角膜碱烧伤的免疫机制

角膜碱烧伤作为一种常见的致盲性眼病，其损伤机制一直为人们所关注。近年来，随着免疫学理论的发展和实验手段的进步，学者们渐渐认识到免疫系统在角膜碱烧伤时所起的作用。免疫细胞(包括多形核白细胞、郎格罕氏细胞、淋巴细胞等)和免疫分子(包括细胞因子、黏附分子和主要组织相容性抗原)相互联系、相互制约，它们通过细胞免疫、体液免疫和免疫网络来介导角膜碱烧伤的病理变化。     

角膜碱烧伤的免疫学机制研究进展

角膜碱烧伤是眼科临床常见的致盲性眼病,一旦发生,治疗相当棘手,预后极差,其损伤机制的研究一直受到众多学者的重视。许多研究表明,角膜碱烧伤后免疫系统的参与起着非常重要的作用。角膜碱烧伤后角膜免疫微环境的变化致使各种效应细胞和炎性细胞出现规律性变化,另外各种炎性因子也参与角膜碱烧伤的病理损伤过程。就角膜碱烧伤的免疫学机制进行综述。     

自由基与角膜碱烧伤

角膜严重碱烧伤的预后往往不佳,如不及时有效地治疗,常导致永久性的视力丧失。但目前尚无确实有效的治疗方法和药物,这便促使人们开始进一步对碱烧伤后的病理改变机制进行深入的探索。随着医学生物学研究向分子和亚分子水平的发展,自由基造成组织损伤的理论越来越受到基础和临床医学各学科的重视。八十年代初,国外学者提出氧自由基参与了角膜碱烧伤后组织破坏的假说。为角膜碱烧伤的研究开辟了一个新领域。本文就近年来国内外在这方面的研究作一综述,内容主要涉及自由基的来源与生成,自由基的损伤机理与清除,角膜抗自由基系统和角膜碱烧伤后自由基对组织的破坏等。     

角膜碱烧伤病理过程中的免疫机制

随着免疫学和碱烧伤研究领域的进展,我们对角膜碱烧伤病理过程的免疫学机制及其重要性逐步加深了认识。本文介绍了角膜碱烧伤病理过程的免疫学机制的研究现状和进展,将深化我们对角膜碱烧伤疾病发病机制的认识,也有利于该病的临床治疗。     

大鼠角膜碱、酸、热烧伤后ICAM-1、VCAM-1、CD44及E-selectin mRNA的表达

目的 利用RT-PCR法检测大鼠角膜烧伤后角膜局部ICAM-1、VCAM-1、CD44及E-selectin的mRNA表达情况,探讨黏附分子在角膜烧伤中的变化,以进一步完善角膜烧伤的免疫机制.方法 制备Wistar大鼠角膜碱、酸、热烧伤模型.提取大鼠烧伤后3 d和2周角膜RNA,反转录扩增ICAM-1、VCAM-1、CD44及E-selectin,根据DNA条带的光密度值确定DNA含量.观察烧伤后3 d和2周以上各指标的变化.结果 角膜烧伤后3 d,与正常对照组(1.658±0.722)相比,3个烧伤组ICAM-1 mRNA表达量增加(5.699±0.934、3.182±0.830、3.403±0.916),差异均有显著统计学意义(均为P<0.01);2周时,3个烧伤组ICAM-1 mRNA较3 d时明显减少,其中碱烧伤组伤后3 d和2周ICAM-1 mRNA的表达量均较酸和热烧伤组明显增多,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01).同正常对照组(2.172±0.368)相比,烧伤后2周时,碱烧伤组VCAM-1 mRNA表达量(8.591±1.021)增多,差异有极显著统计学意义(P<0.001),而酸和热烧伤组差异均无显著统计学意义.同正常对照组(1.402±0.439)相比,伤后3 d时3个烧伤组CD44 mRNA表达量无显著变化,2周时碱烧伤组CD44 mRNA表达量(5.587±0.753)增加,与对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01),酸和热烧伤组CD44 mRNA表达量增加,但差异无统计学意义.3 d时角膜各烧伤组E-selectin的表达量低于正常对照组,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01);2周时各烧伤组E-selectin mRNA的表达量明显增加,高于正常对照组,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01),3个烧伤组间差异无显著统计学意义.结论 在角膜烧伤的急性期,ICAM-1介导中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附,表达增加.CD44及其配体在角膜烧伤特别是角膜碱烧伤的愈合过程中发挥重要作用.作为介导白细胞与血管内皮细胞最初黏附过程的黏附分子,E-selectin在角膜烧伤的病理发生中的作用机制有待于进一步研究.     

