氧化型低密度脂蛋白通过Akt/mTOR/p70S6K通路诱导血管内皮细胞自噬

目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)自噬和Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法 将培养的HUVECs分为oxLDL组和对照组,分别用100 μg/ml oxLDL和等体积磷酸盐缓冲液处理.在培养6 h和12 h后收集细胞.应用透射电子显微镜观察自噬小体,实时荧光定量聚合酶链反应检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62 mRNA表达,应用蛋白质印迹法检测LC3、p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K蛋白表达.结果 与对照组相比,oxLDL处理组细胞内的自噬小体数量明显增多(P<0.05),LC3 mRNA及蛋白表达水平均显著增高(P均<0.05),而p62 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05).此外,oxLDL处理组Akt、mTOR、p70S6K磷酸化蛋白表达水平均较对照组显著降低(P均<0.01),但Akt、mTOR和p70S6K总蛋白表达水平与对照组无显著差异.结论 oxLDL可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs自噬.     

抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制

目的 探讨抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬中的影响。方法 分离培养纯种新西兰兔腹腔原代巨噬细胞并分为4组,加入磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002（10 μmol/L）组、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂雷帕霉素（10 nmol/L）组、蛋白激酶B（Akt）抑制剂曲西立滨组（20 μmol/L）以及空白对照组。共培养4 h、12 h后分别收集细胞,运用透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）分子的表达,Western blot检测 Akt、mTOR、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）及自噬相关蛋白Beclin-1和自噬蛋白Atg5-Atg12连接体的表达,单丹酰尸胺（MDC）染色法观察自噬溶酶体的变化。结果 与空白对照组相比,透射电镜下LY294002组自噬体、自噬空泡、髓磷脂图像等自噬标记物明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多;激光共聚焦显微镜下LY294002组LC3Ⅱ表达显著减少,雷帕霉素组、曲西立滨组表达显著增多;Western blot结果显示LY294002组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平显著下降,p-mTOR、p-Akt蛋白表达显著减少;雷帕霉素组、曲西立滨组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平明显上调,共培养4 h后p-Akt表达增多,雷帕霉素组p-mTOR表达增多,曲西立滨组减少;共培养12 h后雷帕霉素组、曲西立滨组p-mTOR表达显著减少,雷帕霉素组p-Akt表达显著增多,曲西立滨组显著减少;MDC染色显示LY294002组自噬溶酶体明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多。结论 抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进兔原代巨噬细胞自体吞噬,抑制PI3K能减少兔原代巨噬细胞自体吞噬,可能是不同类型的PI3K分子通过其他通路起作用。     

高糖通过调控FBW7表达影响自噬的研究

目的探索高糖调控FBW7表达对自噬的影响。方法不同浓度(10、20和30 mmol/L)葡萄糖刺激小鼠肾小球系膜细胞后,采用Western blot检测泛素连接酶FBW7、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表达水平,以及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值,采用RT-PCR进一步检测FBW7的mRNA水平;采用自噬双标腺病毒检测自噬溶酶体。采用基因过表达技术过表达FBW7并检测相关蛋白水平及自噬水平。结果葡萄糖浓度越高,FBW7、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和自噬溶酶体水平越低,mTOR、p-mTOR的表达水平越高。基因过表达FBW7可抑制mTOR和p-mTOR(Ser2448)蛋白表达,增加LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及自噬溶酶体数量(P0.05)。结论高糖下调FBW7表达激活mTOR信号通路,引起小鼠肾系膜细胞自噬水平的降低。     

丙型肝炎病毒核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬的机制。方法HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与肝星状细胞(LX-2细胞)共培养。共培养后高效液相色谱-质谱联用技术检测2-AG水平,分光光度法测定检测线粒体呼吸链酶复合体活性,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,激光共聚焦显微镜检测Ca~(2+)浓度和线粒体膜电位,试剂盒检测线粒体丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,蛋白质免疫检测大麻素受体1(CB1R)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62蛋白表达。计量资料采用t检验。结果与LX-2细胞和HepG2细胞共培养组相比,LX-2细胞和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组,2-AG水平增加,线粒体呼吸链酶复合体活性下降,ROS水平和Ca~(2+)浓度升高,线粒体膜电位下降,MDA升高而SOD下降,CB1R水平升高,p-Akt和p-mTOR表达下降,LC3-Ⅱ表达增加,而p62蛋白表达无明显差异。结论 HCV核心蛋白增加2-AG水平,上调CB1R表达;增加线粒体ROS水平和Ca~(2+)浓度,降低线粒体膜电位;下调Akt和mTOR活性引起不完全线粒体自噬。     

