增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展

<正>CpG基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为6个寡聚核苷酸。1995年,Krieg等[1]研究发现非甲基化的CpG二寡聚核苷酸是病原体DNA免疫刺激活性的结构基础,自此,对CpG基序的各种研究得以展开,包括CpG基序免疫刺激机制、CpG基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等。含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸作为一种免疫增强剂,在体内和体外均表现免疫刺激作用,可以引起先天性免疫反应。CpG在体内能引起明显且多样化     

CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展

随着对含有CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的结构、功能以及作用机理的深入研究，CpG ODN已经应用于疾病的治疗和预防等许多方面。本文就CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展做一综述。     

CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展

随着对含有CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的结构、功能以及作用机理的深入研究,CpGODN已经应用于疾病的治疗和预防等许多方面。本文就CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展做一综述     

CpG ODN对ZP~(121-140)表位合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响

目的:探讨CpG ODN对透明带(四)抗原表位ZP~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响.方法:应用人工合成ZP2~(121-140)表位肽,与20μg CpG ODN或等量完全弗氏佐剂(CFA)混悬后左胫前肌免疫雌性BALB/c小鼠,初次免疫后2、4、6周各加强免疫一次,共免疫四次.在每次加强免疫前和末次免疫后两周断尾取血,分离血清,分析特异性lgG抗体及非特异性细胞因子IFN-γ、TNF-Ⅱ,IL-10水平;收集小鼠阴道冲洗液,离心取上清,分析特异性IgA抗体水平.免疫小鼠生育实验结束后,取卵巢组织行病理学分析.结果:CpG ODN组诱导的特异性IgG和IgA水平较CFA组有增高趋势,但无显著性差异(P＞O.05).CpG ODN组诱导的非特异性IFN-γ和TNF-水平明显高于CFA组(P＜0.05);而CpG ODN组诱导的IL-10水平显著低于CFA 组(P＜0.05).两种佐剂对小鼠的受孕率影响没有显著性差异,但CpG ODN组孕鼠每胎产仔数明显低于CFA组(P＜O.05).病理学分析显示实验小鼠卵巢组织无病理性变化.结论:CpG ODN对Zp~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应略优于CFA,更适合用于避孕疫苗佐剂研究.     

CpG ODN佐剂对乙肝疫苗抗原免疫原性的影响

目的探究CpG ODN佐剂对不同抗原含量乙肝疫苗免疫效果的影响。方法在体液免疫方面不同抗原浓度的CpG ODN与Al(OH)3佐剂乙肝疫苗免疫Balb/c小鼠,于免疫后第2、4、6、8、10周收集血清,检测小鼠体内相对效力ED50和血清中的anti-HBs抗体水平;在细胞免疫方面测定诱导产生IFN-γ水平及IgG2a应答水平。结果 CpG ODN与Al(OH)3佐剂可以有效协同HBs Ag诱导机体产生的抗体滴度达49 427 mIU/ml,抗体效价随时间延长而增加。乙肝抗原减半后双佐剂乙肝疫苗诱导机体产生的特异性抗体滴度可达41 225 mIU/ml,高于无CpG ODN佐剂的铝佐剂疫苗。在诱导细胞分泌方面,对照组诱导产生IFN-γ水平及IgG2a应答水平明显低于所有双佐剂疫苗组。结论 CpG ODN对HBsAg具有良好佐剂活性,并与铝佐剂有协同作用,二者联合应用可以降低乙肝抗原用量并提高疫苗免疫原性。     

CpG ODN序列结构特征对免疫活性影响的研究进展

CpG ODN(CpG oligonucleotide,CpG 寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN),可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞.     

CpG ODN的体外免疫活性及其作为乙肝疫苗佐剂的研究新进展

为了增强乙肝疫苗的免疫效力,开发研制新型疫苗佐剂是当前国内外学者研究的热点之一。近年来的研究表明：含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）在体外实验中,对人和鼠的多种免疫细胞有活化作用;在动物实验中,CpG ODN不仅可增强乙肝疫苗的体液免疫应答,还可增强其细胞免疫应答,这正是铝佐剂所达不到的,且CpG ODN与铝佐剂具有协同效应,今后可考虑双佐剂联合乙肝疫苗接种,能提高接种人群的应答率,刺激机体产生更有效的保护作用;动物实验还显示,CpG ODN能增强HBV转基因小鼠对乙肝疫苗的免疫应答和抗病毒效应,说明乙肝疫苗辅以CpG ODN可望作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途径;Ⅰ期临床试验表明CpG ODN对人体较安全。     

