含CXCL12基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含小鼠CXCL12基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达。方法:利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-CXCL12-EGFP;酶切、PCR鉴定;利用293细胞包装pAdeno-CXCL12-EGFP,荧光倒置显微镜观察EGFP的表达。结果:成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-CXCL12-EGFP,转染pAdeno-CXCL12-EGFP的293细胞内可见EGFP表达。结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的CXCL12和EGFP基因的腺病毒载体。     

构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体及其转染对星形胶质细胞增殖的影响

目的：构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体并进行鉴定，研究其转染星形胶质细胞后对细胞生长增殖的影响。方法：对实验室原有的pGFAP-IRES2-EGFP-p27质粒进行转化、扩增、抽提、酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序；通过设计引物，进行PCR扩增后分别获取GFAP启动子和p27基因片段，依次交换入线性化表达载体GV269和p DC315-GFAP-EGFP载体，最终构建pDC315-GFAP-p27-EGFP；将其转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，经在HEK293细胞反复扩增数代后，进行纯化及滴度检测；转染星形胶质细胞后观察细胞生长和荧光表达情况；检测转染后星形胶质细胞细胞周期和凋亡比例、p27的表达情况。结果：经酶切鉴定和测序，成功鉴定真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27；经PCR鉴定和测序，成功构建重组腺病毒过表达载体pDC315-GFAP-p27-EGFP；经包装后，Ad-GFAP-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应，而且能够特异性地在星形胶质细胞中表达绿色荧光蛋白；经流式细胞仪分析，转染星形胶质细胞72 h后，与对照组相比，...     

YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒的制备

目的制备YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒,在293T细胞中验证基因表达情况。方法将YWHAZ基因分别克隆至腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV-IRES-GFP及逆转录病毒质粒pLXSN-IRES-GFP,并用酶切鉴定、PCR及测序验证后分别转染至HEK 293T及Ampho293细胞,构建重组腺病毒及逆转录病毒。重组病毒分别感染293T细胞,观察荧光验证病毒侵染效果,RT-PCR检测YWHAZ基因表达情况。结果 PCR、酶切鉴定及测序分析,重组腺病毒及逆转录病毒构建正确,感染293T细胞后可使其高效过表达YWHAZ mRNA。结论成功构建了YWHAZ基因重组腺病毒载体及逆转录病毒载体,为体内外进一步研究YWHAZ基因及其相关信号通路在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

目的:构建含神经生长因子(NGF)基因的重组慢病毒载体,并在293T细胞中验证NGF是否可以过表达。方法:将NGF基因克隆至慢病毒穿梭质粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP,然后利用酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证后,同两个辅助质粒共转染到293T细胞中,构建重组慢病毒载体。重组慢病毒感染293T细胞,通过荧光检测慢病毒的转染效果,用Western Blot检测NGF基因的表达。结果:酶切鉴定、PCR扩增鉴定和对重组慢病毒进行测序,提示重组慢病毒构建正确。荧光显微镜观察重组慢病毒感染的293T细胞,可见强荧光。Western Blot结果提示目的基因可正常表达。RT-PCR测得病毒滴度达到可利用标准。结论:人NGF重组慢病毒载体构建成功。     

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

人Nanog基因重组腺病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

摘要:目的：构建重组人Nanog基因腺病毒载体(Ad-Nanog),转染人脐带间充质干细胞（hucMSCs）,用于后续研究。 方法：设计含有KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点的引物,PCR扩增Nanog基因,将扩增产物亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,经双酶切和基因测序鉴定,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组,筛选获得Ad-Nanog重组腺病毒质粒。经PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,包装和扩增病毒,并感染hucMSCs。 结果：重组腺病毒质粒经PCR和双酶切鉴定正确,测序结果和设计片段的序列一致。荧光显微镜下观察在感染的hucMSCs中绿色荧光蛋白高效表达。 结论：成功构建了Nanog腺病毒表达载体,能高效转染hucMSCs,可用于后续转基因的研究。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。