低温冻存同种异体软骨细胞在喉功能重建中的应用

目的:通过对深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨修复喉软骨缺损的能力研究,寻找一种活性软骨细胞的保存方法。方法:取3周龄新西兰兔关节软骨,经深低温冻存,复苏冻存不同时间的软骨细胞,体外培养,培养细胞呈单层细胞铺满培养瓶底后收集细胞,制成细胞悬液,接种于聚羟基乙酸(polyglycolicacid,PGA)三维支架材料上,复合物体外培养1周,接种于同种异体兔甲状软骨缺损处,术后2,4,8周取材,行大体及组织学观察。结果:经深低温冻存的软骨细胞与新鲜软骨细胞修复区愈合良好,无瘢痕及坏死现象,组织学观察均有软骨生成及基质分泌;冻存不同时间的软骨细胞组之间无明显差异。结论:经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力,可用于组织工程修复软骨缺损,冻存时间对其功能无明显的影响。     

深低温冻存软骨细胞构建组织工程化软骨

目的 :研究深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨的能力。方法 :取 2周龄新西兰兔关节软骨细胞 ,经深低温冻存、复苏及体外培养 ,取第 3代对数生长期培养细胞 ,制成细胞悬液 ,调整其为 5× 10 7个 / ml左右 ,接种于 PGA三维支架材料上 ,复合物体外培养 1周 ,移植于裸鼠皮下 ,术后 12周取材 ,行大体及组织学观察。结果 :经深低温冻存的软骨细胞与新鲜的软骨细胞一样形成了预定形态的软骨结构 ,组织学观察有软骨生成及基质分泌 ,单纯PGA支架及单纯的细胞悬液无软骨组织生成。结论 :经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力 ,可用于组织工程构建组织工程化软骨     

组织工程化软骨的低温保藏

背景:如何保存大量的具有生物活性的组织工程化软骨,并且长时间保持组织工程化软骨的生物活性,建立组织工程软骨库,是组织工程尚待解决的课题.目的:观察低温冻存对组织工程化软骨生物活性的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-02/2008-12在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成.材料:聚羟基乙酸无纺网为美国Albany公司产品.2周龄新西兰白兔5只,成年新西兰白兔20只由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法:体外培养2周龄新西兰兔关节软骨,取第2代对数生长期培养软骨细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×1010L-1,接种于聚羟基乙酸三维支架材料上,复合物体外培养1周后冻存,冻存4,8,12周后解冻复苏.1周后接种于成年新两兰兔皮下,术后12周取材.主要观察指标:采用光镜及扫描电镜观察冻存复苏后的组织工程化软骨的生长情况.采用四唑盐比色法测定细胞存活率.体内实验观察软骨细胞形态、软骨分泌胶原情况、基质分泌酸性黏多糖情况.结果:经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,冻存4,8,12周细胞存活率差异无显著性意义.组织学观察冻存组织工程骨植入区有软骨生成、胶原和黏多糖生成丰富.结论:深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,可用于保存组织工程化软骨.     

同种异体软骨细胞-聚羟基乙酸复合物修复喉软骨缺损

目的　探讨同种异体软骨细胞-聚羟基乙酸(PGA)复合物在有免疫力的动物体内对喉甲状软骨的修复能力。方法消化分离乳兔肋软骨，获取种子细胞，体外培养，收养第2～3代培养细胞，接种于经多聚赖氨酸处理后的PGA三维可降解生物支架料上。结果　合物体外培养7～10d，可见呈蜘蛛网状基质产生。术后4周，修复区愈合良好，无瘢痕及坏死现象；组织学观察可见愈合面有软骨细胞生成和基质分泌。结论　骨细胞-PGA复合物可用于喉软骨缺损的修复，修复区愈合良好，无明显免疫排斥反应。     

同种异体软骨细胞—聚羟基乙酸复合物修复喉软骨缺损

目的：探讨种异体软骨细胞－聚羧基乙酸（PGA）复合物在有免疫力的动物体内对喉甲状软骨的修复能力。方法：消化分离乳兔肋软骨，获取种子细胞，体外培养，收养第2－3代培养细胞，接种于经多聚赖氨酸处理后的PGA三维可降低解生物支架料上，结果复合物体外培养7－10d，可见呈蜘蛛网状基质产生。术后4周，修复区愈合良好，无瘢痕及坏死现;这观察可见愈合面有软骨细胞生成和基质分泌。结：软骨细胞－PGA复合物可用于喉软骨缺损的修复，修复区愈合良好，无明显免疫排斥反应。     

