CRP促进THP-1来源的巨噬细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1的表达

目的探讨C反应蛋白(CRP)对单核细胞株(THP-1)来源的巨噬细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)蛋白和mRNA的表达及相关信号转导通路的影响。方法用佛波醇脂诱导THP-1分化为巨噬细胞。用不同浓度CRP在体外干预,分别采用RT-PCR和细胞酶联免疫测定干预后巨噬细胞LOX-1抗原蛋白和mRNA的表达。同时观察当NF-κB、AP-1和MARK信号通路抑制剂存在时,CRP对LOX-1抗原和mRNA表达的影响。结果CRP促进巨噬细胞LOX-1蛋白和mRNA表达增加。NF-κB的抑制剂BAY11-7085能抑制CRP对LOX-1蛋白和mRNA表达的诱导作用。结论CRP能在转录及转录后水平诱导THP-1来源的巨噬细胞表达LOX-1,这种调节作用可能是通过NF-κB信号传导通路实现的。     

同型半胱氨酸对人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA及其蛋白表达的影响

目的:探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA的表达和IL-8分泌的影响。方法:在由0.1 μmol/L佛波脂(PMA)诱导分化的人THP-1巨噬细胞中加入不同浓度的Hcy,并孵育不同时间。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中IL-8蛋白的含量,用半定量RT-PCR法检测IL-8 mRNA表达。结果:经PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,分化成巨噬细胞。在一定浓度范围之内,Hcy呈剂量依赖性刺激THP-1巨噬细胞分泌IL-8蛋白,0.05 mmol/L Hcy即可促进其分泌增加为对照组的1.28倍(P<0.01);0.20 mmol/L Hcy使IL-8的产量增加到对照组的1.55倍(P<0.01)。0.10 mmol／L Hcy干预后,IL-8蛋白在3 h即高于对照组,到48 h仍明显高于对照组。半定量RT-PCR结果也显示Hcy能刺激IL-8 mRNA表达,呈剂量和时间依赖关系。结论:Hcy能促进人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA表达和分泌IL-8蛋白。这可能为其诱导动脉粥样硬化的重要机制之一。     

阿托伐他汀抑制THP-1经PMA诱导后变成巨噬细胞ATP结合盒转运子A1 mRNA和蛋白的表达

目的探讨阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞ATP结合盒转运子A1(ABCA1)mRNA和蛋白及LXRαmRNA表达的影响。方法体外培养的人THP-1单核细胞,经氟波酯(PMA)诱导48 h,使形成巨噬细胞,将分化良好的巨噬细胞分别加入含不同浓度或不含阿托伐他汀的无血清RPMI 1640培养基,培养24 h或48 h,收集细胞。用多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法检测THP-1巨噬细胞ABCA1 mRNA和蛋白及LXRαmRNA的表达。结果含阿托伐他汀(10μmol/L)的培养基体外培养人THP-1巨噬细胞24 h,ABCA1(相对表达量IA值1.21,对照组1.48)和LXRαmRNA(A值0.87,对照组1.12)表达比对照组明显减少(P<0.05),延长培养时间,ABCA1和LXRαmRNA表达有进一步减少趋势。结论阿托伐他汀抑制体外培养的人THP-1巨噬细胞ABCA1 mRNA和蛋白及LXRαmRNA的表达。     

佛波酯诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞的条件优化

目的优化诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞所需的佛波酯(PMA)浓度和刺激时间。为研究生物活性材料对巨噬细胞表型和功能的调控作用奠定实验基础。方法分析不同PMA浓度与刺激时间下THP-1细胞的形态、贴壁程度、 M0型巨噬细胞表面标志物以及巨噬细胞M1和M2表型相关基因的表达。结果在25～100 ng/mL PMA浓度范围和24～72 h刺激时间范围内,当PMA浓度为75 ng/mL,刺激时间为72 h时,既能有效诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞,又能对THP-1细胞中M1型巨噬细胞标志基因IL-6、 IL-1β、 CD86和M2型巨噬细胞标志基因IL-10、 CD163、 CD206产生相对较低的上调作用。结论优化的诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞所需的PMA浓度和刺激时间为75 ng/mL和72 h。     

