可能成为快速检测结核分支杆菌耐药突变株的新方法。     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照、５０例耐ＲＦＰ（单耐和多耐）结核分枝杆菌临床分离株、１２例ＲＦＰ敏感菌株、３５例耐ＲＦＰ肺结核患者痰标本,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测痰标本和菌株中结核杆菌ｒｐｏＢ基因突变。结果 ５０例耐ＲＦＰ菌株中有４５例ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条带与     

PCR—冷SSCP快速检测结核菌rpoB基因突变

为了评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核菌对利福平耐药性测定中的应用价值，作者对８７株结核菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行了ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ分析。结果；ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，于分支杆菌特异。     

结核分支杆菌利用福平药物敏感性的直接快速检测

探讨利用分子生物 学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（ＲＦＰ）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对ｒｐｏＢ基因特异扩增的引物（扩增产物为１８３ｂｐ片段）,运用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色法,检测４５株结核分支杆菌临床分离株,对其中部分菌株进行ｒｐｏＢ基因ＤＮＡ序列分析,运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色法对７０份结核病患痰标本进行直接快速检测,并与药敏试验结果做对照分     

耐多药结核分支杆菌三种耐药基因检测

报道聚合酶链反应单链构象多态性（ＰＣＲＳＳＣＰ）方法检测耐多药结核分支杆菌ｒＰＯＢ、ｒＰＳＬ和ＫａｔＧ基因突变情况。材料和方法（１）菌株：结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ参考菌株购自中国菌种保存中心；１０２株结核分支杆菌临床分离株取自本市肺结核患者，常规进...     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的 了解结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ＫａｔＧ基因完全缺失或突变的情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。方法 应用ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对５８株结核分支杆菌临床分离株的ＫａｔＧ基因进行分析。结果 以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，１２株敏感株的ＫａｔＧ基因扩增产物，１１株ＳＳＣＰ泳动正常，１株（８．３％）异常；２４株耐ＩＮＨ株中，３株（１２．５％）ＰＣＲ扩增阴性，２１株ＫａｔＧ扩增阳性，其     

耐多药结核病耐药分子机制的研究

目的 研究耐多药结核分支杆菌耐药的分子机理，建立快速检测耐药基因的分子药敏试验方法。方法 通过ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结构分支杆菌耐多药临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果 ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ基因引物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的的特异性。２０株耐多药分离株中，９０％有２种以上耐药遗传标志改变，     

链亲合素包被磁珠用于PCR-SSCP检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的实验研究

在ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（聚合酶链反应－单链构象多态性分析）技术用于结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变的检测中，为解决传统解链方法的复性和电泳需在低温条件下进行的问题，我们应用磁珠解链法，即在ＰＣＲ扩增时应用生物素标记正向引物（反向引物未标记），然后用链亲合素包被磁珠吸附扩增产物中被标记的ＤＮＡ。在碱性环境时，互补ＤＮＡ解链后磁珠沉于管底的同时将被标记的ｓｓＤＮＡ携带沉降；而管中未标记的互扑单链ＤＮＡ则游离于变性液中，随后被吸出，这样两条互补单链ＤＮＡ被完全分开，使ＤＮＡ复性问题得以解决。同时使电泳可在常温下进行。应用磁珠解链法较之传统解链方法所得泳带清晰易辨，显示出该方法用于ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变的实用价值。     

耐利福平核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的 研究中国五省、市部分耐利福平（ＲＦＰ）或含ＲＦＰ的耐多药结核分支杆菌临床分离株ｒｐｏＢ基因突变的情况及抽提鉴定是否含有质粒,为评价耐ＲＦＰ的分子机制,进而为结核病基础和临床研究提供分子遗传学依据。方法 采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术,对来自河南省、河北省、安徽省、北京市、上海市２６２株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株７４株,耐ＲＦＰ或含ＲＦＰ耐多药株１８８株）ｒｐｏＢ基因突变的发生率进行研究;同时,对７６株结核发支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果中国五省、市的部分耐ＲＦＰ或含ＲＦＰ耐多药结核分支杆菌临床分离株ｒｐｏＢ基因突变的发生率平均为９２％,而各地分别为：河南省９０％,河北省９１％,北京市９１％,上海市９２％,经统计学处理,五省、市之间差异无显性意义（ｘ＾２＝０．４２,Ｐ〉０     

结核分支杆菌耐吡嗪酰胺分离株pncA基因突变的研究

目的 了解我国结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（ＰＺＡ）分离株ｐｎｃＡ基因突变情况,研究其与耐ＰＺＡ之间的关系。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－循环测序法（ＡＳ）分析７４株结核分支杆菌临床分离株的ｐｎｃＡ基因。以结核分支杆菌Ｈ３７ＲＶ标准株为对照。结果３２株药物敏感株ｐｎｃＡ基因ＳＳＣＰ分析未发现异常。２０株耐非ＰＺＡ药物的分离株中,１６株ｐｎｃＡ基因ＳＳＣＰ泳动正常;     

