单克隆抗体ELISA检测循环抗原及免疫复合物有关技术的研究

通过McAb应用于ELISA检测人工感染弓形虫家兔血清循环抗原(CA_g)及免疫复合物(CIC)的实验研究,探讨McAb-ELISA试验的有关技术因素,选择稳定而可行的McAb-ELISA实验条件。 人工感染弓形兔10只,康健兔5只,同步采血分离血清或制备滤纸血。采用双McAb-ELISA夹心法检测CA_g;单抗二抗ELISA法检测CIC.实验样品一式2孔,重复2次。 实验结果表明:一、用McAb包被液致敏反应板的效果,pH9.6碳酸盐缓冲液优于pH7.4磷酸盐缓冲液。二、纯化的McAb及McAb-HRP冷藏贮存一年内     

感染弓形虫家兔血清循环抗原、免疫复合物及抗体的消长规律

应用ELISA观察人工感染弓形虫家兔90d内血清循环抗原(C_Ag)、循环免疫复合物(CIC)及抗体(Ab)的消长规律,探讨检测C_Ag、CIC及Ab诊断弓形虫病的价值及诊断指标。 弓形虫感染组兔6只,对照组兔5只,两组同时分期采血分离血清。FLISA方法采用双单抗夹心法检测C_Ag;单抗二抗法检测CIC;一般间接法检测Ab. 一、家兔感染弓形虫的临床发病观察结果:接种后第1～3d无临床症状,可定为潜伏期。第4d有6兔     

弓形虫感染家兔精液中虫体DNA检测初报

目的了解弓形虫感染家兔精液中是否有虫体存在，探明虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子不同剂量经腹腔感染家兔6只。在家兔感染前后分别采集精液，-40℃冻存备用，分别用普通PCR检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA。结果5只家兔在感染后的8～14d死亡，仅1只家兔在感染后的8d和72d，用PCR检测手段在精液中均可检测到弓形虫DNA。结论弓形虫感染雄兔精液中有虫体存在。     

弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化

目的检测弓形虫感染家兔精液中虫体DNA,观察虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集精液,-40℃冻存备用,采用两种方法提取精液中总DNA,用实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,QRT-PCR)检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与精液中虫体含量的动态曲线图。结果16只雄兔感染前其精液中均不能检测到弓形虫DNA,精液中虫体含量在感染后7wk左右达到高峰期,然后虫体含量逐渐下降。在感染9wk~15wk维持较低水平。结论弓形虫感染雄兔精液中虫体含量随感染后时间不同而变化。     

弓形虫感染家兔血液中虫体的动态观察

目的探明虫体在家兔血液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集家兔血液,抗凝处理后,-40℃冻存备用,用实时定量PCR检测弓形虫感染家兔血液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与血液中虫体含量的动态曲线图。结果雄兔弓形虫感染后4d血液中即可检测到虫体DNA,血液中虫体含量为217.887×103个/ml,血液中虫体含量在感染后8 d达到高峰期,血液中虫体含量为248.019×103个/ml,然后虫体含量逐渐下降,在感染后121 d雄兔血液中虫体密度为1.45×103/ml。结论弓形虫感染雄兔血液中虫体含量随感染后时间不同而变化。     

家兔精液传播弓形虫的实验研究

目的 了解弓形虫能否通过精液传播，并探讨雌兔阴道不同健康状态对精液传播弓形虫的影响。 方法 8只健康新西兰雄兔经腹腔分别感染1×10⁵个RH株弓形虫速殖子，分别于感染前、后用假阴道采集雄兔精液，每周将采集到的精液混合液化后0.1 ml/只， 分别经宫腔内人工受精管感染4组阴道健康状态不同的成年新西兰雌兔（阴道正常组、阴道损伤组、滴虫性阴道炎组和霉菌性阴道炎组）， 共采集8周，将所得8份混合精液分别感染8次。每次受精后第2～3天耳缘静脉采血2 ml， 分别用ELISA和PCR检测血清抗弓形虫抗体和全血中弓形虫B1基因片段。 结果 ELISA结果显示，雌兔在初次受精后第16天可检测到抗弓形虫抗体，第1～4组抗体阳性家兔数分别有2、1、3和1只，ELISA阳性率为25.9％（7/27）。PCR检测最早在受精后3 d和最晚51 d可扩增出弓形虫B1基因片段200 bp， 第1～4组阳性家兔数分别有2、1、2和0只，PCR阳性率为18.5%（5/27）。其中两种检测结果均为阳性的3只。 结论 弓形虫可通过精液感染雌兔。雌兔的阴道健康状态对经精液感染弓形虫无影响。     