全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞增殖及α-SMA表达的影响

目的: 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚肺成纤维细胞(HFL-I)增殖与分化的影响。方法: 体外培养HFL-I, MTT法检测不同浓度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d对HFL-I增殖能力的影响。5 μg/L 转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA表达,刺激0 d、1 d、3 d、5 d后,Western blotting法检测α-SMA蛋白表达。不同浓度ATRA干预,24 h后RT-PCR方法检测α-SMA mRNA表达,3 d后用Western blotting方法检测α-SMA蛋白表达。结果: (1) MTT法检测显示不同浓度ATRA以浓度依赖性方式抑制HFL-I细胞的增殖(P<0.05)。(2)5 μg/L TGF-β₁诱导后,HFL-I细胞中α-SMA mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。(3) ATRA以浓度依赖性方式下调TGF-β₁诱导的α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论: ATRA能够抑制HFL-I细胞的增殖和TGF-β₁诱导的分化,该作用可能是通过下调α-SMA mRNA和蛋白的表达实现的。     

分化诱导剂PMA对THP-1源性巨噬细胞膜表面受体MD-2表达的影响

目的探索豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)对诱导分化后THP-1细胞膜表面受体髓样分化蛋白-2(MD-2)表达和分布的影响及其与炎症因子TNF-α、IL-6分泌的关系。方法采用PMA梯度剂量(0、1、5、10、50、100 ng/ml)诱导THP-1细胞48 h后观察贴壁细胞形态并计算贴壁率;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测贴壁细胞膜表面受体MD-2、CD14 mRNA相对表达量,ELISA检测细胞培养上清中分泌性MD-2(sMD-2)、TNF-α和IL-6的分泌水平;进一步通过Western blot检测贴壁细胞的MD-2蛋白表达、激光扫描共聚焦显微镜观察MD-2在贴壁细胞的分布和定位。结果梯度PMA剂量(1~100 ng/ml)48 h成功诱导悬浮THP-1细胞贴壁;激光扫描共聚焦显微镜观察显示PMA诱导后MD-2主要表达于胞膜和胞浆,诱导质量浓度增加对MD-2的表达和分布均无显著影响;RT-qPCR检测THP-1细胞经PMA梯度剂量(1~100 ng/ml)诱导后MD-2和CD14 mRNA相对表达量较诱导前均显著升高(P<0.01),诱导剂量组之间无显著差异(P>0.05);ELISA检测THP-1细胞经PMA梯度剂量(1~100 ng/ml)诱导后,细胞培养上清中的TNF-α、IL-6分泌水平依次显著增加(P<0.01),sMD-2仅诱导前后有明显统计学差异(P<0.01);Western blot检测显示梯度剂量PMA诱导后细胞内MD-2蛋白表达较诱导前显著增加,诱导剂量组之间无显著差异。结论 1~100 ng/ml PMA均可将THP-1细胞诱导分化为成熟巨噬细胞,增加诱导质量浓度可显著提高炎症因子TNF-α、IL-6的分泌水平,但对其膜表面受体MD-2表达和分布无明显影响。     

高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响

目的：探讨高糖对单核/巨噬细胞系THP-1细胞及人主动脉平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4(TRAIL-R4)表达的影响。方法：用PMA孵育THP-1细胞，诱导其分化成为巨噬细胞。流式细胞仪检测成功诱导的巨噬细胞粘附分子CD11b及CD11c。采用不同糖浓度干预THP-1细胞，用Western blotting技术检测TRAIL-R4的表达。用25 mmol/L 高糖培养液在不同时点孵育人主动脉平滑肌细胞，观察TRAIL-R4蛋白表达的变化。用PKC激动剂干预THP-1细胞后，用Western blotting技术检测TRAIL-R4的表达。结果：佛波酯(PMA)孵育THP-1细胞48 h可诱导其分化成为巨噬细胞。20 mmol/L 高糖明显上调人THP-1细胞TRAIL-R4的表达。高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL-R4表达上调的影响随着刺激时间的增加而增加。PKC激活后THP-1细胞TRAIL-R4的表达明显上调。结论：高糖上调TRAIL-R4蛋白表达，TRAIL-R4通过抑制巨噬细胞及平滑肌细胞的凋亡促进动脉粥样硬化。     

