己烯雌酚摄入对大鼠生精细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的研究青春期己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)摄入对SD(Sprague-Dawley)大鼠性成熟后睾丸生精细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法30只35d龄雄性SD大鼠,随机分为DES 0.01、0.1、1.0、10.0μg/kg·d~(-1)4个实验组和1个对照组(编码为BDa、BDb、BDc、BDd和BC组,每组n=6)。于青春期[出生后第36天(postnatal day 36,PND 36)至49d(PND 49)],实验组每日皮下注射相应剂量的DES,对照组仅注射溶媒。于大鼠性成熟后(PND 64)处死各组大鼠切取双侧睾丸,采用TUNEL法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡,用免疫组化方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax在生精细胞中的表达。结果与对照组相比,BDa组大鼠性成熟后生精细胞凋亡无明显变化,BDb、BDc和BDd 3组生精细胞凋亡增加,且随DES摄入剂量增加而有增加趋势。BC、BDa组生精细胞Bax相对弱表达而Bcl-2强表达,伴随DES摄入剂量增加,Bax表达逐渐增强而Bcl-2表达逐渐减弱,BDd组Bax强表达而Bcl-2弱表达。结论青春期较大剂量DES摄入可使大鼠性成熟后睾丸生精细胞凋亡增加,且随DES摄入剂量增加而有加强趋势。凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2参与青春期DES摄入所致的生精细胞凋亡过程。     

青春期前己烯雌酚暴露对SD大鼠睾丸发育及功能的影响

目的:研究青春期前己烯雌酚(DES)暴露对SD大鼠睾丸发育及功能的影响。方法:21日龄雄性SD大鼠90只,随机分为DES0.01、0.1、1.0、10.0μg/(kg.d)4个实验组和1个对照组(分别为Da、Db、Dc、Dd和C组,每组n=18)。于青春期前,即出生后第22d(postnatalday22,PND22)～35d(PND35),实验组每日皮下注射相应剂量的DES,共14d,对照组仅注射溶媒(玉米油)。观察各组大鼠睾丸下降时间。于青春期晚期(PND50)、性成熟后(PND64)和成年期(PND130)分3批(每批n=6)处死各组大鼠取材,测定睾丸重量,观察比较睾丸组织形态学变化,分析PND130大鼠附睾尾精子质量。结果:C、Da、Db、Dc和Dd组睾丸下降时间分别为PND26.17±1.94、26.83±1.47、28.68±1.03、33.50±1.87和41.50±2.74,其中Db、Dc和Dd组较C组明显延迟(P<0.05或P<0.01)。PND50时,C、Da、Db、Dc和Dd组单侧睾丸重量分别为(1.38±0.10)、(1.38±0.12)、(1.30±0.14)、(0.86±0.18)g和(0.73±0.27)g,其中Dc和Dd组较C组显著减轻(P<0.01);与C组比较,Db组仅有少数生精小管生精上皮中的细胞数目稍减少,Dc和Dd组生精小管发育较差、生精上皮中细胞数目减少、精子发生阻滞、间质细胞发育幼稚,其程度随DES暴露剂量增加而加重。PND64时,C、Da、Db、Dc和Dd组单侧睾丸重量分别为(1.60±0.06)、(1.62±0.11)、(1.58±0.08)、(1.47±0.10)g和(0.99±0.37)g,其中Dc和Dd组较C组显著减轻(P<0.05或P<0.01);Dc和Dd组睾丸组织形态学改变与PND50时类似,但总体较PND50有所改善。PND130时,各实验组与对照组比较,单侧睾丸重量差异无统计学意义(P>0.05),睾丸组织形态学改变难以鉴别出明显差异;C、Da、Db、Dc和Dd组大鼠附睾尾精子密度分别为(73.00±16.90)、(68.00±19.67)、(68.67±12.15)、(35.17±15.64)×106/ml和(19.13±5.17)×106/ml,其中Dc和Dd组精子密度较C组明显降低(P<0.01);与C组比较,Dd组精子活动率下降(P<0.01),Db、Dc和Dd组a级精子比例降低(P<0.05或P<0.01),Dd组b级精子比例降低(P<0.01)。结论:青春期前小剂量DES[0.01μg/(kg.d)×14d]暴露对SD大鼠睾丸发育及功能无明显影响,较大剂量DES[1.0～10.0μg/(kg.d)×14d]暴露对大鼠睾丸发育及功能有明显的近期(PND50和PND64)和较远期(PND130)毒性作用,该毒性作用随DES的暴露剂量增加而加重,随鼠龄增长而逐渐减退,其机制可能与间质细胞和支持细胞的发育及功能受损相关。     