细菌DNA对小鼠脾淋巴转化的影响

近年来发现，细菌DNA具有很强的免疫刺激活性，其可通过激活多种免疫细胞活性，加强机体的先天性防御反应与获得性免疫反应。有关研究显示，细菌DNA的这种免疫刺激活性依赖于DNA中某些特定的非甲基化CpG二核苷酸序列。模仿细菌DNA中的天然CpG序列合成含非甲基化CpG的寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides，ODN)也具有强烈的免     

CpG 寡核苷酸链作为新型佐剂的研究进展

 1924 年 Ramon 提出免疫佐剂的概念，80 多年来，虽然进行了深入的研究，人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂。直到最近几年才上市了几种新型的疫苗佐剂，如 MF59（高压条件下将鲨烯与 Tween 80 和 Span 85 混合后进行微流化形成的均一小滴状乳液，应用于美国 Chiron 公司开发的流感亚单位疫苗），重组霍乱毒素 B 亚单位（rCTB，应用于瑞典 SBL Vaccin AB 公司研发的霍乱疫苗 Dukoral），AS04（一种含有单磷脂 A 和皂角苷的油包水乳剂，应用于英国GlaxoSmithKline 公司的乙型肝炎疫苗 Fendrix）等，但应用范围较小。虽然铝胶佐剂应用最为广泛，但它存在不少缺点，已远远不能满足新型疫苗发展的要求。目前，对新型佐剂的研制与开发已成为现今疫苗研究中一个非常重要的领域。与传统佐剂相比，理想的新型佐剂应该具有以下特点：第一，化学结构明确、低相对分子质量、低毒、高效；第二，能以多种途径免疫，尤其是能以极有应用前景的黏膜免疫途径进行免疫；第三，能广泛应用于各类不同抗原，能有效控制免疫反应质量（反应类型的控制、局部免疫以及细胞类型的控制），稳定且生产成本低。 含胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的寡核苷酸链（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN）便是一种非常具有开发潜力的佐剂，这是一类合成的、包含有 1 个或多个非甲基化的 CpG 基序的单链 DNA。此类非甲基化的 CpG 二核苷酸在细菌和病毒基因组中出现的频率远高于在脊椎动物基因组中的出现频率，这种差异使得脊椎动物的免疫系统能够轻易识别入侵的外来细菌和病毒，从而引发一系列的免疫应答机制。研究表明，CpG ODN 能够选择性地促进脊椎动物的细胞和/或体液免疫，有效提升大多数疫苗的免疫效果。本文就 CpG ODN 的分类、免疫机制及其作为佐剂应用的研究进展进行综述。......     

铝佐剂吸附CpG ODN增强重组乙肝疫苗免疫效应

目的探索新佐剂CpG ODN在重组乙肝疫苗中的免疫效应及吸附状态。方法 CpG ODN佐剂与重组乙肝疫苗混合免疫小鼠,收集小鼠血清检测。通过免疫小鼠后的体液和细胞免疫应答水平来评价双佐剂乙肝疫苗对重组乙肝疫苗的增强作用。CpG ODN佐剂与乙肝疫苗在不同温度条件下混合吸附,计算在不同吸附时间下CpG ODN佐剂在乙肝疫苗中的吸附率。结果CpG ODN佐剂可以提高重组乙肝疫苗在体液及细胞中的免疫效果。CpG ODN佐剂在室温条件下1 h即可在乙肝疫苗中达到吸附平衡,于2~8℃放置5 d的条件下其吸附率约在50%左右。结论 CpG ODN能够增加乙肝疫苗的免疫应答,其免疫效果可提高5倍以上。     

CpG ODN核心序列改变对其生物学活性的影响

目的：观察含CpG基序寡核苷酸（CpG ODN）核心序列改变后对其细胞内化和免疫活性的影响。方法：人工合成6-FAM标记的CpG ODN，将其核心序列CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化（mCpG ODN）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）顺序颠倒（GpC ODN），在RAW264.7细胞培养体系中加入不同的ODN后，应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察ODN的细胞内化与定位，ELISA法检测ODN对细胞释放TNF-α的影响。结果：CpG ODN核心序列的改变不影响其在细胞内的聚集，激光共聚焦术检测发现6-FAM ODN被内化进入RAW264.7细胞，绿色荧光小体呈散点状分布于细胞中；胞嘧啶甲基化后，mCpG ODN促细胞释放TNF-α的作用显著降低（P<0.01），仅保留部分刺激活性，但是GpC ODN几乎丧失了促细胞释放TNF-α的作用。结论：CG序列对CpG ODN的生物活性至关重要，胞嘧啶C甲基化不影响CpG ODN在细胞内的定位，但能部分抑制CpG ODN的免疫活性。     