ELISA双单克隆抗体夹心法检测弓形虫循环抗原的实验研究

用酶联免疫吸附试验(ELISA)双单克隆抗体夹心法,检测人工感染弓形虫家兔血清循环抗原(CAg)的累积阳性频率。在潜伏期内,重、中度感染兔CAg阳性率分别为30.8及11.1％;急性期、亚急性期和慢性早期的阳性率,中度感染兔分别为86.1及76.7％,轻度感染兔分别为43.3及32％。中、轻度感染兔的CAg阳性率在急性期逐步上升,而在亚急性、慢性早期逐步下降。健康兔、血吸虫病及球虫病兔的血清试验,均阴性。本法检测CAg的效果高于其他3种双抗体法,提示有较高的特异性、敏感性和重现性,可诊断弓形虫急性或活动性感染。     

应用PPA-ELISA检测实验家兔弓形虫抗体的研究

本文报告了应用过氧化物酶标记金葡菌A蛋白取代酶标第二抗体,进行酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测弓形虫实验感染家兔的结果。以胰蛋白酶处理纯化后的弓形虫速殖子制成可溶性抗原,对24只感染兔和32只正常兔血清进行检测。结果感染兔全部呈阳性反应,正常兔全部阴性。与爱美尔球虫病兔的     

应用生物素-亲和素系统检测弓形虫感染家兔特异性循环免疫复合物的实验研究

本文应用抗弓形虫单克隆抗体E_8株,亲和素和生物素标记的过氧化物酶复合物(ABC)为标记物的ABC-ELISA检测弓形虫感染家兔的特异性循环免疫复合物(CIC),并与常规ELISA、聚乙二醇沉淀试验(PEG)进行对比。 一、检测弓形虫感染兔(33只)及血吸虫感染兔(25只)血清CIC、ABC-ELISA检测CIC的阳性率为100％,PEG试验为96.9％:健康兔(29只)血清对照试验阴性符合率分别为100％及93.1％,但两法与血     

弓形虫感染兔T淋巴细胞免疫反应的初步观察

近年来,众多的研究者认为,不能确定抗体滴度与抵抗弓形虫能力之间有任何关系,而证明在对弓形虫的免疫作用中,细胞免疫占有重要地位。本文应用淋巴细胞转化试验形态法,测定人工感染弓形虫兔外周血的淋转率,并与检测血清CAg进行同步试验,观察家兔感染弓形虫后不同临床期的细胞免疫反应变化。现将结果报告如下。 材料和方法 一、动物 新西兰纯种雌性兔19只,实验前经IHA及ELISA检测弓形虫抗体均为阴性。取14只为感染组,每兔腹腔接种弓形虫强毒株(CN)速殖子2万个,接种后分期采血。另5只兔为对照组,与感染兔同时采血。     

ABC-ELISA检测粪便华支睾吸虫抗原的初步探讨

本实验用ABC-ELISA双抗体夹心法检测人工感染家兔粪便华支睾吸虫抗原(CsAg)。结果表明,此法能测出CsAg的最低含量为0.045μg/ml PBS,粪便中CsAg含量与感染兔的虫荷呈直线正相关。检测轻、重感染兔粪便各28份,正常兔粪便29份,阳性数分别为7、23和2。3组兔粪便中CsAg含量有显著性差异(P<0.001)。5只感染日本血吸虫家兔粪便CsAg检测均为阴性。     