层粘连蛋白在大鼠角膜碱烧伤中的表达及意义

目的　研究层粘连蛋白 (laminin ,LN)在大鼠角膜碱烧伤模型中表达的变化 ,揭示其在角膜碱烧伤修复过程中的作用。方法　制作大鼠角膜碱烧伤模型 ,以免疫组化的方法观察LN在烧伤后 12h、2 4h、3d、7d、14d时表达的变化。结果　LN在正常大鼠角膜仅在基底层柱状上皮细胞胞浆和胞间以及基底膜有少许表达 ;烧伤后 12h ,基底柱状上皮细胞胞浆和胞间以及基底膜的表达增多 ,同时角膜基质层、角膜固有细胞出现LN ,并于 3～ 7d达高峰 ;14d角膜修复时 ,在基底膜柱状细胞、基质中表达减少 ,在角膜基质中表达基本消失。结论　LN在角膜碱烧伤过程中扮演重要角色 ,在介导淋巴细胞吞噬坏死组织、介导细胞 细胞间、细胞 细胞外基质间的黏附、介导上皮细胞移行中有重要作用 ,对于角膜的重新上皮化有积极作用。     

低分子肝素对大鼠角膜碱烧伤后血管内皮生长因子和肝细胞生长因子表达的影响

角膜碱烧伤后新生血管的形成机制及其药物治疗一直是眼科领域研究关注的重点.近年的研究表明肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种较强的促新生血管生长因子~([1]),而低分子肝素(low-molecular-weight heparin,LMWH)可抑制新生血管生成~([2]),但HGF与角膜新生血管的关系及LMWH抑制角膜新生血管的研究国内外报道较少.本实验通过碱烧伤制备大鼠角膜新生血管模型,测量HGF和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在角膜碱烧伤后不同时间的蛋白与mRNA表达,观察LMWH对角膜新生血管的抑制作用,并探讨眼局部应用LMWH抑制角膜新生血管的作用机制.     

血管内皮钙黏蛋白对实验性角膜新生血管的作用及机制

目的 探讨血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）在实验性角膜新生血管发生过程中的作用及机制。方法 动物实验研究。以碱烧伤诱导构建小鼠角膜新生血管模型;RT-PCR法检测VE-cadherin在碱烧伤角膜组织中的表达;碱烧伤1周后角膜局部应用阻断性抗小鼠VE-cadherin抗体进行干预,碱烧伤3周后大体观察角膜新生血管的发生情况以及全角膜铺片CD31荧光组织化学法检测角膜组织新生血管的面积;RT-PCR检测烧伤角膜组织内caspase-3 mRNA的表达;流式细胞术检测角膜组织血管内皮细胞凋亡数目;体外实验进一步验证VE-cadherin对血管内皮细胞（HREC）血管网形成的影响。采用成组t检验方法处理数据。结果 碱烧伤3周后,VE-cadherin抗体干预组角膜新生血管数目较对照组明显减少。RT-PCR结果显示VE-cadherin抗体干预组caspase-3基因水平表达增高;进一步流式细胞术检测结果显示VE-cadherin抗体干预后,角膜组织内凋亡的血管内皮细胞明显增多。体外实验证实VE-cadherin抗体明显抑制HREC细胞系血管网的形成。结论 VE-cadherin钙黏蛋白能通过维护细胞间黏附以及抑制细胞的凋亡等作用保护实验性角膜新生血管内皮细胞的生长,从而维持新生血管的发生发展。     

HIF-1α在大鼠角膜碱烧伤后的作用研究

目的检测大鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达变化,探讨其在角膜碱烧伤损伤机制中的作用。方法建立大鼠角膜碱烧伤模型,采用免疫组织化学与原位杂交技术,检测角膜碱烧伤后不同时间HIF-1α在角膜各层中的表达变化。结果在正常角膜组织中,角膜各层均未见HIF-1α免疫染色,碱烧伤后1d时HIF-1α免疫活性增强,且3d时表达最强,15d时明显下降,30d时仍有高于正常水平的弱表达。原位杂交检测中正常角膜组织有极弱的HIF-1α mRNA表达,碱烧伤后HIF-1α mRNA表达增强,在伤后3d、7d时表达最明显,15d后表达强度恢复至正常组织水平。结论HIF-1α参与碱烧伤后角膜的损伤病理机制,其表达变化影响新生血管形成过程,为寻找角膜碱烧伤新的治疗途径提供了理论依据。     

自体角膜移植对角膜血管新生抑制作用的实验研究

目的 研究早期自体角膜缘移植对碱烧伤后角膜血管新生（ＣＮＶ）的影响。方法 ２０只家兔,用ＮａＯＨ建立角膜新生血管动物模型。在伤后１、３、５、７天进行自体角膜缘移植结果 角膜上皮愈合时间手术组平均１２．３８天,对照组１９天。ＣＮＶ程度：手术组１￣２级１５眼占９３．７５５,对照组３￣４组４眼占１００％。手术组ＣＮＶ侵入角膜少,血管细小,管腔内红细胞少。结论 自体角膜缘移植可抑制ＣＮＶ,促进角膜上皮的愈     