姜黄素激活自噬对非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体途径凋亡的影响

目的探讨姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。方法油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布,透射电镜观察肝组织中自噬泡形成情况。蛋白印迹检测P62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白(Beclin-1)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、相关x蛋白(Bax)、线粒体内细胞色素C(mCytc)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3、Caspase-9)标记蛋白的表达水平。结果与正常对照组比较,肝组织脂质沉积在模型组中明显增加;姜黄素明显抑制模型组大鼠肝组织脂质沉积,自噬抑制剂削弱姜黄素的治疗作用;透射电镜观察发现正常对照组可见散在自噬泡,模型组自噬泡数量显著减少,姜黄素可明显增加自噬体数量。蛋白印迹结果提示,模型组大鼠肝组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9、P62蛋白表达均升高,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低;经姜黄素治疗后肝组织中Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高;自噬抑制剂可以部分抑制姜黄素对自噬和凋亡相关蛋白的影响。结论姜黄素对NAFLD大鼠模型的抗凋亡作用与诱导自噬有关。     

褪黑素减轻同型半胱氨酸诱导的冠状动脉内皮细胞损伤及机制探讨

目的研究褪黑素(MT)减轻同型半胱氨酸(Hcy)诱导冠状动脉内皮细胞损伤的作用,并探讨其机制是否与激活蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路有关。方法培养人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)并分组,对照组用不含药物的DMEM处理,Hcy组用含有1 mmol/L Hcy的DMEM处理,MT组用含有1 mmol/L Hcy及500μmol/L MT的DMEM处理,MT+LY组用含有1 mmol/L Hcy、500μmol/L MT及10μmol/L LY294002(Akt抑制剂)的DMEM处理。检测细胞活力、细胞凋亡、细胞周期及p-Akt、p-mTOR的含量。结果 Hcy组的细胞活力、S期及G2/M期比例、细胞中Bcl-2、CyclinD1、p-Akt、p-mTOR的含量低于对照组,细胞凋亡率、G0/G1期比例、细胞中Bax、cleaved Caspase-3的含量高于对照组;MT组的细胞活力、S期及G2/M期比例、细胞中Bcl-2、CyclinD1、p-Akt、p-mTOR的含量高于Hcy组,细胞凋亡率、G0/G1期比例、细胞中Bax、cleaved Caspase-3的含量低于Hcy组;MT+LY组的细胞活力、S期及G2/M期比例、细胞中Bcl-2、CyclinD1、p-Akt、p-mTOR的含量低于MT组,细胞凋亡率、G0/G1期比例、细胞中Bax、cleaved Caspase-3的含量高于MT组。结论 MT能够减轻Hcy诱导的HCAEC损伤,调控Akt/mTOR通路是MT减轻HCAEC损伤的相关机制之一。     

体外心脏震波治疗通过PI3K/Akt信号传导通路对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究体外心脏震波治疗(ESWT)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:体外培养的人脐静脉内皮细胞分成3组,即对照组、ESWT组和ESWT+LY294002组。CCK8比色法检测细胞增殖情况,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹方法(Westen blot)检测Bax、Bcl-2、p-Akt和Akt蛋白的表达水平。结果:ESWT能明显提高HUVECs的增殖能力(P0.001),抑制凋亡率(P0.001),减少HUVECs内Bax蛋白表达水平,增加Bcl-2和p-Akt蛋白表达水平(均P0.01),但这些作用可被PI3K特异性抑制剂LY294002削弱。结论:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝/苏氨酸激酶(Akt)及其下游信号通路介导了ESWT促进HUVECs增殖及抑制凋亡作用。     

