小鼠RPS20基因miRNA干扰对CT26细胞生长的影响

目的构建4对小鼠RPS20(ribosomal protein S20,RPS20)miRNA质粒载体,采用RNA干扰的方法干扰CT26细胞RPS20基因,观察干扰后对CT26细胞RPS20 mRNA、蛋白表达及细胞增殖的影响。方法采用荧光定量PCR及Western-Blot检测干扰后RPS20 mRNA及蛋白的表达,采用MTT法和3-H胸腺嘧啶核苷(3-HTdR)法检测干扰后细胞增殖能力的改变。结果 RNA干扰RPS20基因后,CT26细胞RPS20 mRNA表达水平下降,蛋白表达水平降低,肿瘤细胞生长受到一定程度的抑制。结论 CT26细胞RPS20基因的部分缺失,依然可以抑制细胞的正常生长,进一步提示了RPS20在生命活动中的重要作用。     

小鼠RPS20基因miRNA干扰载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠RPS20 miRNA干扰载体,进行载体质粒的提取及鉴定,以进行细胞转染实验。方法 针对小鼠RPS20基因miRNA序列,设计合成阴性对照及4对目标基因oligo,采用载体构建试剂盒进行重组克隆,经过退火、连接及转化后,进行测序及质粒提取鉴定。结果 测序结果提示序列构建完全正确,电泳结果提示质粒大小正确,纯度较高。结论 成功构建了针对于小鼠RPS20基因的miRNA干扰载体,测序及电泳结果提示,所构建序列可用于后续转染实验。     

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。     

RNA干扰抑制脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达的实验研究

目的:靶向白细胞介素6受体(sIL-6R)基因构建具有高干扰效率的RNA干扰载体,观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。方法:靶向sIL-6R基因设计3条短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,转染脊髓源星形胶质细胞,筛选出对sIL-6R基因干扰效率最高的sIL-6R siRNA,用免疫组化染色、RT-PCR及Western blot技术观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。结果:成功构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,免疫组化染色、RT-PCR及Western blot检测结果证实sIL-6R siRNA能显著下调sIL-6R的表达。结论:sIL-6Rs iRNA重组质粒真核表达载体对脊髓损伤后sIL-6R表达有明显的抑制作用,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤修复中的应用奠定了前期基础。     

t-PA基因慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的表达研究

目的:构建t-PA基因慢病毒表达载体并转染脐血来源的内皮祖细胞,评估其转染后功能变化情况。方法:RT-PCR获得t-PA cDNA,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,构建pc DNA3.1(+)/t-PA质粒。对其进行酶切鉴定和测序,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒,制备包装病毒质粒转染内皮祖细胞。倒置荧光显微镜下观察转染24h后内皮祖细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测转染后t-PA基因的表达水平。采用Brdu标记细胞DNA、BCA蛋白定量、MTT分析法检测内皮祖细胞DNA合成能力、总蛋白含量和细胞存活率。结果:成功构建了含有t-PA基因cDNA序列的慢病毒表达载体p Lenti6.3-t-PA,DNA测序结果完全正确,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,内皮祖细胞转染重组慢病毒后t-PA表达水平比未转染组显著增高(P0.01)。t-PA慢病毒表达载体转染内皮祖细胞后,内皮祖细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组无明显变化。结论:成功构建t-PA基因慢病毒表达系统,转染内皮祖细胞后对其DNA合成、总蛋白合成、细胞存活率无明显影响。     

CRISPR敲减猪CMAH基因的质粒构建及慢病毒的包装

目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装。方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与Lenti CRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等质粒用于包装慢病毒。结果:成功构建猪CMAH基因CRISPR-Cas9敲减质粒并包装出相应慢病毒。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够构建敲减猪CMAH基因的质粒并能够使用其包装出病毒,为后续感染猪动脉内皮细胞(porcine aorta endothelial cell,PAEC)细胞敲减CMAH基因及功能验证奠定基础。     

RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响

目的 采用RNA干扰技术（RNAi）抑制X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）,观察抑制前后人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为.方法 DNA重组技术合成针对人脑胶质瘤U251细胞XIAP基因三条siRNA（siRNA1,siRNA2,siRNA3）,以脂质体2000作为载体进行转染,RT-PCR法检测XIAP的mRNA表达,选择特异性较高的siRNA,以此 siRNA为标准建立20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L3个浓度梯度,转染细胞,Western blot 检测XIAP基因的蛋白表达,选出最低有效浓度;流式细胞仪检测抑制前后细胞周期和凋亡率.结果 siRNA成功转染了人脑胶质瘤细胞U251,转染率达到80%以上;RT-PCR检测siRNA2特异性较高;Western-blot检测终浓度为30 nmol/L的siRNA抑制效率较高;流式细胞仪检测停滞在G0/G1期的细胞增多,在S期的细胞减少,并且细胞的凋亡率增加.结论 通过RNA干扰可以抑制人脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达,促进人脑胶质瘤细胞凋亡,从而抑制细胞的生长.     

抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞MHCC-97H迁移的影响及相关机制

目的探讨通过RNA干扰抑制泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因表达对肝癌MHCC-97H细胞迁移的影响及可能机制。方法合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-sh UHRF1(以空载体慢病毒LV-sh NC作为阴性对照),并将其感染MHCC-97H细胞。实时荧光定量PCR法检测UHRF1 mRNA在MHCC-97H细胞中表达情况,蛋白质印迹法检测UHRF1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,Transwell法检测MHCC-97H细胞迁移能力。结果 LV-sh UHRF1组UHRF1mRNA和蛋白表达量及MMP-9、VEGF蛋白表达量均明显低于LV-sh NC组(P均<0.05),迁移细胞数明显少于LV-sh NC组(P<0.05)。结论通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的迁移能力,机制可能与影响MMP-9和VEGF的表达有关。     

HIF-1α基因沉默联合丹参酮ⅡA抑制低氧人肝癌HepG2细胞增殖及其机制

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因沉默联合丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)对低氧条件下人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法依据人HIF-1α基因信息筛选RNAi有效靶序列,设计慢病毒载体引物并构建质粒,包装慢病毒表达载体,转染HepG2细胞,沉默低氧条件下HepG2细胞株中HIF-1α基因表达。将细胞分为正常对照组(野生型HepG2细胞)、干扰对照组(HepG2细胞转染NC-shRNA)、干扰组(HepG2细胞转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl_2)加入培养液模拟肿瘤细胞低氧微环境,采用Western Blot检测各组细胞HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,采用CCK-8检测5 mg/L TanⅡA处理对低氧条件下各组细胞增殖活性的影响,采用Western Blot检测TanⅡA处理对各组细胞内p53和p21~( CIP1/WAF1)蛋白表达的影响。结果 (1)HIF-1α-shRNA慢病毒载体包装成功且转染效率高,低氧培养各组细胞24 h后,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞中HIF-1α蛋白表达明显降低(P0.01)。(2)TanⅡA能时间依赖性抑制低氧条件下各组细胞增殖,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞增殖明显活性下降(P0.01,P0.05)。(3)低氧培养各组细胞24 h,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞中p53和p21~( CIP1/WAF1)蛋白表达水平明显增高(P0.05)。结论 HIF-1α基因沉默可增强TanⅡA对低氧HepG2细胞的增殖抑制作用,其机制可能与p53和p21~( CIP1/WAF1)蛋白水平上调有关。     

补肾活血中药龙鳖制剂干预野生型TDP43介导的骨性关节炎软骨细胞病变的作用研究

目的:分析补肾活血中药龙鳖对TDP-43引起骨性关节炎应急反应的软骨细胞病变的干预作用。方法:通过构建TDP43慢病毒载体并转染人软骨细胞,流式细胞检测分析凋亡水平,连续细胞计数分析其细胞增殖水平,荧光定量PCR检测关键基因表达水平;采用软骨细胞培养液中加入低、中、高剂量龙鳖进行干预,分析TDP43慢病毒转染软骨细胞后的凋亡和增殖生长水平。结果:人软骨细胞转染包装好的TDP43慢病毒后,高表达TDP43基因和I型胶原蛋白α1。TDP43慢病毒转染的软骨细胞体外连续培养软骨细胞7 d后,软骨细胞出现晚期凋亡和死亡现象而抑制了细胞增殖。龙鳖加入培养后软骨细胞呈生长趋势,TDP43慢病毒转染的软骨细胞凋亡显著下降而显著提高了其增殖水平。结论:转染TDP43慢病毒软骨细胞表达TDP43引起了细胞凋亡和抑制其增殖,TDP43可能在骨性关节炎发病过程中取到负调控的作用,而中药龙鳖制剂可显著改善这一过程。     

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??OBJECTIVE To construct the SERCA gene interference lentivirus expression vector and establish stable transfected PC 12 cell line. METHODS The interference sequence targeting at rat SERCA gene was designed and synthesized. pGag/Pol, pRev, and pVSV-G were co-transfected into 293T cells. The lentivirus particles were packaged and generated. The virus titer was detected. PC 12 cells were transfected for establishing the stable cell line; RT-PCR and Western blot were used to detect SERCA gene and protein expression in stable PC 12 cells,and the RESULTS were compared with those in the control group. RESULTS The lentivirus expression vector targeted at SERCA was successfully constructed and the virus titer was 3??10⁸ U??mL^-1. Stable transfected PC 12 cells line was established. The effective interference verification revealed that shSERCA could significantly reduce the mRNA and protein levels of SERCA (P<0.01). CONCLUSION The shRNA lentiviral expression vector of SERCA gene is successfully constructed and the PC 12 cell line stably interfering with SERCA expresion is established.     