组织工程角膜上皮移植治疗兔角膜碱烧伤的形态学观察

目的:探讨组织工程角膜上皮移植治疗角膜碱烧伤的疗效和时机。方法:1mol/LNaOH制作改良兔角膜碱烧伤模型21只42眼,分对照组和移植组,移植组分别在碱烧伤后1,3,6,9d(早)和14d(中)行自体或同种异体组织工程角膜上皮移植术,比较移植组及对照组烧伤后28d内眼表和组织病理学变化。结果:角膜碱烧伤后7d开始出现角膜上皮的大片脱落,14d角膜上皮大片脱落或溃疡发生率达72%,持续至28d,而移植组在28d时发生率仅为25%,大多获得完整的角膜上皮;烧伤后早期移植组角膜基质深层炎性细胞浸润和新生血管生长较对照组明显受到抑制,而中期移植组角膜基质层较对照组并无明显差异;28d内异体组织工程角膜上皮移植的免疫排斥反应并不大于自体移植。结论:自体或同种异体组织工程角膜上皮移植均可尽快恢复眼表完整性,且烧伤后早期移植效果明显优于中期移植。     

碱性烧伤后角膜修复的实验研究

本研究应用氚－胸腺嘧啶核苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）标记ＤＮＡ，对角膜碱性烧伤后再生修复过程的病理改变进行了实验性研究，动态地观察了新生毛细胞管的内皮细胞，角膜细胞，胶原纤维的变化，探讨了这些成分在角膜烧伤后发生修复中的作用，为角膜化学伤的治疗提供理论参考。     

Observation on ultrastructure and histopathology of cornea following femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty for acute corneal alkaline burns

AIM: To demonstrate the changes in ultrastructure and histopathology of the cornea in acute corneal alkaline burns after femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty. METHODS: The New Zealand white rabbits treated with alkaline corneal burn were randomized into two groups, Group A (16 eyes) with femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty 24h after burn and Group B (16 eyes) without keratoplasty as controls. All eyes were evaluated with transmission electron microscopy (TEM) at 1, 2, 3, and 4wk follow-up, then all corneas were tested by hematoxylin and eosin staining histology. RESULTS: The corneal grafts in Group A were transparent, while those in Group B showed corneal stromal edema and loosely arranged collagen fibers. One week after treatment, TEM revealed the intercellular desmosomes in the epithelial layers and intact non-dissolving nuclei in Group A. At week 4, the center of the corneas in Group A was transparent with regularly arranged collagen fibers and fibroblasts in the stroma. In Group B, squamous cells were observed on the corneal surface and some epithelial cells were detached. CONCLUSION: Femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty can suppress inflammatory responses, prevent toxic substance-induced injury to the corneal endothelium and inner tissues with quicker recovery and better visual outcomes.     

Anti-neovascular effect of chondrocyte-derived extracellular matrix on corneal alkaline burns in rabbits

Purpose

We investigated the effect of a chondrocyte-derived extracellular matrix (CDECM) on experimental corneal alkaline burns in rabbits.

Methods

Corneal neovascularization (NV) was induced by applying an 8-mm filter paper soaked in 1 N NaOH to the right central corneas of rabbits for 1 minute. Ten days later, the rabbits were randomly divided into three groups: the alkaline burn group, the CDECM transplantation group, and the human amniotic membrane (HAM) transplantation group. The left eyes were used as controls. CDECM and HAM were transplanted onto the corneal surface to completely cover the resected area and were subsequently sutured. On the 10th day after transplantation, the structural changes of the cornea were analyzed histologically. We examined the effects of CDECM on clinical NV features and on the expression of corneal NV markers.

Results

The alkaline burn produced significant NV and increased the corneal thickness. On day 10 after transplantation, the thickness, NV and opacity of the cornea were markedly decreased in the CDECM group (p?<?0.001). However, the HAM transplantation group did not exhibit improvements in these clinical parameters, and there were no significant differences relative to the burn group. In addition, the use of CDECM improved the healing of the cornea following the alkaline burn by disrupting the corneal epithelial proliferation and reducing the fibrotic changes of the stroma. The hallmarks of NV were significantly induced in the subepithelium by the alkaline burn, and these levels were also suppressed by CDECM. The CDECM suppressed corneal NV by inhibiting nuclear factor-kappa B (NF-κB) activation by blocking the PKC and Akt signaling pathways.