上海某实验兔繁育场弓形虫感染的调查

<正> 弓形虫是一种世界性分布的人畜共患寄生虫病,人和动物普遍感染,对人畜危害很大。福建、江苏等地曾在家兔中检测出弓形虫的感染,本所在购进的实验兔中也发现有弓形虫的自然感染。最近,我所对定点供应我们实验兔的某实验兔繁育场进行了调查,现报道如下。     

几种实验/探针系统对日本血吸虫循环抗原检出效果的比较观察

目的：比较５种试验／探针系统检测感染兔血清中循环抗原（ＳＣＡ）的效果。方法：用单雄性和单雌性尾蚴分别感染９只家兔,以复性尾蚴感染７只家兔作对照;感染后定期采血。另１５兔分３组感染２５０条尾蚴。１,２组于感染后１９ｄ和４５ｄ分别开始给予丙烯基硫脲（２９５－５９０ｍｇ／ｋｇ）以抑制虫卵形成,第３组作对照;均定期采血。检测方法计５种：１斑点－ＥＬＩＳＡ／抗成虫表膜单抗（８ＳＥ４）,２斑点－ＥＬＩＳＡ／抗ＣＣＡ单抗（３Ｄ１０）,３夹心斑点－ＥＬＩＳＡ／抗虫卵单抗（ＭＧ２）,４夹心法－ＥＬＩＳＡ／抗虫卵单抗（２Ｈ１０）,５夹心法－ＥＬＩＳＡ／抗ＣＡＡ单抗（ＩＢ１０）。结果：９只单雄性尾蚴和９只单雌性尾蚴感染兔血清１法均为阴性,２法仅１只检出雄虫１３３条的家兔出现阳性反应,５法单雌性感染均阴性、单雄性感染３／９兔阳性。服药抑制虫卵形成的兔血清,１９ｄ开始服药５兔１法及３法均未检出ＳＣＡ,４６ｄ开始服药组在感染后６－７ｗｋ二法均检出ＳＣＡ。４法服药与未服药兔均为阴性,５法感染后６ｗｋ的血清服药与未服药兔均呈阳性反应。结论：不同的试验／探针系统的检测效果不同,但所试３种方法（１,２,５种）都不能检出单雌性感染。抑制虫卵形成     

日本血吸虫与二乙基亚硝胺诱发家兔肝癌的初步实验探讨

本文观察了用日本血吸虫与二乙基亚硝胺诱发家兔肝癌的实验结果，Ａ组每只家兔感染日本血吸虫尾蚴，从感染后６２ｄ开始，每周每兔用１％二乙亚硝胺水溶液灌胃１次，剂量为２５ｍｇ／ｋｇ，共１５次，结果５只兔中有３只诱发肝癌，诱时时间分别为２７３，３９４和４７６ｄ，Ｂ组每只家兔用Ａ组同法感染尾蚴及投二乙基亚硝胺，但在感染后５５及８０ｄ，分别灌胃给予吡喹酮作２次病治疗，每次剂量为０．３ｇ／只，７只兔中仅１只发生肝     

碳粒免疫试验(CIA)检测实验家兔弓形体抗体的研究

碳粒免疫试验(Carbon immunoassay——简称CIA)是一种直接的血清学方法。本文首次报道在国内应用CIA法对实验家兔弓形体抗体进行检测。共检测25只实验弓形体感染家兔的血清(55份),24只实验弓形体感染家兔的血滴(53份),两者弓形体抗体阳性率均为100％,无假阴性。血清抗体滴度高者可达1:5120,血滴抗体滴度高者可达1:64;前者几何平均滴度为1527,后者几何平均滴度为11.27。用正常家兔作对照,共检测正常家兔血清39份,正常家兔滤纸干血滴16份,结果均为阴性,未发现假阳性。还应用CIA法检测了10只实验家兔弓形体感染1周的血清和血滴,其弓形体抗体滴度均已能检出,而用酶联金葡菌A蛋白酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA法)检测,10只兔中有1只尚未能检测出,提示前法似较后法敏感。另用同一份阳性和阴性血清分别进行PPA-ELISA法检测,两种方法的阳性符合率为98～100％,阴性符合率为100％。本文认为,CIA法是一种比较简便、经济、快速、灵敏的弓形体抗体检测方法,有推广应用的价值。     