聚羟基乙酸无纺网设计在软骨组织工程中的适用研究

目的观察接种同种异体软骨细胞后，一定设计的三维生物可降解材料聚羟基乙酸(PGA)无纺网在组织工程化软骨形成中的降解性。方法取乳兔肋软骨细胞，接种于PGA支架材料上，经体外培养，体内皮下种植或修复软骨缺损，一定时间取材，观察PGA纤维在工程化软骨形成过程中的降解情况。结果软骨细胞-PGA复合物体外培养1周，可见基质产生，未见纤维降解迹象；体内种植或修复软骨缺损4周后，新生软骨内仍有较多PGA纤维；8周时PGA纤维已基本消失；12周软骨细胞成熟，基质分泌丰富，未见任何PGA存留迹象。结论一定设计的PGA无纺网在组织工程化软骨形成过程中适合其生物降解性要求。     

骨骺软骨细胞的培养和保存方法

目的：建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法，为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞。方法：2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后，接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现，并通过蕃红花“0”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定。结果：在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程，经多次传代后增殖能力降低，经过冻存的细胞生物学特征不变。蕃红花“0”和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论：我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法，并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞。     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的：探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法：实验于2003—09／12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体，麻醉处死后．切取关节软骨，系列酶消化分离软骨细胞，洗涤，37℃于体积分数为0．05的CO2中培养，传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞，将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周，再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果：实验共纳入4只日本大耳白兔，作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况：转染后3d，倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞，主要为三角形，少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加，绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主，少数细胞为三角形和椭圆形，体外培养8周，细胞增殖良好，荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87．3％。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果：软骨细胞三维接种支架后，细胞几乎全部种植于支架上，在支架材料内分布均匀，刚接种的细胞呈圆形，发出明亮的绿色荧光；3-4h细胞开始变形，2～3d即己基本完全变形，细胞的形态以长梭形为主，呈网状排列，随着培养时间延长，支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形，移植前（体外培养3周）支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周，细胞密度增加．荧光强度未见减弱，而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况：移植术后4周，大体观察可见移植组织有别于周围软骨，表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周，苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞，排列不规则，表层细胞体积较小，数量较多，深层细胞体积较大，细胞外基质较少，与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少，支架材料大部分降解吸收，修复区与周围组织分界清楚，连接处稍不平整，未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察，修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相，荧光充满整个细胞，荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中，与周围正常关节软骨分界清楚。结论：反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响，可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况，对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨简

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。 目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料，开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞，制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上，体外复合培养21 d，提取RNA进行RT-PCR检测，制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。 结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后，可贴附于支架上生长，并且大量细胞聚集成团，在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因，以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白，可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质，有望获得组织工程软骨组织。     

聚羟基烷酸酯聚合物负载软骨细胞修复同种异体喉软骨缺损

背景：软骨组织工程基础研究相当深入,但在耳鼻咽喉科实际应用研究颇少,探索组织工程技术简便实用的喉软骨修复方法是值得研究的课题,目的：比较多孔海绵状聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物生物材料负载软骨细胞体外培养形成的初期组织工程软骨组织与体内植入一定时期形成的较成熟组织工程软骨组织修复同种异体甲状软骨缺损的效果。方法：收集体外培养第3代乳兔（3d龄墩骨细胞,以多孔海绵状聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物生物材料为细胞外基质,采用组织工程技术制备细胞一材料复合物,共同体外培养形成初级组织工程软骨组织后直接应用于成兔甲状软骨缺损的修复（实验组A,n=5）或将初级组织工程软骨组织体内植入一定时期形成较成熟组织工程软骨再应用于甲状软骨缺损的修复（实验组B,n=5）。设单纯聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物材料修复组（对照A组,n=4）和单纯软骨细胞修复组（对照B组,n=4）作为对照。分别于术后4周（实验B组）和8周（实验A组、对照A组、对照B组）取材,对甲状软骨缺损修复效果进行大体和组织学评价。结果与结论：两者大体支架形态基本一致,修复区与原有软骨均相续平坦,无凹陷及缺损。但实验A组存在界面无细胞区,修复区基质分泌不丰富;实验B组界面区有细胞生长,基质分泌良好。两者炎细胞浸润均不明显。对照组修复区凹陷,呈暗红色软组织充填,组织学及特殊染色检查未发现软骨样结构及其分泌的基质成分。结果表明在有免疫力的动物体内,初级组织工程软骨组织直接应用与体内植入后再应用均能有效修复同种异体甲状软骨缺损,无明显免疫反应;相同时期内,应用较成熟组织工程软骨组织修复效果优于应用初级组织工程软骨组织。然而,直接应用初级组织工程软骨组织可节省时间、成本、工作量及操作环节,避免二次皮下手术的痛苦,是比较实用的方法之一。     