ahpC基因突变与结核分支杆菌耐异烟肼的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ａｈｐＣ编码基因及其启动子突变情况，研究其与ＩＮＨ耐药关系。方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法分析６２株结核分支杆菌临床分离株ａｈｐＣ及其启动子基因。以Ｈ３７ＲＶ标准株为对照。结果３２株结核分支杆菌药物敏感株ａｈｐＣ及其启动子基因ＳＳＣＰ均泳动正常；３０株耐ＩＮＨ分离株ａｈｐＣ编码基因ＳＳＣＰ也未见异常；１２株高度耐ＩＮＨ分离株中，５株ａｈｐＣ启动子ＳＳＣＰ泳动异常；１８株低度耐ＩＮＨ分离株的ａｈｐＣ启动子泳动正常。结论结核分支杆菌ａｈｐＣ编码基因与耐ＩＮＨ无关；ａｈｐＣ启动子突变是结核分支杆菌ｋａｔＧ改变、过氧化氢酶缺乏的代偿性变化，也许能作为结核分支杆菌高度耐ＩＮＨ的间接指标。     

链亲合素包被磁珠用于PCR—SSCP检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因 …

在ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术用于结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变的检测中，为解决传统解链方法的复性和电泳需在低温条件下进行的问题，我们应用磁珠解链法，即在ＰＣＲ扩增时应用生物素标记正向引物，然后用链亲合素包被磁珠吸附扩增产物中被标记的ＤＮＡ。     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结 …

目的 提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测分支杆菌ＤＮＡ的特异性和敏感性、以检测和鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌ＤＮＡ。方法 应用三对具有特异性的寡核苷酸引物，进行多重ＰＣＲ扩增。这三对引物分别对应于分支杆菌６５０００表面抗原、结核分支杆菌插入序列ＩＳ６１１０及人类β－珠蛋白基因的部分序列，其扩增产物分别为３８３ｂｐ、１２３ｂｐ和２６８ｂｐ。结果 此多重ＰＣＲ电泳检测的灵敏度为０．６ｐｇ。经多重ＰＣＲ     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮH）分离株ＫａtG基因完全缺失或突变的情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。方法应用ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对５８株结核分支杆菌临床分离株的ＫａｔＧ基因进行分析。结果以Ｈ３７，ＲＶ标准株为对照，１２株敏感株的ＫａｔＧ基因扩增产物，１１株SSCP泳动正常，1株（８．３％）异常；２４株耐ＩＮＨ株中，３株（ｌ．５％）PCR扩增阴性，ＺＩ株ＫａtG扩增阳性，其中１６株（７６．２％）SSCP泳动异常；２２株耐其它抗结核药物株中，也有７株（３１．８％）SSCP异常。结论某些结核分支杆菌ＩＮＨ耐药性产生可能是由于其ＫａｔＧ基因完全缺失或ＫａｔＧ基因突变所致，但某些菌株也可能与ＫａｔＧ基因无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。     

结核分支杆菌rpoB基因克隆与酶谱分析

目的克隆结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。方法以结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因保守区的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增片段为探针从已建立的结核分支杆菌基因文库中筛选ｒｐｏＢ基因。结果引物ＴＲ１、ＴＲ２ｂ扩增Ｈ３７ＲａＤＮＡ获１约４１１ｂｐ片段。经克隆及序列分析表明该片段与结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因中央区域的序列同源。对约１２０００个克隆进行筛选，共获７个可疑阳性克隆，经过再次杂交证实其中３个克隆为阳性。其中１个克隆携带约３．８ｋｂ插入片段。一系列内切酶酶切分析后得出该３．８ｋｂ克隆片段的部分限制性内切酶酶谱。进一步分析表明所用４１１ｂｐ探针同源序列距两端分别为１ｋｂ和２．８ｋｂ。结论与报道的结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因开放阅读框架比较，我们克隆的３．８ｋｂ片段包含结核分支杆菌ｒｐｏＢ完整基因的大部分，为进一步研究利福平及其它利福霉素类药物抗结核作用方式及耐药机制奠定了基础     

结核分支杆菌H37Rv与H36Ra株mRNA基因差异显示研究

目的 采用ｍＲＮＡ差异显示技术研究Ｈ３７Ｒｖ珠与Ｈ３７Ｒａ株的基因差异，为获取结核分支杆菌毒力相关基因奠定基础。方法 提取结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ株和Ｈ３７Ｒａ株ＲＮＡ，经逆转录、ＰＣＲ扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行ｍＲＮＡ的差异显示。回收差异条带、再扩增和序列分析，进行同源性查询。结果 经差异显示后，共回收与Ｈ３７Ｒｖ株ｍＲＮＡ差异条带１０条。经结果查询，发现其中２条差异条带与结核分支杆     

三种快速检测结核分支杆菌方法的评价

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术、单克隆抗体（ＭｃＡｂ）ＴＢ１５－Ｃ３经酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及抗酸染色等３种方法，对１０种抗酸杆菌及２种非分支杆菌进行检测。ＰＣＲ仅对结核分杆菌复合体扩增出２４５ｂｐ特异性条带，ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ检测除人型结核分支杆菌外，还与ＢＣＧ、鸟型及瘰疠分支杆菌反应阳性，抗酸染色则所有分支杆菌均呈阳性。用ＰＣＲ、ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ及抗酸染色检测了１２４份监床标本，Ｐ