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。     

聚合酶链反应检测弓形虫的实验研究

目的建立敏感、特异、稳定的聚合酶链反应（ＰＣＲ）法,以检测弓形虫感染。方法建立ＰＣＲ法,确定最佳扩增条件;用ＰＣＲ法检测实验感染家兔血液中ＤＮＡ的动态变化,并与ＥＬＩＳＡ法检测ＣＡｇ进行比较。结果兔感染弓形虫后第２ｄ,ＰＣＲ开始出现阳性,阳性率为７６．９％（１０／１３）,总检出率达１００％。与ＥＬＩＳＡ法查ＣＡｇ进行平行检测,前者出现阳性时间早,且阳性率明显高于后者。该法敏感性高,可检测到１０ｆｇＤＮＡ含量;特异性强,对其它９种寄生虫和微生物ＤＮＡ均无交叉现象;稳定性好,对阳、阴性同一样品重复５次,结果一致。结论提示本法可用于临床诊断,在一定范围内替代病原学和免疫学检测。     

感染弓形虫家兔血清循环抗原、免疫复合物及抗体消长规律的实验研究

本文应用酶联免疫吸附试验(ELISA)观察人工感染弓形虫家兔血清循环抗原(CAg)、免疫复合物(CIC)及抗体(CAb)的消长规律。发现在临床病程中,CAg消长情况与文献已证实的弓形虫的增殖消长情况相一致。对弓形虫活动性感染具有最好的诊断价值。感染兔临床各期的不同水平CAg、CIC及CAb构成的综合指标显示不同的免疫学特征,可用于弓形虫病临床分期。本文根据实验结果对血清学试验检测CAg、CIC及CAb的诊断价值及指标作了系统的评价。     

地塞米松诱发家兔弓形虫病的动物模型

目的建立弓形虫感染免疫抑制的动物模型,探讨宿主的免疫力与感染弓形虫的关系.方法将弓形虫抗体（IgM和IgG）阴性的家兔20只随机分4组：正常对照组（A组）、免疫抑制组（B组）、接种虫体组（C组）和免疫抑制接种虫体组（D组）.A组家兔肌注生理盐水,B组肌注地塞米松,C组腹腔注射活的、纯化的弓形虫速殖子,D组除肌注地塞米松外,在注药48 h后腹腔接种活的、纯化的弓形虫速殖子.观察C、D组是否感染成功,比较4组家兔的健康和发病情况,观察弓形虫抗原的分布及致病情况.结果 A组未见异常.B组仅出现食量减少.C组第6天出现体毛疏松,但在整个实验中没有出现死亡现象.D组第4天出现体毛疏松,10 d后出现脱毛、怠惰、厌食、体重下降,腹胀、眼内有分泌物,但停药后症状渐减轻.第2次重复给药后呼吸加快、眼底视乳头轻度充血,1只家兔肢体抽风、瘫痪、昏迷而死亡.结论成功建立弓形虫感染免疫缺损的动物模型.正常家兔感染弓形虫可转为隐性感染.免疫抑制剂对宿主感染弓形虫可起协同作用.     

弓形虫主要表面抗原P30两个不同片段的重组表达、纯化及应用

目的将刚地弓形虫（简称弓形虫）主要表面抗原P30基因两个不同片段重组表达，纯化所获重组蛋白用于弓形虫病免疫学诊断。方法根据弓形虫P30基因的全长序列，用PCR法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，并构建相应克隆进行诱导表达，表达蛋白以western blot鉴定。用Amylase Resin以亲和层析法纯化所表达的蛋白。以弓形虫RH株感染家兔，用粗抗原和纯化重组抗原以ELISA法比较检测各种寄生虫病患者、感染家兔血清及疟原虫感染小鼠血清。结果1．成功构建相应克隆，并成功诱导表达，表达产物经纯化后获得高纯度日的蛋白。2．重组抗原与粗抗原相比。具有相同的敏感性和更高的特异性。结论成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物。以此重组抗原与粗抗原对比检测弓形虫相应抗体，结果证明重组抗原特异性高于粗抗原。