CpG ODN增强乙型肝炎表面抗原免疫小鼠的抗体产生

目的：探讨合成含CpG基序的寡核苷酸（CpG ODN)对重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg)及乙型肝炎疫苗增强小鼠特异性抗体产生的效应。方法：采用非纯系（Km)及纯系（Balb/c)小鼠作为免疫对象，经后腱胫骨前肌免疫2次，ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体（抗－HBs)效价。结果：加CpG ODN组，其抗-HBs效价均较单独注射rHBsAg和疫苗组明显增高，持续时间长，且纯系鼠的抗体效价明显高于非纯系鼠。结论：CpG ODN对小鼠抗－HBs产生具有增强作用，具与疫苗中的铝佐剂有协同效应。     

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

细菌DNA可显著增强豚鼠接种猪链球菌溶血素的免疫效果

目的 :研究大肠杆菌DNA的免疫增强效果。方法 :用提取的大肠杆菌DNA、合成CpG ODN、弗氏佐剂、蜂胶等不同佐剂分别与猪链球菌溶血素配合 ,免疫 10日龄豚鼠 ,用溶血抑制实验、MTT法和细胞流式技术分别检测豚鼠体液免疫和细胞免疫状态。结果 :经组间单因素相关性分析 ,大肠杆菌DNA、合成CpG ODN和弗氏佐剂均能明显地增强豚鼠特异的体液免疫与细胞免疫 ,其中 ,所用大肠杆菌DNA的刺激溶血抑制抗体的活性与合成CpG ODN相当 (P >0 0 5 ) ,脾淋巴细胞刺激活性与弗氏佐剂相当 (P >0 0 5 )。结论 :所提取的大肠杆菌DNA具有强烈的免疫刺激作用 ,可望成为一种新型免疫佐剂     

三类细菌基因组和CpG ODN作为禽流感病毒H5N1亚型灭活油乳苗佐剂的研究

目的：通过两种免疫策略比较三类细菌基因组和CpG ODN对禽流感病毒（AIV）H5N1灭活油乳苗的影响。方法：苯酚氯仿法抽提革兰氏阴性致病菌（大肠杆菌O2）、阳性致病菌（金黄色葡萄球菌）和阳性益生菌（粪链球菌FQ68）的基因组,并人工合成CpG ODN作为AIV油乳苗的佐剂,分佐剂与油苗分开和油裹于油苗内两种途径免疫鸡群,检测血凝（HI）抗体效价、HA抗原特异性IgG效价、IL-10和IFN-γ浓度。结果：当佐剂与油苗分开免疫时,各佐剂在所有的时间点上削弱（P〉0.05）或者显著地削弱（P〈0.05）HI和血清IgG效价,稍稍提高IL-10和IFN-γ浓度（P〉0.05）;当佐剂油裹于油苗里时,CpG ODN和FQ68基因组在所有的时间点上提高（P〉0.05）或者显著地提高（P〈0.05）HI和IgG效价以及IFN-γ浓度,其中CpG ODN好于FQ68基因组,但是都降低了IL-10浓度。结论：当CpG ODN或FQ68基因组油裹在AIV油乳苗里时能提高体液、Th1型免疫水平;当佐剂和油苗分开免疫时,则免疫佐剂性不佳。     

不同佐剂及免疫途径对重组NTHi外膜蛋白P6免疫效果影响的研究

目的 研究几种佐剂及免疫途径对重组NTHi P6蛋白抗原在小鼠体内产生的免疫效果的影响.方法 以A1(OH),佐剂、CpG ODN佐剂以及两种联合的复合佐剂分别与rP6蛋白混合,经滴鼻、肌肉注射免疫途径免疫6周龄雌性BALB/c小鼠;相同剂量、免疫途径加强免疫2次.采用ELISA法检测rP6蛋白特异的血清IgG和黏膜IgA滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化.结果 3次免疫后,CpG ODN+rP6滴鼻免疫组和A1(OH)3+CpG ODN+rP6肌肉注射免疫组产生高滴度的特异性血清IgG抗体(F=41.259,P=0.000).同时ELISPOT试验显示,CpG ODN+rP6无论通过滴鼻还是肌肉注射免疫均能诱导大量抗原特异性T淋巴细胞的活化,与其他实验组比较差异有统计学意义(F=66.046,P=0.000).而且CpG ODN+rP6滴鼻免疫组能诱发高滴度的特异性黏膜IgA抗体(F=70.966,P=0.000).结论 重组NTHi外膜蛋白P6与CpG ODN佐剂联合后经黏膜途径免疫,小但能保证体液免疫的高滴度血清IgG抗体,而且能从黏膜免疫和细胞免疫两方面对该蛋白的免疫效果进行增强.