基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用

目的构建以肺部苦味受体TAS2R14为靶点的高通量筛选细胞模型,为寻找高效、低毒的新型抗哮喘天然药物奠定基础。方法利用同源重组技术将TAS2R14受体基因插入p LVX-basic质粒,构建p LVX-Ac GFP1-N1-TAS2R14重组载体,并将其转染入HEK293T细胞,建立特异性高表达TAS2R14受体基因的细胞株。利用该细胞模型对120种苦味中药提取物和单体化合物进行高通量筛选。结果建立的模型Z′因子为0.69和0.66,筛选发现陈皮提取物及其药效物质柠檬苦素,白果提取物及其药效物质芦丁、奎宁对TAS2R14受体具有显著的激动作用。结论建立的TAS2R14受体激动剂高通量筛选模型稳定性好、灵敏度高,筛选得到的3种中药单体具有潜在的TAS2R14受体激动活性。     

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??OBJECTIVE To clone target gene by RT-PCR method, construct VEGF₁₆₅ lentivirus vectors, transfect adipose tissue derived stem cells (ADSCs) and verify the expression of VEGF₁₆₅ in vitro and in vivo. METHODS RT-PCR technology was employed to clone VEGF₁₆₅ gene, and this gene was cloned to lentivirus vector pLVX-EF1??-IRES2-AcGFP1 to construct a lentiviral vector pLVX-EF1??-VEGF₁₆₅-IRES2-AcGFP1. Bacterial colonies PCR and sequencing analysis were used for identification. Then, Lenti-X 293T cells were transfected with main vector pLVX-EF1??-VEGF₁₆₅-IRES2-AcGFP1, packaging plasmid gag-pro, vpr-pol, Tet-Off^TM, tat-IRES-rev and coating plasmid env(VSV-G). Lentiviral vectors were packaged and the titer was determined. ADSCs were isolated by collagenase digestion method, then cultured, and identificated by morphology, immunofluorescence and multi-directional differentiation. ADSCs was transfected with packaged VEGF₁₆₅ lentivirus. Immunofluorescence and ELISA were used to detect the expression of VEGF₁₆₅ in vitro. ADSCs transfected with VEGF₁₆₅ lentivirus were injected into nude mice. ELISA was used to detect the expression of VEGF₁₆₅. RESULTS The VEGF₁₆₅ gene fragment was cloned successfully, and the lentiviral vector plasmid pLVX-EF1??-HVEGF₁₆₅-IRES2-AcGFP1 was confirmed to contain VEGF₁₆₅ gene fragment as shown by bacterial colonies PCR. DNA sequencing analysis confirmed that VEGF₁₆₅ gene sequencing was exactly the same with that reported by Genbank. After transfection, a large number of Lenti-X 293T cells with green fluorescence were observed by fluorescent microscopy. The concentration of the virus titer was 1??10⁸ TU??mL^-1. ADSCs were identified by morphology, immunofluorescence and multi-directional differentiation methods, in line with the literature reported ADSCs characteristics. There were about 90% of ADSCs which could express VEGF₁₆₅ after being transfected with the viruses by immunofluorescence detection, also, VEGF₁₆₅ protein was proved by ELISA to express stably and efficiently in vitro and in vivo. CONCLUSION Lentiviral vectors expressing VEGF₁₆₅ are successfully constructed by cloning target gene with RT-PCR method. After transfection, ADSCs expressing VEGF165 protein stably in vitro and in vivo can be obtained.
     

人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达

目的：构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞中并检测其表达。方法：RT-PCR检测Bmi．1mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-468细胞中的表达水平;从MCF-7细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增Bmi-1基因序列,将含有Bmi-1全长编码序列的PCR产物经TA克隆后经PCR、酶切验证,亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-Bmi-1,转化至大肠杆菌后,酶切、测序鉴定;将重组质粒转染到MDA-MB-468中,48h后RT-PCR检测转染前后Bmi-1mRNA及hTERTmRNA的表达变化。结果：Bmi-1mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达。成功从MCF-7细胞中克隆获得Bmi-1基因并构建真核表达载体。转染后在MDA-MB-468中检测到Bmi-1mRNA表达上调,其过表达上调hTERTmRNA的表达。结论：成功克隆和建立人Bmi-1基因真核表达载体;pcDNA3．1（＋）-Bmi-1能在MDA-MB-468中表达;为进一步研究Bmi-1基因在细胞中的功能奠定了基础。     