Effects of ADMA on the expression of acyl-coenzyme A:Acylcholesterol transferase-l ( ACAT-I ) in cell differentiation from mononuclear/macrophage cells to foam cells

目的 观察不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)表达的影响.方法 1)THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育48 h后,再与80 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育24h,用油红O染色在光镜下鉴定细胞形态及变化.2)将THP-1单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用20 μmol/L ADMA干预24h,酶法测泡沫细胞内胆固醇酯的含量,RT-PCR方法检测ACAT-1mRNA表达,Western blot方法检测其蛋白表达.结果 1)ADMA可显著增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量.2)与THP-1单核细胞相比,巨噬细胞(P＜0.05)、泡沫细胞(P＜0.01)中ACAT-I mRNA及蛋白表达增加;而与巨噬细胞相比,泡沫细胞中ACAT-I mRNA及蛋白表达增加但无显著性差异.3)与各自的对照组相比,经ADMA作用后3种细胞中ACAT-I mRNA及蛋白表达水平均增加(P＜0.01).结论 ADMA增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ACAT-1的mRNA及蛋白表达来实现的.     

不对称二甲基精氨酸对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1表达的影响

 [摘要] 目的 观察不对称二甲基精氨酸（ADMA）对单核/巨噬细胞分化为泡沫细胞过程中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1（ACAT-1）表达的影响。 方法 （1）THP-1单核细胞与160nmol/L佛波酯（PMA）孵育48h后,再与80mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育24h,用油红O染色在光镜下鉴定细胞形态及变化。（2） 将THP-1单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用20μmol/L ADMA干预24h,酶法测泡沫细胞内胆固醇酯的含量,RT-PCR方法检测ACAT-1mRNA表达,Western blot方法检测其蛋白表达。 结果 （1）ADMA可显著增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量。（2）与THP-1单核细胞相比,巨噬细胞（p<0.05）、泡沫细胞（p<0.01）中ACAT-1mRNA及蛋白表达增加;而与巨噬细胞相比,泡沫细胞中ACAT-1mRNA及蛋白表达增加但无显著性差异。（3）与各自的对照组相比,经ADMA作用后3种细胞中ACAT-1mRNA及蛋白表达水平均增加（p<0.01）。结论 ADMA增加泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ACAT-1的mRNA及蛋白表达来实现的。     

CPSIT_p7通过激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症

目的初步探讨鹦鹉热嗜衣原体蛋白CPSIT_p7对宿主细胞炎症反应的调节作用及其分子机制。方法佛波酯(PMA)处理THP-1细胞过夜,诱导其分化为贴壁的巨噬细胞,之后用CPSIT_p7蛋白刺激贴壁细胞,或先用30μmol/L ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB202190分别预处理贴壁细胞,再用CPSIT_p7蛋白处理贴壁细胞;Western blot检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,ELISA检测各种炎症因子的表达水平。结果 0~10μg/ml CPSIT_p7蛋白刺激PMA诱导的THP-1细胞24 h后,随着CPSIT_p7质量浓度升高,IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的含量呈剂量依赖性增加;10μg/ml的CPSIT_p7处理细胞0、6、12、24和36 h,在24 h时IL-6、IL-8及IL-1β表达水平达到高峰,而TNF-α在12 h就达到高峰;CPSIT_p7蛋白处理细胞后其ERK和JNK磷酸化水平显著升高,p38磷酸化水平改变不明显;JNK和ERK抑制剂能明显降低CPSIT_p7蛋白诱导的IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α表达。结论 CPSIT_p7通过JNK/MAPKs和ERK/MAPKs信号传导途径诱导THP-1产生IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α炎症因子,与p38/MAPKs信号传导通路无关。     