青春期前邻苯二甲酸二丁酯持续暴露对大鼠睾丸发育的影响

目的:研究青春期前邻苯二甲酸二丁酯(DBP)持续暴露对睾丸发育的影响。方法:21日龄断乳青春期前雄性SD大鼠随机分为对照组(n=24)和实验组(n=54),每日分别用玉米油或DBP玉米油溶液灌胃,DBP暴露剂量分别为50mg/(kg.d)(低剂量组,n=18)、200mg/(kg.d)(中剂量组,n=18)和600mg/(kg.d)(高剂量组,n=18),各组动物持续暴露14、21、28d后(即PND35,PND42和PND49)断颈处死。记录大鼠体重变化,检测睾丸重量和体积、附属性器官重量及附睾精子,化学发光免疫分析法检测血清睾酮含量,苏木精-伊红染色观察睾丸组织形态学变化,测量生精小管平均直径及进行睾丸活检评分。结果:低剂量组PND35少量生精小管生精细胞排列紊乱,PND42和PND49睾丸、附属性器官发育及生精功能正常;中剂量组PND35和PND42生精细胞排列紊乱、数目减少,PND49生精小管内可见各级生精细胞及精子,睾丸未见萎缩,附属性器官发育正常;高剂量组大鼠体重增长减缓,血清睾酮水平低下,睾丸生精小管变性萎缩,生精上皮发育阻滞,生精细胞大量凋亡坏死,青春期大鼠睾丸萎缩,无精子,附睾、前列腺和精囊等附属性器官发育迟缓。结论:青春期前DBP持续暴露可损害睾丸组织发育和正常生精功能形成,其毒性效应具有剂量依赖性,高剂量DBP持续暴露引起的睾丸毒性在青春期前发育过程中不可修复,而低中剂量暴露引起的睾丸毒性在PND49之前可完全或部分逆转性恢复。     

青春期前己烯雌酚暴露对大鼠性成熟后生精细胞凋亡的影响及其机制初探

目的:研究青春期前己烯雌酚(d iethylstilbestrol,DES)暴露对SD大鼠性成熟后睾丸生精细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法:30只21日龄雄性SD大鼠,随机分为DES 0.01、0.1、1.0、10.0μg/(kg.d)4个实验组和1个对照组(编码为ADa、ADb、AD c、ADd和AC组,每组6只)。于青春期前[出生后第22 d(postnatal day 22,PND22)至35 d(PND35)],实验组每日皮下注射相应剂量的DES,对照组仅注射溶媒。于大鼠性成熟后(PND 64)处死各组大鼠切取双侧睾丸,采用TUNEL法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡,用免疫组化方法检测凋亡相关蛋白Bc l-2和Bax在生精细胞中的表达。结果:与对照组相比,ADa组大鼠性成熟后生精细胞凋亡无明显变化,ADb、AD c和ADd 3组生精细胞凋亡增加,且随DES暴露剂量增加而有增加趋势。AC、ADa组生精细胞Bax相对弱表达而Bc l-2强表达,伴随DES暴露剂量增加,Bax表达逐渐增强而Bc l-2表达逐渐减弱,ADd组Bax强表达而Bc l-2弱表达。结论:青春期前较大剂量DES暴露可使大鼠性成熟后睾丸生精细胞凋亡增加,且随DES暴露剂量增加而有加强趋势。凋亡相关蛋白Bax和Bc l-2参与青春期前DES暴露所致的生精细胞凋亡过程。     