Abstract：

Objective To detect the difference of cytokines and antibodies productions by immunologic system from mice vaccinated with recombinant P6 protein with different immunization routes and adiuvants.Methods 6 weeks female BALB/c mice were vaccinated with meombinant protein P6 combined with A1(OH)3,CpG ODN or the mix of them through intramuscular and intranasal.The mice were boosted twice with the same dose by the same route.Serum and respiratory tract specimen were collected to detect rP6 specific antibodies by ELISA.Results In the 6th week after immunization.The higher titer of serum rP6 specific IgG antibody were detected from the two groups vaccinated with A1(OH)3+CpG ODN+rP6 by intramuscular and vaccinated with CpG ODN+rP6 by intranasal(F=41.259.P=0.000).The ELISPOT experiment showed that,Inoculation with the CpG ODN+rP6 either by intranasal or intramuscular immunization could induce a large number of antigen-specific T lymphocyte activation.In addition.The mice vaccinated with the CpG ODN+rP6 through intranasal can be detected high titer rP6 specific mucosal IgA antibody(F=70.966.P=0.000).Conclusion Inoculation with the CoG ODN+rP6 by jntranasal immunization not only can induce high-titer serum IgG antibody,but also can induce high-titer mucosal IsA antibody and CD4+Th1.CD8+T lymphoeyte activation.     

三种类型CpG-ODN作为蛋白亚单位疫苗佐剂的比较研究

目的 比较A、B和C3种类型CpG-ODN在动物模型中的疫苗佐剂活性,为设计高活性的新型人用疫苗佐剂提供理论基础.方法 用不同CpG-ODN刺激体外培养的小鼠脾细胞,检测上清中的IFN-γ和IgM,从而确定3种类型的CpG-ODN.以基因工程乙肝表面抗原(HBsAg)为模型抗原、不同类型CpG-ODN为佐剂免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测被免动物血清中抗原特异性ISG、IgG1和IgG2a抗体.结果 小鼠免疫结果表明,与Al(OH),对照组相比,3种类型CpG-ODN均具有良好的疫苗佐剂活性,但B和C型CpG-ODN诱生的抗原特异性IgG和IgG2a抗体水平远高于A型CpG-ODN.虽然A型CpG-ODN也能够显著增强总抗体水平,但并不改变IgG1和IgG2a抗体亚型的比值.这与B和C型CpG-ODN能够极大地促进TH1类免疫应答并降低IgG1/IgG2a比值明显不同,提示不同类型CpG-ODN可能通过不同机制起到疫苗佐剂作用.结论 不同类型CpG-ODN具有不同疫苗佐剂活性,B和c型CpG.ODN在小鼠体内的体液免疫佐剂效果优于A型CpG.ODN.     

疫苗:肿瘤特异性杀伤(T淋巴)细胞CTLs的有益助手

人体自然免疫系统通过被类浆细胞化树突状细胞 (pD Cs)和B细胞选择性表达的Toll样受体 9(TLR9)来识别在细菌或病毒DNA中的被称为CpG基序的序列 ,并引起适应性免疫应答的发生 ,这些基序因此被研究作为潜在的新的疫苗佐剂。Hartmann及其同事首次注意到CpGDNA能增强人体免疫系统中CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的应答。他们比较了两种不同类型的合成的CpG反义寡聚脱氧核苷酸 (ODN)—CpG A(D型CpGODN)和CpG B(K型CpGODN)的佐剂作用 ,这两型ODN在其侧翼序列上具有差别 ,因此以两种不同多肽来支持CD8+ T细胞的免疫应答。当…     

CpG DNA中ISS数量与免疫刺激效果间的关系初探

研究CpG免疫刺激DNA中免疫刺激序列（ISS）的数量与免疫刺激效果间的关系。方法：将3种CpGODN（分别含2,4,8个ISS）与甲型肝炎灭活疫苗混合,通过腹腔注射途径免疫小鼠,于免疫后4,6,8w采血,用全自动微粒子酶联免疫测定分析检测抗HAVIgG水平.结果：含2个ISS的CpG ODN具有较好的佐剂效应,能增强甲型肝炎灭活疫苗的免疫效果,含4个ISS的CpG ODN不具有免疫刺激作用,而含8个ISS的CpG ODN则抑制了甲型肝炎灭活疫苗所诱导的免疫反应,结论：适当长度的CpG ODN（含2个ISS）可作为有效的佐剂来增强疫苗的免疫效果,而当其中的ISS含量过多,则反而具有免疫抑制作用。     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后，从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞，体外经HBsAg抗原刺激后，利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平，再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率，分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低，当HBsAg加强免疫1～2次后，IFN-γ表达仍然没有明显升高；而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后，CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答，提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。