心复力颗粒诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用的实验研究

目的探讨中药复方心复力颗粒(XG)诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡的作用机制。方法将H9C2心肌细胞随机分为正常组、缺氧无血清组、XG(100～800μg/mL)组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(5μmol/L)、XG(400μg/mL)+3-MA(5 mmol/L)组,在缺氧无血清培养条件下处理24 h后,Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬小体形成,Western blotting方法检测凋亡和自噬蛋白表达水平。结果 Western blotting结果显示,缺氧无血清条件明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,促进凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达。心复力颗粒处理后,可显著抑制细胞凋亡,Bcl-2表达上调,Bax和Caspase-3的表达下调,且呈浓度依赖性,在XG 400组作用最显著,与正常组比较,缺氧无血清组自噬小体明显减少,而在心复力颗粒各处理组中,随着药物浓度增加,自噬小体数量明显增加,在XG 400组最明显。同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈剂量依赖性增加,并在XG 400组表达水平达到峰值。用自噬特异性抑制剂3-MA处理细胞后,与缺氧无血清组比较,细胞凋亡明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少,而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达呈上升趋势。结论缺氧无血清培养条件可以引起明显的细胞凋亡和抑制细胞自噬;心复力颗粒干预后显著减少细胞凋亡同时诱导自噬发生,并呈现一定的浓度依赖性;心复力颗粒通过诱导细胞自噬下调细胞凋亡水平。心复力颗粒通过诱导缺氧无血清条件下的H9C2心肌细胞自噬,从而发挥抗凋亡作用,保护缺血心肌。     

YB-1抑制三氧化二砷诱导的胃癌细胞自噬机制

目的研究YB-1抑制三氧化二砷(As2O3)诱导人胃癌BGC-823细胞自噬的机制。方法采用脂质体转染siRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAd1Easy/YB-1过表达YB-1;实时荧光定量PCR检测Bcl-2和Beclin1基因转录;Western blot检测YB-1、Bcl-2、Beclin1、P62和LC3Ⅱ蛋白的表达;MDC染色、荧光显微镜观察自噬泡。结果与空病毒(AdGFP)组相比,pAd1Easy/YB-1(AdYB-1)组Bcl-2基因表达增高,而干扰质粒(siYB-1)组Bcl-2基因表达水平较空质粒(HK)组降低(P均<0.05),各组Beclin1基因表达比较无统计学差异。与AdGFP和HK组相比,AdYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白减少,Bcl-2和P62蛋白增加(P均<0.01),siYB-1组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白增加,Bcl-2和P62蛋白减少(P均<0.01)。与AdGFP组相比,AdYB-1组自噬泡聚集减少,加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集,Beclin1蛋白恢复表达,P62降解增加,LC3Ⅱ升高。结论 YB-1可能通过上调Bcl-2、抑制Bec-lin1,实现对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制。     

川芎嗪抗β淀粉样蛋白25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用的机制

目的探讨川芎嗪是否作用PI3K/Akt通路抗β淀粉样蛋白(Aβ)25~35诱导的细胞凋亡。方法 Aβ25~35作用SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型,MTT法检测细胞的生存率,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达。结果川芎嗪能够抑制Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡和促进其存活;川芎嗪可抑制Aβ25~35引起的p-Akt/Akt、Bcl-2表达降低和Bax、caspase-3的表达增加。PI3K/Akt通路抑制剂LY294002能够抑制川芎嗪对Aβ25~35诱导的细胞凋亡的保护作用,抑制川芎嗪诱导的p-Akt/Akt、Bcl-2表达上调及Bax、caspase-3表达下调。结论川芎嗪拮抗Aβ25~35诱导的细胞凋亡与作用PI3K/Akt通路,调节Bcl-2、Bax、caspase-3的表达有关。     

DPC4基因通过mTOR信号通路诱导胰腺癌细胞自噬

目的验证过表达DPC4基因对胰腺癌细胞增殖侵袭的抑制作用,探讨mTOR信号通路对其激活自噬的调控作用。方法构建DPC4过表达载体,转染胰腺癌JF305细胞,CCK-8、Transwell检测其对胰腺癌JF305细胞的增殖侵袭能力,透射电镜观察自噬小体,Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1的表达。结果过表达DPC4可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭;激活自噬,电镜下DPC4过表达细胞中自噬颗粒明显增多;自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ在过表达DPC4的JF305细胞中表达升高,同时下调p-mTOR和p-4EBP1的表达水平。结论 DPC4基因可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,其作用机制与抑制mTOR信号通路、激活自噬相关。     

