+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库的构建

目的：应用抑制性消减杂交技术构建 Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库，为筛选 Gz暴露大鼠脑差异表达基因，探讨 Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础。方法：Wister大鼠随机分成对照组和 Gz重复暴露组，对照组大鼠G值为 1Gz，实验组大鼠在动物离心机上经历了3次 10Gz/min（两次间间隔30min）作用，于暴露后6h处死取脑。分别从 Gz重复暴露组和对照组大鼠脑中提取poly(A) RNA，依次合成单链及双链cDNA，用RsaI酶切成大小不等的片段。将 Gz重复暴露组cDNA分为两组，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与T/A载体连接构建 Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库。结果：成功构建具有高消减效率的 Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库，非特异性cDNA片段被有效地消减，特异表达的cDNA得到富集。结论： Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库的建立为进一步筛选、克隆 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术研究甘草甜素免疫调节靶基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建甘草甜素刺激的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库，筛选并克隆甘草甜素免疫调节靶基因，阐明甘草甜素免疫调节的分子生物学机制。方法以甘草甜素刺激Jurkat细胞，同时以生理盐水刺激的相同细胞作为对照；24h后提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交分析并构建cDNA消减文库，随机挑选文库克隆，PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到28个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的22个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得11种已知蛋白基因编码序列。主要包括IL-12、IL-18、胸腺素等免疫调节基因。结论应用SSH技术成功构建了甘草甜素处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

+Gz重复暴露大鼠脑应激基因表达谱的cDNA微阵列研究

目的 用cDNA微阵列技术研究 Gz重复暴露大鼠脑应激基因表达谱,探讨 Gz引起脑损伤的分子机制。方法 Wistar大鼠随机分成对照组和 Gz重复处理组,对照组大鼠G值为 1 Gz．实验组大鼠在动物离心机上经历了3次 10 Gz／1 min(两次间隔30min)作用,于暴露后6h处死大鼠取脑。分别从 Gz处理组和对照组大鼠脑中提取总RNA,用α-^32P dATP逆转录标记作为探针。将合成的2种cDNA探针分别与具有207个濡激基因的cDNA微阵列杂交,灰度扫描后分析两者表达谱差异。结果 有15个应激基因在 Gz处理组表达升高。结论 Gz重复暴露可引起脑组织中多个基因表达变化,这些基因的表达变化是脑损伤在基因水平上的表现,而cDAN微阵列是一种筛选差异表达基因的快速有效方法。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达cDNA文库的构建和初步鉴定

目的 构建氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达基因的cDNA文库。方法 采用HD-3型多功能氡室对雄性BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照实验动物吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。取骨髓细胞提取总RNA,采用SMART和抑制性消减杂交技术,构建正、反向消减cDNA文库,消减cDNA片段插入pMD18-T载体转化大肠杆菌,以含差异表达cDNA片段的菌液为模板进行巢式PCR扩增。结果 获得了完整无降解的总RNA,得到高效率的消减cDNA文库;克隆了244个有插入片段和长度在100～1100bp之间的单克隆。结论 成功构建了氡暴露小鼠骨髓细胞差异表达的正、反向cDNA消减文库。     

＋Gz重复暴露对大鼠脑组织一氧化氮合成酶基因表达的影响

为了了解＋Gz重复暴露后大鼠脑组织一氧化氮合成酶（NOS）基因表达的变化，探讨＋Gz引起脑损害的分子机制，本文用建立的定量反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测方法检测＋Gz重复暴露后大鼠脑组织内NOS mRNA表达的变化。结果＋Gz重复暴露后30min和6h大鼠脑组织NOS mRNA明显升高，但24h时恢复正常，表明＋Gz重复暴露可刺激大鼠脑组织NOS mRNA的表达，NO可能参与了＋Gz所致脑损害的病理过程，但这种损害是可逆的。     

应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法以XTP3表达质粒pcDNA3．1(-)XTP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因。结论成功构建了乙型肝炎病毒xTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

三氧化二砷体外诱导人HepG2细胞铁蛋白基因表达的研究

目的 了解低剂量三氧化二砷诱导的HepG2细胞的差异表达基因，揭示慢性砷中毒对肝细胞损伤的作用机制。方法 在体外用三氧化二砷(Sμmol／L)处理HepG细胞，同时以PBS处理的相同细胞系作为对照；24h后制备细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成2组，分别与2种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌JM109进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建三氧化二砷处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到：109个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，通过生物信息学分析发现铁蛋白重链和轻链在三氧化二砷诱导的肝HepG2细胞正向消减cDNA文库中显著上调，共有8个阳性克隆子。结论 低剂量三氧化二砷刺激细胞后可诱导铁蛋白的表达上调，暗示铁蛋白在砷诱导的肝细胞损伤中起作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