应用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞混合移植修复兔膝关节实验性软骨缺损区

背景：应用异体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的研究较多,但其可引起免疫反应.由于胚胎细胞具有较低的抗原性和较强的增殖能力,期望其能为组织工程研究与应用开辟新的载体材料.目的：采用兔胚胎软骨细胞培养移植修复关节软骨缺损,并对其组织形态学进行观察.设计：随机分组观察对比实验.单位：广西医科大学组织胚胎学试验室.材料：孕4周新西兰大白兔1只;成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体质量2～2.5 kg .方法：实验于2000-12/2002-06在广西医科大学组织胚胎学试验室完成.在成兔股骨内侧髁作关节软骨缺损模型,实验组采用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞相混后,植入兔膝关节实验性软骨缺损区,对照组不做任何处理或单纯用生物蛋白胶移植修补,分别于术后4,8,12周观察关节软骨缺损修复的情况,并按改良Pineda方法对其进行组织学评分,标准为细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、宿主结合5项,0分表示正常,分值越高表示改变越严重.主要观察指标：①兔膝关节标本大体观察结果.②兔膝关节标本组织学观察结果.③关节软骨组织学半定量计分结果.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果.结果：24只兔均进入结果分析.①兔膝关节标本大体观察结果：胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组缺损区颜色接近正常软骨,质韧弹性好,与周围软骨界限消失;纤维蛋白封闭剂组与未处理组始终未愈合,但创面略小,有白色纤维组织充填.②兔膝关节标本组织学观察结果：胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组优势组织为透明样软骨,深方为骨组织,表面略凸或平整,基质着色正常,与周围软骨完全结合分界不清,组织中未发现淋巴细胞浸润;纤维蛋白封闭剂组与未处理组为纤维组织,部分有残留明显的凹陷性瘢痕,与周围组织接合或部分接合.③关节软骨组织学半定量计分结果：按改良自Pineda方法,12周胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组评分显著低于纤维蛋白封闭剂组和未处理组[（0.50&;#177;0.76）,（7.88&;#177;1.13）,（8.13&;#177;1.36）分,P＜0.05],而单纯用纤维蛋白封闭剂修补组在4周与未处理组比较有显著性差异（P＜0.05）,在8,12周则无差异.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果：12周时胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组完全修复8膝,纤维蛋白封闭剂组不完全修复1膝,未修复7膝,未处理组未修复8膝.结论：胚胎软骨细胞移植组所产生的修复组织接近正常软骨组织,明显优于纤维蛋白封闭剂组和未处理组,该方法作为关节软骨缺损修复是可行的.     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4h细胞开始变形,2～3d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周,细胞密度增加,荧光强度未见减弱,而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况:移植术后4周,大体观察可见移植组织有别于周围软骨,表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周,苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞,排列不规则,表层细胞体积较小,数量较多,深层细胞体积较大,细胞外基质较少,与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少,支架材料大部分降解吸收,修复区与周围组织分界清楚,连接处稍不平整,未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察,修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相,荧光充满整个细胞,荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中,与周围正常关节软骨分界清楚。结论:反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响,可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况,对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物修复髌股关节软骨缺损

背景：传统的方法修复软骨损伤,易发生退变。聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性,可根据需要调节降解速度等性能,可能在修复软骨损伤方面具有应用前景。目的：观察以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物为载体修复兔关节软骨缺损的可行性。方法：选取2月龄新西兰兔骨髓培养,诱导间充质干细胞向软骨细胞分化。第3代细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物共培养制成聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物。建立兔髌股关节股骨髁部缺损模型,在右侧36个膝关节植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物,左侧18膝植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物,另18膝造成缺损后留作空白对照。术后4,8,12,24,36,48周取材,行大体及组织学观察,组织学评分。结果与结论：聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物修复大鼠缺损后,软骨细胞分布较均一,色泽与正常软骨相似,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,细胞呈团状,基质异染广泛,软骨下骨形成及潮线恢复正常,与周围正常软骨连接良好。而单纯植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物或缺损后未处理大鼠缺损边缘细胞呈团块状增生,底部为纤维组织。提示骨髓基质细胞源性软骨细胞是修复关节软骨缺损较理想的种子细胞,聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物适合作为组织工程修复关节软骨缺损的支架材料,具有良好的应用前景。     