自噬下降参与了β1肾上腺素受体自身抗体诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的 探讨自噬下降对β₁肾上腺素受体自身抗体(β₁adrenergic receptor autoantibodies, β₁-AA)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的作用。方法 使用1 μM的β₁-AA对H9c2心肌细胞进行处理,Real time-PCR检测自噬相关基因LC3 mRNA表达的改变,Western blot检测LC3、Beclin 1以及P62蛋白表达水平的变化;使用流式细胞术、Caspase-3活性检测以及Hoechst 33258染色反映细胞凋亡情况;使用经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)预处理30 min以及mTOR通路抑制剂雷帕霉素(rapamyein,RAPA)预处理1 h后,再给予细胞β₁-AA处理,检测此时细胞凋亡的变化情况。结果 1 μM的β₁-AA干预H9c2心肌细胞6 h可以明显降低细胞存活率;β₁-AA干预细胞6 h、12 h、24 h,LC3 mRNA水平依次降低,LC3II和Beclin 1蛋白水平依次降低,P62蛋白水平逐渐增加,表明β₁-AA可以引起心肌细胞自噬水平逐渐下降;同时发现,β₁-AA干预细胞6 h、12 h,细胞凋亡水平明显升高;使用经典自噬抑制剂3-MA预处理心肌细胞30 min抑制自噬后,H9c2心肌细胞凋亡水平较β₁-AA单独处理组显著增加,相反使用经典mTOR通路抑制剂RAPA预处理心肌细胞1 h上调自噬后,心肌细胞凋亡水平较β₁-AA单独处理组明显下降,说明自噬水平改变可以影响心肌细胞凋亡水平。 结论 自噬下调能够增加β₁-AA诱导的H9c2心肌细胞凋亡。     

铜绿假单胞菌注射液对肺癌A549细胞自噬及PI3 K/Akt通路的影响

目的探究铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA)对肺癌A549细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的影响。方法体外培养人肺癌A549细胞,随机分为空白对照组、LY294002组(加入20μmol/L LY294002),PA-MSHA干预组(加入0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL、2.0×10^9/mL PA-MSHA)。干预培养48 h后,MTT法检测各组细胞活性,平板克隆形成实验检测各组细胞增殖能力,透射电子显微镜观察各组细胞自噬情况,Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及PI3K/Akt通路相关蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表达。结果与空白对照组相比,LY294002组、0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL、2.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05),自噬体个数增加,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05);与LY294002组相比,0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.05),自噬体个数减少,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著升高(P<0.05);与0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL PA-MSHA组相比,2.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05),自噬体个数增加,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论PA-MSHA可能通过调控PI3K/Akt信号通路,促进肺癌A549细胞自噬,抑制细胞增殖。     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

辛伐他汀对哮喘小鼠细胞自噬和炎症的影响及其机制的实验研究

目的观察不同剂量辛伐他汀对哮喘小鼠自噬和炎症的影响及机制。方法32只小鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、低剂量辛伐他汀组(C组40 mg/Kg)、高剂量辛伐他汀组(D组60 mg/Kg),每组8只。B、C、D三组采用卵清蛋白+氢氧化铝造模,C、D组同时给予辛伐他汀40 mg/kg、60 mg/kg灌胃。采用H.E染色观察肺组织,Western blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、mTOR、p-mTOR,RT-PCR法检测Atg5和Beclin1 mRNA。结果A组支气管未见炎症细胞浸润,管腔规则、黏膜上皮正常;B组可见大量炎症细胞浸润,管壁增厚,气道黏膜增生;C、D组上述表现较B组减轻,且D组改善更明显。与A组比较,B组LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1mRNA增加,p-mTOR/mTOR降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C、D两组LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA增加,p-mTOR/mTOR降低,D组上述指标变化更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论哮喘小鼠自噬水平增加,p-mTOR/mTOR信号通路蛋白降低;辛伐他汀可能通过阻断mTOR信号通路进一步提高LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1mRNA水平,从而缓解气道炎症。     