青春期前苯甲酸雌二醇暴露对大鼠睾丸基因表达谱的影响

目的研究青春期前苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)暴露对SD大鼠睾丸基因表达谱的影响。方法 12只21日龄雄性SD大鼠,随机分为EB[100.0μg/(kg·d)]暴露组(AEb组)和对照组(AC组)。于青春期前,即出生后第22天(PND 22)每日皮下注射EB[100.0μg/(kg·d)],共14d,对照组仅注射玉米油(溶媒)。于性成熟后(PND 64)处死大鼠,采用Affymetrix大鼠基因组230 2.0芯片研究大鼠睾丸基因表达谱变化,选择部分基因采用定量RT-PCR验证芯片实验结果。结果与对照组相比,AEb组有2 740个基因表达变化,其中下调基因1 043个,上调基因1 697个。聚类分析发现差异基因主要包括类固醇激素合成、结合和代谢相关基因,精子发生和精子细胞发育相关基因,DNA复制和修复相关基因,蛋白质合成和修饰相关基因,以及免疫反应、细胞粘附、细胞骨架、信号转导、转录因子、氧化应激和凋亡相关基因等。实时定量RT-PCR结果与基因芯片结果基本一致。结论青春期前EB暴露对SD大鼠睾丸基因表达谱有影响,基因组学的改变可能进一步影响睾丸组织的发育与功能。     

改良尼古丁依赖-戒断大鼠模型的建立与疼痛敏感性观察

目的 通过间断皮下注射尼古丁制作改良尼古丁依赖-戒断大鼠模型,观察尼古丁戒断后大鼠机械刺激缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热刺激缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的变化. 方法 SD大鼠30只,采用随机数字表法随机分成5组,每组6只:正常对照组(Control组)、生理盐水组(NS组)、尼古丁3 mg· kg-1·d-1组(NT3组)、尼古丁9 mg·kg-1·d-1组(NT9组)和尼古丁18 mg· kg-1· d1组(NT18组),分别不注射,皮下注射生理盐水、尼古丁1 mg/kg、3 mg/kg和6 mg/kg,3次/d,连续7d.末次注射后60 min皮下注射美加明1 mg/kg.观察大鼠注射尼古丁期间和戒断后体重变化、存活情况和尼古丁戒断评分.另外选取Control组、NS组和NT9组各6只大鼠,测定右下肢足底MWT和TWL. 结果 与NT3组比较,注射尼古丁后第7天,NT9组和NT18组大鼠体重增加缓慢[(3.8±1.3)、(2.0±0.3)g vs (7.2±1.0)g](P＜0.05),戒断后第1天和第2天大鼠体重增加迅速(P＜0.01).NT9组和NT18组大鼠美加明激发后出现更多的戒断症状(P＜0.01),NT18组大鼠死亡率为17％.与Control组比较,NT9组大鼠在尼古丁戒断后MWT与TWL明显降低(P＜0.01). 结论 间断皮下注射尼古丁9 mg·kg-1·d-17 d可以成功制作改良尼古丁依赖-戒断大鼠模型,尼古丁戒断后大鼠疼痛敏感性增高.     

通痹合剂对雄性大鼠生殖系统的影响

目的 观察通痹合剂对雄性大鼠性激素水平及生殖功能的影响.方法 27只成熟雄性SD大鼠,随机分成3组:正常组、合剂1组和合剂2组每组9只.对照组喂服生理盐水10ml/kg·d-1,合剂1组喂服合剂30g/kg·d-1,合剂2组喂服合剂10g/kg·d-1,60d后处死.检测睾丸系数、精子密度、形态、活力等及血清生殖激素(T、FSH、LH、E2).光镜观察睾丸和附睾组织的病理变化.结果 各组间血清生殖激素水平无统计学差异(P＞0.05).与正常组比较,合剂1组睾丸系数、精子密度显著下降(P＜0.01),合剂2组无统计学差异(P＞0.05).给药组精子形态异常,活动力丧失.光镜下合剂1组睾丸组织严重损伤,合剂2组睾丸组织几乎无损伤.结论 通痹合剂具有明显的抗雄性生育作用,其影响程度呈剂量-效应关系.     