关节软骨细胞复合胶原海绵异位构建组织工程化软骨组织的可能性

目的：观察兔关节软骨细胞与胶原海绵在体外复合培养以及体内植入后异位成软骨情况。方法：采用酶消化法分离、培养幼兔关节软骨细胞，取第三代细胞以3&;#215;10^7/ml密度均匀接种于胶原海绵中，分别通过倒置显向镜和扫描电镜观察软骨细胞在载体材料上生长增殖情况；将体外培养10d的软骨细胞／胶原海绵复合物植入裸鼠背部皮下，术后12周取材，进行大体观察和HE染色。结果：软骨细胞均匀分布于胶原海绵的孔壁和网眼内，并可分泌基质样物；复合培养物体内植入12周后可以形成新生透明软骨组织。结论：胶原海绵可以作为软骨细胞生长的支架载体，异位构建出组织工程化软骨组织。     

骨骺软骨细胞的培养和保存方法

目的建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法,为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞。方法2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后,接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现,并通过蕃红花“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定。结果在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程,经多次传代后增殖能力降低,经过冻存的细胞生物学特征不变。蕃红花“O”和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法,并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞。     

转化生长因子-β1诱导自体骨髓间质干细胞移植修复兔耳郭软骨缺损

目的：探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导自体骨髓间质干细胞(MSCs)修复兔耳郭软骨缺损的可行性。方法：取新西兰大白兔MSCs体外培养扩增，以含TGF-β1地塞米松和维生素C的培养液做诱导培养，以诱导后的软骨细胞和高孔隙率聚乳酸(PDLLA)形成复合物为实验组修复兔自体耳郭软骨缺损，对照组仅进行单纯PDLLA移植，分别于移植后6，12，18周取材，行苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色，观察各组兔耳郭软骨缺损修复情况。结果：术后18周缺损区完全由软骨组织修复，缺损表面光滑，软骨陷窝明显，与周围正常软骨组织无明显界限，单纯PDLLA对照组为纤维软骨和纤维组织修复。结论：TGF-β1诱导自体骨髓间质干细胞可用于修复兔耳郭软骨缺损。     

模拟微重力培养骨髓间充质干细胞定向诱导复合改良纤维蛋白原支架修复免关节软骨缺损

背景：模拟微重力培养系统通过模拟细胞生存的体内微重力环境,使细胞承受较低的剪切力,提高细胞内外、细胞间物质传递效率,从而提高细胞分化质量。目的：观察微重力培养环境在构建组织工程模块修复关节软骨缺损中的作用。设计、时间及地点：体外实验采用自身对照;体内实验采用随机分组比较,于2007-12／2008-06在广东省构建与检测实验室及南方医院动物实验中心进行。材料：3周普通级龄新西兰兔1只用于骨髓间充质干细胞培养：3月龄新西兰兔48只用于体内验证实验。方法：以纤维蛋白胶粉、凝血酶、氯化钙、抑肽酶、氨甲环酸制备纤维蛋白原支架。体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞3周,使之吸附于改良纤维蛋白原支架上在微重力环境下三维立体培养3周。48只兔做软骨钻孔制备软骨缺损动物模型,每只兔4孔。实验分为4组,每组48孔,微重力培养组在孔内植入微重力培养下的软骨细胞组织模块;普通培养组在孔内植入普通培养下的软骨细胞组织模块;单纯支架组在孔内植入空白支架;空白组孔内不植入任何材料,分别于2,6,12周处死动物,取相应标本。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学检测微重力培养环境在三维立体培养对软骨细胞增殖及功能的影响,以及用组织工程学评分检测微重力环境下培养的软骨模块对缺损的修复效果。结果：模拟微重力培养条件下构建的模块体外培养3周,细胞数量明显增多,并分泌较多的细胞基质,包裹在软骨细胞周围。组织工程学评分显示微重力培养组修复软骨缺损的效果明显好于其他组。结论：模拟微重力培养环境对三维立体培养软骨细胞模块有比较良好的效果。     