氡染毒小鼠肺及支气管组织的基因表达

目的 构建氡染毒小鼠肺及支气管组织差异表达基因的cDNA文库,并对其进行初步鉴定和同源性分析。方法采用SR-NIM02型氡室对小鼠进行吸入染毒后,常规饲养3个月,分别提取和纯化染毒组(30工作水平月,WLM)与对照组(0.02 WLM)小鼠的肺及支气管组织的总RNA,采用Super SMART技术和抑制性差减杂交技术(SSH),构建氡染毒后肺及支气管组织的正、反向差减杂交的cDNA文库;常规连接pGEM-T-easy载体,转化DH5α感受态细胞,巢式PCR鉴定;对阳性克隆测序,并与GeneBank数据库进行BLAST同源性比对,进行初步功能分类。结果共获得克隆460个,其中含有插入片段的克隆146个,经BLAST同源性比对后有48个正向差减cDNA片段与61个反向差减cDNA片段与GeneBank中的序列有不同程度的同源性。结论成功构建了氡染毒小鼠肺支气管差异表达cDNA文库,染毒后小鼠肺及支气管组织中某些基因会发生差异表达,其中部分基因可能参与细胞凋亡和周期调控、机体免疫调节及细胞间信号传导等过程。     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。     

人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的 :构建人胃癌抑制消减cDNA文库 ,为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法 :从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A) +RNA ,经反转录后 ,利用抑制消减杂交(SSH)方法 ,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论 :挑取 80 0个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段 ,结果显示其中 750个克隆有插入片段 ,片段大小范围为 2 50～ 70 0bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。     

氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的筛选与鉴定

目的 在建立氡染毒小鼠模型的基础上,筛选和鉴定氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因。方法 采用HD-3型多功能氡室对BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照小鼠吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(累积剂量105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。采用RNA转录物5'末端启动机制技术(SMART)和抑制性消减杂交技术(SSH)构建正、反向消减cDNA文库,选取含有插入cDNA片段的克隆进行反向Northern杂交筛选上调或下调的阳性克隆。克隆的测序结果进行同源性检索和生物信息学分析。结果 在成功构建了消减cDNA文库基础上,挑取白斑390个,获得312个含有插入片段的单克隆,进行反向Northern杂交,分析基因的上调或下调水平。选取差异表达克隆41个进行测序及生物信息学分析,最终获得10条已知功能或有注释的差异基因片段和3条未知的表达序列标签(EST)。筛选出的差异表达基因涉及氧化损伤、细胞增殖和肿瘤发生等多方面的功能。结论 氡染毒可引起一系列基因表达的上调或下调,利用SSH技术可以筛选到氡染毒的差异表达基因,为探讨氡损伤机制提供参考。     

内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的筛选

目的：筛选内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因。方法：提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后mRNA，反转录合成cDNA，与对照组间进行抑制消减杂交，经菌落原位斑点杂交筛选阳性克隆并进行测序向源性分析。结果：内皮细胞内毒素刺激后显示有18条基因差异表达，包括与炎症反应，细胞骨架重构，细胞生长和凋亡以及能量代谢有关的已知基因，另有三条为新基因序列。结论：抑制消减杂交有效地克隆了内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因，有助于阐明内皮细胞活化后细胞形态和功能改变的分子机制。     

小鼠胚胎成纤维细胞差异表达基因的筛选

应用微阵列杂交法对培养前，后的小鼠胚胎成纤维细胞（MFF）mRNA进行检测，找到24类差异表达的基因，为进一步筛选MEF可能表达的新基因，对培养前（driver)，后（tester)的MEF mRNA进行抑制性消减杂交，产物与pGEM-T载体连接构建cDNA削减文库并转染JM109大肠杆菌。随机挑取阳性克隆，PCR扩增后对所得的差异表达基因进行测序及生物信息学分析。在随机挑取的145个克隆中，测得了128条EST序列，经生物信息学分析，它们代表了42类不同基因和3条新基因序列。结果表明，培养后MEF相对于培养前胚胎成纤维细胞确实存在差异表达基因群。提示，进一步的实验研究可能找出对ES细胞增殖分化有重要调控作用的基因或基因群。     

高+Gz反复暴露后大鼠心脏组织应激性差异表达基因的分离

目的筛选 Gz反复暴露后大鼠心脏组织特异性应激基因。方法采用动物离心机处理对照组和实验组大鼠,实验组G值为 10Gz,增长率为1G／s。峰值持续3min,共做3次,两次间歇30min．对照组动物在离心机经历类似实验步骤,所承受的G值为 1Gz;反复暴露后1h提取实验组和对照组大鼠心脏组织总RNA,分离纯化poly A RNA,与Atlas Rat Stress Array膜杂交。并用半定量RT—PCR进行差异基因表达的特异性鉴定。结果得到10个差异表达基因,其中8个在 Gz反复暴露后大鼠心脏组织中表达上调,2个表达下调,选取热休克蛋白70、P21和血红素加氧酶-1基因作为候选基因,经半定量RT—PCR得到特异性验证,P21和血红素加氧酶-1表达水平升高,热休克蛋白70表达下降。结论应用Atlas Rat Stress Array杂交技术可以发现与 Gz反复暴露相关的特异性应激基因,为 Gz反复暴露对心脏组织的作用机制研究提供新的思路和方法。