锁阳对少、弱精子症大鼠模型精子数量、活动率和血清睾酮影响及促进未分化精原细胞增殖的实验研究

目的:探究锁阳对少、弱精子症大鼠睾丸重量、血清睾酮浓度、以及精子数量、活动率等精子参数的影响,及促进未分化精原细胞增殖的机制,为开发新的治疗男性少、弱精子症的中药提供实验和理论依据。方法:选取8周龄,体重约(220±10)g的SD大鼠30只,随机分为5组(n=6):空白对照组、模型对照组、3组实验组(低、中、高锁阳浓度剂量);将模型对照组与锁阳实验组予以环磷酰胺[30 mg/(kg·d)]腹腔注射,连续5 d,构建大鼠少、弱精子症模型;将3组实验组分别用低浓度[0.5 g/(kg·d)]、中浓度[1 g/(kg·d)]及高浓度[2 g/(kg·d)]锁阳水煎液灌胃,每天1次,连续4周后观察各组精子数量、活动率,测量各组大鼠血清睾酮浓度,并取各组大鼠睾丸称重;采用Real-time PCR方法检测低浓度组睾丸组织中精原干细胞标志物(Oct4、Thy1、PLZF、C-kit)表达情况,采用β-actin作为内参;采用Real-time PCR方法检测低浓度组睾丸组织中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达情况。结果:空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度锁阳实验组的大鼠睾丸重量分别为(1.52±0.06)g、(1.55±0.06)g、(1.34±0.04)g、(1.35±0.40)g、(1.43±0.30)g,不同浓度锁阳实验组大鼠睾丸重量与空白对照组、模型对照组比较未见明显差异(P0.05)。空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度实验组在每10个高倍镜视野精子数(精子数/10HP)分别为200±15、134±30、216±25、196±5、202±20个,锁阳实验组与模型对照组比较可显著提高大鼠的精子数量(P0.05);低浓度锁阳水提物组睾丸组织中Oct4、Thy1、PLZF、GDNF基因mRNA表达水平较模型对照组增加,差异有统计学意义(P0.05),C-kit基因mRNA表达水平未见明显差异(P0.05);空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度锁阳实验组的大鼠每10个高倍镜视野精子活动率(精子活动率/10HP)分别为(52.1±5.5)%、(38.1±2.5)%、(49.6±1.0)%、(58.7±9.5)%、(59.1±9.5)%;大鼠血清睾酮浓度分别为(190.0±87.5)、(82.5±25.8)、(185.0±82.4)、(331.0±86.7)、(229.0±75.6)mmol/L,锁阳实验组与模型对照组比较可显著提高大鼠的精子活动率及血清睾酮浓度(P均0.05),但与空白对照组比较无明显差异(P0.05)。结论:锁阳能显著提高少、弱精子症大鼠的精子数量、精子活动能力、血清睾酮水平,其改善机制可能是:1通过诱导睾丸Sertoli细胞中GDNF表达,促进未分化精原细胞增殖,从而促进精子发生过程,增加附睾尾部精子数目;2通过促进睾酮分泌,提高血清睾酮水平,进而改善精子活动率。     

