类泛素-蛋白酶体系统和药物外排泵抑制剂对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性影响的研究

目的探讨类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的影响。方法采用刃天青显色法检测利福平对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),比较分析结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因的过表达或缺失突变对结核分枝杆菌利福平MIC的差异;检测分别加入羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪4种外排泵抑制剂前后各菌株对利福平MIC的影响。结果结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的过表达均能增强单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性,而Pup、Mpa、Dop和PafA基因的缺失均能显著降低单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性,P值均0.05。4种药物外排泵抑制剂能不同程度的降低各过表达菌株对利福平的MIC,P值均0.05,并且,类泛素-蛋白酶体系统与外排泵抑制剂之间存在一定交互作用。结论类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生有影响;类泛素-蛋白酶体系统可能通过调控外排相关通路蛋白来影响结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生。     

结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性研究

目的通过比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异,探讨Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性。方法分别提取卡介苗菌株(BCG)、结核分枝杆菌国际标准无毒珠(H37Ra)、结核分枝杆菌国际标准强毒珠(H37Rv)、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株总RNA,并进行纯度鉴定。运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达,比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异。结果 H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株与BCG菌株相比,Pup基因表达分别上调1.67、2.65倍,Dop基因表达分别上调2.42、3.69倍,PafA基因表达分别上调4.09、7.36倍,Mpa基因表达分别上调2.65、3.91倍,差异有统计学意义(P<0.05);BCG、H37Ra、H37Rv菌株与新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株相比,Pup基因表达分别下调62%、59%、37%倍,Dop基因表达分别下调63%、64%、34%倍,PafA基因表达分别下调87%、86%、44%倍,Mpa基因表达分别下调64%、67%、32%倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在BCG、H37Ra、H37Rv、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达有差异性,且与菌株毒力呈正相关。Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性具有相关性。     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫重组BCG-Cp23疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。方法用微小隐孢子虫感染免疫抑制BALB/c小鼠,用蔗糖密度梯度离心法纯化其粪便中的卵囊,酚-氯仿法提取微小隐孢子虫的基因组DNA,PCR扩增Cp23基因片段,然后将其克隆TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将Cp23基因片段用限制性内切酶切下克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-Cp-23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG-WT)构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。结果扩增出约360bp的微小隐孢子虫Cp23基因片段并成功构建pMV262-Cp23质粒,通过PCR扩增和提取质粒、酶切表明质粒正确导入BCG-WT中。结论成功构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。     

细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌疫苗在小鼠体内的表达及其免疫应答

目的构建表达细粒棘球绦虫成虫特异性基因EgM123的耻垢分枝杆菌疫苗株,接种BALB/c小鼠,观察其免疫原性。方法 PCR扩增EgM123片段,定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建重组质粒pMV261-EgM123。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α中,培养后提取质粒,测序确定阅读框架正确,后电穿孔转入耻垢分枝杆菌,构建表达EgM123的重组耻垢分枝杆菌疫苗(rMS-EgM123),经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白表达。在培养过程中连续检测菌液A600值,绘制重组菌生长曲线。取重组菌接种小鼠,检测基础接种和加强免疫接种后血清特异抗体水平。结果 PCR扩增出大小为594bp的EgM123片段,EgM123基因正确插入到穿梭质粒pMV261中,测序鉴定阅读框架正确。重组耻垢分枝杆菌连续传10代培养,重组质粒DNA序列未发生变异。Western blot检测表达产物能被抗EgM123鼠血清识别。用重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后的小鼠血清特异性抗体呈持续上升趋势,单次加强免疫8周后抗体水平(A405值为2.504±0.659)显著高于亚单位疫苗组(P0.05)。结论重组耻垢杆菌疫苗菌能表达细粒棘球绦虫成虫EgM123蛋白,且该重组疫苗可通过加强免疫增强基础免疫诱导小鼠产生的抗体水平。     

结核分枝杆菌原核泛素蛋白酶体的研究进展

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的重要机制,并参与细胞生理功能调控。研究发现,结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统可调控并介导结核杆菌逃避宿主的免疫监视和杀灭。因此,介于结核分枝杆菌中的类泛素-蛋白酶体系统在结核分枝杆菌的生理功能及其致病过程中的重要性,且被认为是新的结核病药物治疗靶点。此文就真核生物泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)与Mtb中的类泛素-蛋白酶体系统(Pup-proteasome system,PPS)的差异展开比较,通过辅助因子Pup,Mpa,Dop,PafA及靶蛋白在Mtb中类泛素-蛋白酶体系统中介导蛋白质降解的过程,进一步阐明辅助因子的缺失和突变对新兴的耐药结核杆菌产生的影响展开作一综述。     

柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建鸡柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗并研究其免疫保护性。方法应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫ADF基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中;分别用限制性内切酶PstⅠ/ClaⅠ和PvuⅡ/ClaⅠ进行双酶切,ADF目的基因克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV261-ADF和pMV361-ADF,重组质粒电穿孔转化卡介苗。将构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射3种途径接种雏鸡,BCG免疫组作为对照。免疫后经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊,通过抗球虫指数(ACI)评价重组卡介苗疫苗的保护效果。结果重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF采用滴鼻方式免疫保护效果较好,ACI值分别为161.47和169.21。结论构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF对柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用。     