NF-κB信号通路介导AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9

目的： 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人单核/巨噬细胞（THP-1细胞）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的机制。方法: 用0.1 μmol/L佛波酯（PMA）作用48 h,诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）PMA组,即对照组;（2）PMA+AngⅡ组（10-7mol/L,1 h）;（3）PMA+AngⅡ+2-硫代氨基甲酸吡咯烷组［PDTC（10 μmol/L,30 min）］;（4）PDTC组。用Western blotting蛋白印记技术分别检测总蛋白MMP-9及磷酸化核转录因子-κB p65（NF-κB p65）的变化,用RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达的变化。结果: 与对照组相比,AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞磷酸化NF-κB p65增加（1.02±0.10,P<0.05）,MMP-9蛋白量也增加（1.06 ±0.11,P<0.05）,MMP-9 mRNA表达上调（1.22±0.08,P<0.05）,而使用NF-κB的抑制剂PDTC后磷酸化NF-κB p65（0.99±0.12,P<0.01）减少,MMP-9表达明显受到抑制（1.04±0.14, P<0.01）,MMP-9 mRNA表达下调（0.90±0.06, P<0.01）。结论: NF-κB信号转导途径是AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9的重要途径之一。     

胰岛素对THP-1细胞脂蛋白脂酶 mRNA表达及细胞泡沫化的影响

目的 观察胰岛素在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致人髓系白血病单核细胞株THP-1细胞泡沫化过程中的作用,并探讨其机理.方法 用不同浓度胰岛素及ox-LDL与THP-1细胞一起共同孵育,观察THP-1细胞脂蛋白脂酶(LPL) mRNA RT-PCR产物、非特异性脂酶染色THP-1细胞所得脂酶阳性细胞数、细胞大小变化、油红O染色所得含脂滴细胞数、细胞内胆固醇含量.结果 100 mU/L以上浓度胰岛素各组THP-1细胞LPL mRNA表达与ox-LDL对照组比较上调2倍;细胞周长、脂滴阳性细胞百分率及细胞内胆固醇含量均明显高于ox-LDL对照组(P＜0.05).结论 高浓度胰岛素在ox-LDL存在条件下有促进THP-1细胞向泡沫细胞转化的作用,其机理可能与细胞LPL mRNA表达上调有关.     

血管紧张素Ⅱ对人单核细胞源树突状细胞免疫功能的影响*

 目的： 探讨血管紧张素II（Ang II）对人单核细胞源树突状细胞（DCs）免疫成熟进程及摄取氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）功能的影响。方法: 采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100 μg/L重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和50 μg/L重组人IL-4（rhIL-4）的RPMI-1640培养液培养,诱导分化为未成熟DCs。经不同浓度的Ang II干预24 h,另用10 μmol/L血管紧张素II受体1拮抗剂洛沙坦预处理后再加入Ang II干预,采用流式细胞术检测细胞免疫表型（CD83和HLA-DR）,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞培养上清液中细胞因子（IL-12和IFN-γ）的浓度;通过加入10 mg/L的荧光DiI标记的Ox-LDL,用流式细胞仪检测DiI-Ox-LDL的摄取分数;采用real-time PCR法检测清道夫受体A（SR-A）、CD36和凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1） mRNA的表达。结果: (1) Ang II干预可上调DCs表面成熟标志物CD83和HLA-DR的表达,且分泌细胞因子IL-12和IFN-γ水平升高,10 μmol/L洛沙坦预处理可明显抑制Ang II诱导的DCs成熟。(2) Ang II干预可促进DCs对DiI-Ox-LDL的摄取,洛沙坦预处理可部分抑制DCs对DiI-Ox-LDL的摄取。(3)Ang II干预可上调LOX-1 mRNA的表达,但对SR-A和CD36的表达无明显影响,洛沙坦预处理可明显抑制LOX-1mRNA的表达,但SR-A和CD36的表达无明显变化。结论: Ang II可促进DCs的免疫成熟,并且可能通过上调LOX-1的表达,促进DCs对Ox-LDL的摄取,这可能是Ang II促动脉粥样硬化的新机制。     

Angiotensin (1–7) ameliorates angiotensin II-induced inflammation by inhibiting LOX-1 expression

Objective and design

Endothelial dysfunction plays an important role in all stages of atherosclerosis and is characterized by an increased proinflammatory response. This study investigated the effect of angiotensin (1–7) on angiotensin II (Ang II)-mediated inflammation in endothelial cells (ECs) and uncovered its molecular mechanism.