铝对大鼠精子质量及精子线粒体的影响

目的:研究铝暴露对大鼠精子质量及精子线粒体的超微结构、线粒体膜电位(MMP)水平及膜通透性转换孔(MPTP)功能状态的影响,探讨铝降低精子质量的可能作用机制。方法:取体重为180～200 g雄性Wistar大鼠96只,根据饮水中AlCl_3的半数致死量(LD50),采用AlCl_3·6H_2O水溶液饮水暴露法,设置高剂量组[1/5 LD50,256.72 mg/(kg·d)]、中剂量组[1/10 LD50,128.36 mg/(kg·d)]、低剂量组[1/20 LD50,64.18 mg/(kg·d)]及对照组[0 mg/(kg·d)],每组随机分配24只,连续作用16周。实验结束时对各组大鼠附睾精子进行质量检测,透射电镜下观察精子线粒体结构,并采用流式细胞术测定精子线粒体的MMP水平及MPTP的功能状态。结果:与对照组比较,低、中、高剂量铝暴露组前向运动精子百分率均显著低于对照组[(46.49±5.37)%、(33.50±8.75)%、(16.94±5.00)%vs(66.28±5.68)%,P0.01];死精子率显著高于对照组[(19.73±5.57)%、(35.80±5.90)%、(55.19±4.97)%vs(12.71±4.84)%,P0.01];畸形精子百分率显著高于对照组[(19.06±2.44)%、(23.78±3.29)%、(32.06±4.65)%vs(14.56±1.62)%,P0.01]。随着铝暴露剂量的增加,铝暴露组精子线粒体肿胀越明显;铝暴露组大鼠的精子MMP水平显著低于对照组[(60.88±7.37)%、(51.54±6.12)%、(37.70±7.44)%vs(74.35±4.67)%,P0.01],MMP水平与铝暴露剂量呈负相关(r_s=-0.819,P0.01);病理性开放的MPTP水平显著高于对照组[(27.80±5.74)%、(36.58±6.67)%、(64.95±8.07)%vs(15.37±7.13)%,P0.01],病理性开放MPTP与铝暴露剂量呈正相关(r_s=0.867,P0.01)。结论:铝暴露可致大鼠精子线粒体肿胀、精子MMP水平降低及MPTP病理性开放,并因此引起精子质量下降。     

藏药鲁堆多吉水提物对雄性幼年大鼠生殖系统的影响

目的:研究藏药鲁堆多吉对雄性幼年大鼠生殖系统的影响。方法:将32只SD雄性幼年大鼠分为对照组、鲁堆多吉水提物低、中、高剂量组,灌胃2周后处死,用放射免疫法检测大鼠血清中睾酮(T)的含量,用ELISA试剂盒测量大鼠血清中LH和FSH的含量,称量大鼠的睾丸重量,计算体重增加量、睾丸脏器系数和精子浓度。将高剂量组大鼠血清在57℃水浴锅中灭活后,按0(对照组)、10%、15%、20%的体积分数加到培养的大鼠睾丸间质细胞中,分别用台盼蓝染色法和MTT检测细胞活率和活力,用放免法检测睾丸间质细胞培养液中T的含量,用大鼠环磷酸腺苷(cAMP)ELISA试剂盒检测睾丸间质细胞内cAMP的变化。结果:与对照组相比,低、中、高剂量的鲁堆多吉水提物能使幼年雄性大鼠的血清T水平[(1.22±0.32)、(1.06±0.29)、(0.57±0.18)nmol/L vs(3.09±0.42)nmol/L,P0.01]、睾丸重量[(0.96±0.09)、(0.92±0.11)、(0.91±0.08)g vs(1.40±0.16)g,P0.01]和精子浓度[(0.19±0.07)、(0.17±0.08)、(0.16±0.07)×106/ml vs(1.03±0.16)×106/ml,P0.01]显著降低,并且呈剂量依赖性。与对照组相比,中、高剂量给药组血清中的LH[(14.69±0.12)、(14.93±0.28)ng/L vs(13.62±0.89)ng/L,P0.01]、FSH[(4.77±0.23)、(4.89±0.38)IU/L vs(4.32±0.18)IU/L,P0.05]显著上升;睾丸脏器系数[(51.39±3.09)、(52.28±4.86)、(54.13±6.06)mg/10 g vs(42.22±3.02)mg/10 g,P0.01]显著提高。与对照组相比,鲁堆多吉水提物含药血清能显著抑制睾丸间质细胞内cAMP水平[(4.39±0.06)、(4.28±0.07)、(4.11±0.10)nmol/L vs(5.51±0.12)nmol/L,P0.01]和T的合成[(1.42±0.15)、(1.12±0.18)、(0.88±0.21)nmol/L vs(1.85±0.18)nmol/L,P0.01]。结论:鲁堆多吉水提物可能通过PKA途径抑制大鼠睾丸间质细胞中T的合成,从而抑制睾丸发育和精子生成,影响雄性幼鼠生殖系统的发育。