四跨膜蛋白8对糖尿病肾小管上皮细胞自噬活性的实验研究

目的探讨四跨膜蛋白8(Tspan 8)对糖尿病肾小管上皮细胞自噬活性的影响及机制。方法将HK-2细胞分为正常组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖)和高糖组(HG,30mmol/L D-葡萄糖)。高糖培养的HK-2细胞分别转染Tspan 8基因的随机无靶点阴性对照(shCtrl)和特异性基因敲减序列(siRNA)。Western blot和qPCR检测Tspan 8表达;Western blot检测蛋白激酶B(Akt)及其磷酸化水平(p-Akt),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其磷酸化水平(Ⅱ/Ⅰ)。结果高糖刺激后,Tspan 8表达升高约1.5倍(P0.01);与shCtrl组比较,Tspan 8siRNA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高3倍,p-Akt表达降低约1.5倍,p-mTOR表达降低约2倍(P0.01)。结论 Tspan8可能通过激活mTOR信号通路,负向调节糖尿病肾小管上皮细胞的自噬活性。     

siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病自噬及凋亡的影响

目的探讨siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型自噬及凋亡的影响。方法体外0.6 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质沉积建立NAFLD细胞模型,将HepG2细胞分为对照组、模型组、eIF2α-siRNA干扰组、NC-siRNA干扰组。油红O观察各组细胞内脂滴分布。采用Real-time PCR检测各组细胞eIF2αmRNA表达情况。LC3质粒标记绿色荧光蛋白(GFP-LC3)转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察细胞内绿色点状聚集的自噬小体分布,Honchst 33258染色观察细胞凋亡情况。Western blotting检测自噬、凋亡相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-eIF2α、eIF2α的表达。结果 Real-time PCR及Western blotting实验表明,与对照组相比,模型组eIF2α蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组eIF2α蛋白及mRNA表达明显下降。与对照组相比,模型组p-eIF2α表达增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组p-eIF2α表达明显下降。荧光显微镜观察提示,与对照组相比,模型组自噬体数量明显降低;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组自噬体数量明显增加。Hoechst 33258染色分析提示,与对照组相比,模型组凋亡率明显增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组凋亡率明显减少。Western blotting检测提示,与对照组相比,模型组细胞Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低(P均0.05),经过eIF2α-siRNA干扰后,eIF2α-siRNA干扰Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均降低,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加。结论 siRNA靶向抑制eIF2α基因通过增强自噬及抑制细胞凋亡改善NAFLD,细胞模型脂肪变性。     

远志皂苷元对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察远志皂苷元(TEN)对阿尔茨海默病体外模型β-淀粉样蛋白1-42(Aβ_1-42)诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响。方法:体外培养PC12细胞,并随机分为对照组(正常生长PC12细胞)、模型组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤)以及TEN低、中、高剂量组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤+TEN低、中、高剂量)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白和自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果:与对照组比较,模型组细胞活力明显下降(P<0.01),p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01),Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,TEN各剂量组神经元存活率升高,p-...     

糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用

目的观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。方法雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组。采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型。雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃。于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P 0. 05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。     

顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞凋亡与自噬的影响

目的 探讨顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞凋亡与自噬的影响.方法 体外培养人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,给予不同浓度的顺铂(CDDP),通过MTT检测细胞增殖率;Western印迹检测CDDP对Tca8113细胞凋亡以及自噬相关蛋白表达水平的影响.结果 与对照组相比,CDDP可以明显降低Tca8113细胞增殖率(P＜0.05);Western印迹结果显示,CDDP可以明显增加凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP以及Cytochrome C的表达水平;同时,自噬相关蛋白LC3,Beclin 1和p62表达水平也发生明显的自噬性改变.结论 CDDP可以明显抑制Tca8113细胞增殖,其增殖抑制作用可能来源于凋亡,同时CDDP可以诱导Tca8113细胞发生自噬.