间日疟原虫pvMSP_(1-19)基因重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的体外扩增间日疟原虫pvMSP1-19基因,构建大肠埃希菌-穿梭质粒PMV261/pvMSP1-19和电转化耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链反应(PCR),体外扩增间日疟原虫的pvMSP1-19基因,克隆入PMD19-T载体,构建亚克隆PMV/pvMSP1-19大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒;电转化方法将PMV/pvMSP1-19穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。并热诱导此重组分枝杆菌,SDS-PAGE电泳观察pvMSP1-19蛋白的表达,Western blot鉴定其免疫学活性。结果成功扩增了间日疟原虫pvMSP1-19基因,并且正确构建PMV/pvMSP1-19穿梭质粒和转化耻垢分枝杆菌。采用Westernblot证实该重组耻垢分枝杆菌表达的pvMSP1-19蛋白能被间日疟患者的血清识别。结论构建的重组耻垢分枝杆菌能表达pvMSP1-19蛋白,该蛋白具有免疫反应性,为pvMSP1-19基因重组BCG疫苗的研制提供了必要的基础。     

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10~3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统研究进展

蛋白酶体途径是真核细胞中除溶酶体外降解蛋白质的又一主要途径,参与细胞的多项生理功能调控。2008年在结核分枝杆菌中发现了原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup在辅助因子Dop、PafA、Mpa的作用下,可以泛素化标记多种蛋白,再将其导入蛋白酶体降解。Pup-蛋白酶体系统的靶蛋白FabD、PanB、Ino1、Icl、SodA、MtrA等涉及物质代谢、信号传导通路、毒性因子、致病性、细菌在宿主体内的持留等多个方面。蛋白酶体抑制剂使蛋白酶体的功能受到限制,Pup标记底物的累积导致的基因表达的间接改变,对结核分枝杆菌抗外界压力和致病性的能力产生影响。Pup-蛋白酶体系统的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制,有望成为抗结核病药物治疗的新靶点。本文对结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体的研究进展作一综述。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

泛素样蛋白-蛋白酶体系统与结核分枝杆菌致病性的相关性研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, MTB)中的泛素样蛋白-蛋白酶体系统(prokaryotic ubiquitin-like protein-proteasome system, PPS),主要介导和调控MTB体内蛋白质的降解。在特定环境下,MTB中泛素样蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein, Pup)选择性标记特定的蛋白质,并在辅助因子的帮助下将靶蛋白送入蛋白酶体内降解,对MTB在宿主体内的生长、繁殖及致病性发挥重要调控作用。本文首先简单介绍了MTB中Pup、蛋白酶体的结构特点、作用及PPS降解靶蛋白的主要过程,接着重点介绍了PPS对MTB致病性的调控机制,及如何通过改变PPS作用来降低MTB致病性等一些最新进展,希望能够为寻找新型抗结核药物提供方向。     

人粒-巨噬细胞集落刺激因子和结核杆菌特异性抗原CFP10嵌合基因重组卡介苗的构建及鉴定

目的构建能共同表达人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)的重组卡介苗(recombinant BCG,rBCG)。方法运用分子克隆技术,通过SOE法(重叠延伸,Gene splicing by overlap exten-sion),扩增GMCSF-CFP10嵌合基因,将该基因定向克隆到穿梭表达质粒pMV361中,构建重组pMV GMCSF-CFP10质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG,经热诱导后对rBCG表达产物作SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果重组质粒pMVGMCSF-CFP10经PCR、酶切及测序证实构建成功,并在BCG中经热诱导成功表达了具有GMCSF-CFP10的嵌合蛋白。结论成功构建能表达GMCSF-CFP10蛋白的重组BCG,为发展新型结核病疫苗奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的　扩增恶性疟原虫海南株FCC1/HN的丙酮酸激酶 (PK)的编码基因 ,构建其原核和真核表达重组质粒 ,测定其序列 ,并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫 3D7和人PK基因之间的差异。　方法　根据 3D7的PK基因设计合成一对引物 ,用PCR从FCC1/HN株基因组中扩增PK基因 ;将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒 pcDNA3 ,分别转化大肠杆菌JM 10 9感受态细菌 ;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆 ,用双脱氧链末端终止法测定其序列 ,用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PK基因 ,大小为 2 2 3 5bp ,编码 744个氨基酸。其氨基酸序列与 3D7的同源性高达 99.9% ,与约氏疟原虫的同源性为 70 .2 % ,但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有 2 0 .9%和 2 1.6%～ 2 5 .4%。　结论　从FCC1/HN株基因组中获取了PK基因 ,成功构建了其原核和真核表达质粒 ,并测定了其序列 ;它与 3D7的PK高度同源 ,但与人的PK基因同源性很低 ,可能是一个药物靶标。