Conclusions

CDECM transplantation was markedly effective in healing alkali-burned corneas by modulating the translocation of NF-κB to the nucleus, thereby representing a promising material for the noninvasive treatment of ocular surface disease.     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

角膜碱烧伤后VEGF的表达与新生血管的关系

目的研究碱烧伤后角膜血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）的表达与角膜新生血管化的关系。方法30只Sprague-Dawleg（SD）大鼠碱烧伤，诱导角膜新生血管模型。碱烧伤后不同时间形态学分析来评价角膜新生血管的情况，免疫组化及Westem blot评价角膜VEGF的表达。结果角膜碱烧伤后24hVEGF的表达开始增高，伤后4d达高峰，伤后7d VEGF的表达下降，14d后显著下降。碱烧伤后，角膜新生血管与VEGF的表达呈明显的平行关系。结论碱烧伤后大鼠角膜VEGF的表达水平与新生血管的形成有相关性，并在其中发挥重要作用。     

蛹虫草提取物抑制大鼠角膜新生血管的实验研究

目的研究蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)对碱烧伤所致大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的抑制作用。方法采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型,75只大鼠随机分为5组:A组为模型对照组,B组为阳性对照组,C组、D组、E组分别为高、中、低剂量CME治疗组,造模后每组均隔日给药,A组给予生理盐水结膜下注射,B组给予0.5g·L-1地塞米松结膜下注射,C组、D组、E组分别给予10.0mg、5.0mg、2.5mg CME结膜下注射。于造模后第4天、第8天、第14天测量CNV的生长面积,并检测角膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)蛋白及其mRNA的表达情况。结果造模后第4天,C组、D组、E组的CNV面积分别为(4.23±1.62)mm2、(6.15±3.52)mm2、(7.78±1.33)mm2,第8天分别为(6.89±1.93)mm2、(10.19±3.37)mm2、(11.51±3.70)mm2,第14天分别为(12.55±3.96)mm2、(17.14±2.71)mm2、(19.77±5.75)mm2,均较A组(12.03±2.09)mm2、(22.09±4.24)mm2、(25.19±2.22)mm2明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组与B组表达水平相当,差异无统计学意义(P>0.05)。C组、D组、E组角膜组织中VEGF蛋白及其mRNA的表达较A组明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组与B组表达水平相当,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CME能有效抑制碱烧伤所致大鼠CNV的形成,抑制角膜组织中VEGF的表达可能是其抑制CNV生长的机制之一。     

Crucial role of corneal lymphangiogenesis for allograft rejection in alkali‐burned cornea bed

Backgroud: To examine the time course of hemangiogenesis, lymphangiogenesis, inflammation after corneal alkaline burns and compare with the importance of corneal hemangiogenesis, lymphangiogenesis and inflammation in allograft rejection on alkali‐burned cornea bed, respectively. Methods: Rat corneal hemangiogenesis and lymphangiogenesis were examined by whole mount immunofluorescence and double enzyme‐histochemistry, and the state of corneal inflammation was evaluated by inflammation index scoring and histopathology. Then, corneal transplantations were divided into six groups and performed before the burn (group A) and on day 3 (group B), 2 weeks (group C), 5 weeks (group D), 6 weeks (group E) and 8 weeks (group F) after alkaline burns, respectively. The immune rejection of grafts was evaluated by interferon‐γ, interleukin‐2 enzyme‐linked immunosorbent assay and slit‐lamp examination. Results: Both corneal lymphatic and blood vessels reached the top 2 weeks after the burn. Corneal lymphangiogenesis disappeared 5 weeks after the burn, and corneal hemangiogenesis regressed completely 3 weeks later. Corneal inflammation was strong on day 3, but resolved 6 weeks after the burn. Compared with other groups, the mean survival time of groups B (4.67 ± 1.03 days) and C (5.00 ± 0.63 days) was significantly shorter (P < 0.05). The difference of mean survival time of grafts between group D (9.50 ± 1.05 days) and group E (9.83 ± 0.75 days), between group D and group F (10.00 ± 0.89 days) was not significant (P > 0.05). Conclusions: Corneal lymphangiogenesis presents for a shorter duration than corneal hemangiogenesis or corneal inflammation but plays a crucial role in allograft rejection on alkali‐burned cornea bed.     

羊膜移植治疗早期眼表碱性化学伤的临床观察

目的:探讨新鲜人羊膜移植术对中重度早期眼表碱烧伤的临床效果。方法:对32例41眼中重度早期眼表碱烧伤进行单层或多层羊膜移植术,联合局部给予典必殊眼液及眼膏点眼,术后随访6～18(平均12)mo。结果:Ⅱ～Ⅲ度眼表碱烧伤29眼,角膜上皮愈合良好。Ⅳ度烧伤12眼,6眼角膜上皮愈合良好,5眼发生持续性上皮糜烂,1眼角膜溶解穿孔,所有病例均无排斥反应及睑球粘连。结论:单纯羊膜移植术是Ⅱ～Ⅲ度早期眼表碱烧伤简单有效的治疗方法,但对Ⅳ度烧伤者疗效欠佳。