应用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞混合移植修复兔膝关节实验性软骨缺损区

背景应用异体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的研究较多,但其可引起免疫反应.由于胚胎细胞具有较低的抗原性和较强的增殖能力,期望其能为组织工程研究与应用开辟新的载体材料.目的采用兔胚胎软骨细胞培养移植修复关节软骨缺损,并对其组织形态学进行观察.设计随机分组观察对比实验.单位广西医科大学组织胚胎学试验室.材料孕4周新西兰大白兔1只;成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体质量2～2.5 kg .方法实验于2000-12/2002-06在广西医科大学组织胚胎学试验室完成.在成兔股骨内侧髁作关节软骨缺损模型,实验组采用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞相混后,植入兔膝关节实验性软骨缺损区,对照组不做任何处理或单纯用生物蛋白胶移植修补,分别于术后4,8,12周观察关节软骨缺损修复的情况,并按改良Pineda方法对其进行组织学评分,标准为细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、宿主结合5项,0分表示正常,分值越高表示改变越严重.主要观察指标①兔膝关节标本大体观察结果.②兔膝关节标本组织学观察结果.③关节软骨组织学半定量计分结果.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果.结果24只兔均进入结果分析.①兔膝关节标本大体观察结果胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组缺损区颜色接近正常软骨,质韧弹性好,与周围软骨界限消失;纤维蛋白封闭剂组与未处理组始终未愈合,但创面略小,有白色纤维组织充填.②兔膝关节标本组织学观察结果胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组优势组织为透明样软骨,深方为骨组织,表面略凸或平整,基质着色正常,与周围软骨完全结合分界不清,组织中未发现淋巴细胞浸润;纤维蛋白封闭剂组与未处理组为纤维组织,部分有残留明显的凹陷性瘢痕,与周围组织接合或部分接合.③关节软骨组织学半定量计分结果按改良自Pineda方法,12周胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组评分显著低于纤维蛋白封闭剂组和未处理组[(0.50±0.76),(7.88±1.13),(8.13±1.36)分,P＜0.05],而单纯用纤维蛋白封闭剂修补组在4周与未处理组比较有显著性差异(P＜0.05),在8,12周则无差异.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果12周时胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组完全修复8膝,纤维蛋白封闭剂组不完全修复1膝,未修复7膝,未处理组未修复8膝.结论胚胎软骨细胞移植组所产生的修复组织接近正常软骨组织,明显优于纤维蛋白封闭剂组和未处理组,该方法作为关节软骨缺损修复是可行的.     

自体骨髓基质细胞与同种异体脱钙骨基质复合移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨自体骨髓基质细胞与同种异体脱钙骨基质复合移植对关节软骨缺损的修复效果。方法：抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后,与制备好的同种异体脱钙骨基质相结合,一并植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损包,并与空白对照组及单纯脱钙骨基质植入对照组相比较,术后第3,6,9,12周活体取材大体观察并做组织形态学观察。结果：实验组的关节软骨缺损其修复表面渐光滑,接合渐牢固,透明软骨渐形成,术后12周其软骨及软骨下骨组织基本修复;而对照组关节软骨缺损仅有类软骨或纤维组织修复。结论：骨髓基质细胞来源充足,取材容易;而脱钙骨基质和骨髓基质细胞之间的组织相容性好,脱钙骨基质能促进骨髓基质细胞的分化,二者的复合移植修复关节软骨缺损的效果良好。     

糖尿病兔全层关节软骨缺损骨膜移植的修复

目的：评价自体骨膜移植修复糖尿病兔全层关节软骨缺损的生物特性和效果，探讨其可行性。方法：将36只兔随机分为糖尿病兔骨膜移植组，健康家兔骨膜移植组和对照组。每组12只，前两组分别给予相应处理，对照组单纯制造缺损不作任何修复。于术后4，8，12周处死取材，分别进行大体、光镜、电镜观察，并对观察指标进行量化，数据行统计学分析。结果：大体观察糖尿病兔和健康兔骨膜移植组在第12周时均能以类透明软骨组织修复缺损，而对照组为纤维肉芽组织。光镜观察指标显示两种手术方法均能以软骨的方式修复缺损。甲苯胺蓝染色提示软骨细胞有活性，可分泌正常软骨基质，同源软骨细胞在软骨陷窝中存活，但糖尿病兔组基质染色较健康兔组浅。电镜观察表明，修复两组均有软骨细胞生成，有正常软骨陷窝，细胞器发达并能行使正常功能。对照组修复组织符合纤维肉芽组织的特征。结论：骨膜移植也能以类透明软骨修复糖尿病兔全层关节软骨缺损，软骨细胞生物学特性类似于正常关节软骨细胞。