靶向VEGF—hTERT基因siRNA表达载体抑骨肉瘤生长的实验研究

目的：观察靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法：构RNA干扰腺病毒载体rA-hTERT和rAd-VEGF,单独和联合转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和VEGF基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后使用siRNA表达载体治疗,观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果：①转染后48h,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约84%,对VEGF基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-VEGF对VEGF基因mRNA的抑制率约82%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-hTERT-VEGF干扰组对hTERT基因表达抑制率约87%,VEGF基因表达抑制率约83%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT-VEGF基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05）。②干扰组转染后l～6d均能促进细胞凋亡,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05）。裸鼠实验中,基因组肿瘤的生长均受到明显抑制,且联合干扰组与单基因组比较有显著性差异（P〈0.05）。对骨肉瘤的肺转移联合干扰组有显著的抑制作用。结论：靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长及转移均有明显的抑制作用。     

原代皮质神经元的转染及RNA干扰

目的：探讨成功转染原代神经元的方法,为有效利用RNA干扰技术（RNAi）技术研究、治疗中枢神经系统疾病奠定基础。方法：取新生sD鼠皮质神经元,采用Amaxa Nucleofector？技术将外源GFP表达质粒PEGFP—C1vector转染进原代皮质神经元,在荧光显微镜下观察转染效率;同时还将干扰GFP的siRNA转染进原代皮质神经元,通过观察GFP荧光的变化,来探讨原代神经元内的RNAi现象。结果：在Amaxa Nucleofector？转染技术和转染体系下,PEGFP—C1 vector可有效进入原代皮质神经元并进行表达,当共转染特异性siRNA时可呈现出明显的基因干扰现象。在此过程中神经元没有明显的神经毒性反应。结论：Amaxa Nucleofector技术是一种有效转染原代皮质神经元的方法。该方法解决了以往传统转染方法不能有效转染原代神经元的难题,从而为进一步利用原代神经元研究中枢神经系统疾病提供了良好的技术支持。     

虎杖查耳酮合酶基因RNAi载体的构建及其遗传转化

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度574 bp保守序列片段通过正、反2个方向插入表达载体p YLRNAi中,构建RNAi表达载体p YLRNAi-Pc CHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株,利用Northern blotting检测Pc CHS1基因表达水平,并应用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果成功构建Pc CHS1基因RNA干涉表达载体,获得了5株转Pc CHS1基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖Pc CHS1基因表达水平显著下调,并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到显著提高,其中最高量是对照植株的3.8倍(P0.05)。结论成功获得了干涉Pc CHS1基因表达下调的转化植株,抑制Pc CHS1基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量,为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。     

pCMV-tag2B-CD258质粒的构建和初步表达鉴定

目的构建肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员CD258的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的CD258全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B中,构建CD258的重组表达载体pCMV-tag2B-CD258,经DNA测序证明CD258的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染人前列腺癌IA8细胞系,诱导其表达,G418筛选阳性克隆,用Western Blot进行鉴定。结果pCMV-tag2B-CD258经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的CD258基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-CD258导入IA8细胞并成功表达,目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论重组质粒pCMV-tag2B-CD258能表达具有生物学活性的CD258蛋白,为研究CD258在前列腺癌中的功能打下了基础。     

黄芩素下调微小RNA-130a抑制肝癌细胞侵袭机制研究

目的:探讨黄芩素通过下调微小RNA-130a(miR-130a)抑制肝癌细胞侵袭的机制。方法:以肝癌细胞HepG2为研究对象,应用慢病毒转染法上调HepG2细胞miR-130a表达并设为miR-130a组,转染空载慢病毒作为空载对照组,以未转染细胞作为空白组。采用实时荧光定量PCR检测miR-130a表达水平; 黄芩素处理miR-130a组细胞; 侵袭小室实验考察细胞的侵袭能力; 蛋白印迹实验检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)表达水平。结果:与空载对照组相比,miR-130a组细胞miR-130a表达明显上调,细胞侵袭率升高,MMP-9蛋白表达上调,Calpastatin蛋白表达下降,差异有统计学意义(均P<0.05)。与miR-130a组相比,黄芩素加miR-130a组的miR-130a、MMP-9蛋白表达均降低,Calpastatin蛋白表达升高,细胞侵袭率显著降低,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论:miR-130a通过CANP-MMP-9信号通路促进HepG2细胞侵袭,黄芩素能抑制miR-130a诱导的CANP-MMP-9通路激活,抑制HepG2细胞侵袭。