Methods and results

Real-time PCR and western blot analysis were used to determine lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) expression. Ang II treatment induced inflammation, as measured by the production of vascular cell adhesion molecule-1 and monocyte chemoattractant protein-1, by activating nuclear factor-κB (NF-κB) in ECs. Ang II also induced LOX-1 expression in human ECs and rabbit aortic ECs. LOX-1 played an essential role in Ang II-mediated inflammation because Ang II antagonists or small interference RNA significantly decreased Ang II-induced VCAM-1 production. LOX-1 overexpression enhanced Ang II-mediated inflammation. LOX-1 mediated Ang II-induced inflammation by inducing NF-κB DNA-binding activity. Angiotensin (1–7) inhibited LOX-1 expression and diminished Ang II-mediated inflammation in ECs.

Conclusions

Our findings suggest that angiotensin (1–7) prevents Ang II-induced inflammation by inhibiting LOX-1 mRNA and protein expression in ECs and may represent a novel pleiotropic effect of angiotensin (1–7).     

可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨可溶性Klotho(KL)蛋白对THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯孵育48 h后,诱导分化为THP-1源性巨噬细胞,给予THP-1源性巨噬细胞不同浓度(25、50、100和200μg/L)的可溶性KL蛋白预处理后,再由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其转变为泡沫细胞。油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,通过液体闪烁计数法测定THP-1源性泡沫细胞内胆固醇流出情况,酶荧光法检测细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的含量,并分别用Western blot法及RT-qPCR法检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)和ATP结合盒转运体A1(ABCA1)的蛋白及mRNA表达。结果:可溶性KL蛋白能增加THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出,抑制THP-1源性泡沫细胞形成,且可溶性KL蛋白呈一定浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中ACAT1表达的上调和ABCA1表达的下调(P<0.05)。结论:可溶性KL蛋白能够抑制THP-1源性泡沫细胞形成,其机制可能与靶向调控细胞内ACAT1和ABCA1的表达有关。     

地塞米松对PMA诱导CD18表达的抑制作用

目的:研究GC抑制CD18表达的作用。方法:选用PMA刺激下的U937细胞为实验模型,运用定量RT-PCR、Northern杂交检测U937细胞CD18 mRNA的表达水平。结果:Dex能明显抑制PMA诱导CD18 mRNA的表达,这种抑制作用具有明显的剂量依赖性,GR的拮抗剂RU38486能够明显扭转Dex的抑制作用。结论:Dex通过GR介导能在转录水平上抑制PMA诱导的CD18 mRNA的表达,该作用可能与糖皮质激素受体(GR)在转录水平拮抗NF-κB有关。     

LOX-1介导ox-LDL诱导的血管内皮细胞MCP-1的表达

目的：观察血凝素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）对氧化LDL（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞(human unbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）基因及蛋白的影响。 方法： 用RT-PCR和Western blot的方法观察ox-LDL对培养的HUVECs表达LOX-1和MCP-1基因及蛋白的影响，然后用LOX-1的受体阻滞剂爱兰苔胶（carrageenan） 和聚肌苷酸［polyinosinic acid，poly(I)］与HUVECs预先作用后，再观察内皮细胞表达LOX-1和MCP-1基因和蛋白的变化。 结果： 用不同浓度的ox-LDL（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 、50 mg/L、100 mg/L）与HUVECs培养24 h后，LOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显增加，呈浓度依赖性；用Carrageenan 和polyinosinic acid与HUVECs预先作用2 h后，再加入50 mg/L的ox-LDL培养24 h，与未加Carrageenan和polyinosinic acid相比，HUVECsLOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显减少。 结论： ox-LDL可以调节培养的HUVECsLOX-1和MCP-1基因和蛋白的表达，LOX-1作为ox-LDL的特异性受体，可能介导了ox-LDL诱导血管内皮细胞分泌MCP-1，从而在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。