乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

三氧化二砷反式激活基因AsTP2的克隆化及生物信息学分析

目的三氧化二砷反式激活靶基因(AsTP2)的克隆化研究。方法对构建的三氧化二砷差异表达的肝HepG2细胞cDNA消减文库进行筛选，利用RT-PCR技术获得新基因AstTP2的编码序列，结合生物信息学对其氨基酸序列、染色体定位和基因功能进行分析比较。结果AsTP2基因编码区为1119nt，编码产物为372aa。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，发现未知功能的同源蛋白，说明克隆的AsTP2基因属于未知功能新基因，GenBank注册号为AY744366。该基因在三氧化二砷诱导的HepG2细胞中表达上调。结论克隆了一条新的三氧化二砷反式激活靶基因AsTP2，为进一步研究三氧化二砷的反式激活作用和揭示砷致癌的生物学机制提供新线索。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因，采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCV NS3蛋白诱饵酵母质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在4重营养缺陷培养基（SD／－Trp-Leu-Ade-His)上生长，又能在涂有X－α－半乳糖（X－α－gal）的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌后进行测序，并进行生物信息学分析。分析的结果显示，筛选出19个阳性克隆，包括已知功能基因17个，还有1个克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有44％的同源性，初步证明了此基因与HCV NS3有结合活性。说明成功克隆了HCV NS3蛋白结合蛋白基因，为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。     

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2（cyclin B2）启动子DNA结合蛋白,探索cyclin B2的表达调节机制.方法应用噬菌体展示技术,以cyclin B2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclin B2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白.结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclin B2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclin B2基因的转录调节机制奠定了基础.     

cDNA文库噬菌体展示法的建立及乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白筛检

为寻找乙型肝炎病毒（HBV）前S1蛋白的结合蛋白，将前S1蛋白包被于聚苯乙烯平板，经过“包被－吸附－洗脱”筛检过程，获得前S1蛋白结合蛋白的cDNA序列，并将推断的氨基酸序列进行相互比较，经生物信息学方法获得结合蛋白的全长序列。共经过4轮生物淘洗过程。结果提示，神经胶质瘤抑制子修选基因区基因（GLTSCR）2上游部分序列存在于HBV前S1结合的重组T7噬菌体中，多个克隆的测序结果发现前S1蛋白结合蛋白具有KxPxKSGxxxL结构域，HBV前S1蛋白的结合蛋白可能是GLTSCR2的编码产物。     

慢性髓细胞白血病相关蛋白CMLAP的基因克隆化研究

目的了解慢性髓细胞白血病(CML)基因表达谱的规律,并对在CML中特异性高表达的一个新基因进行克隆、分析与鉴定。方法应用基因表达谱芯片技术,比较CML患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)基因的表达差异。检索核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt),对差异表达的基因进行生物信息学分析,与已知功能基因序列进行同源性比较。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因序列,据此设计并合成该基因序列的特异性引物,提取CMLPBMC的总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果在CML患者PBMC中克隆一个新的基因,经测序证实,其编码序列全长为1872个核苷酸(nt),编码产物由624个氨基酸残基(aa)组成,命名为CMLAP。在GenBank中注册,注册号为AY762229。结论基因表达谱芯片技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了在CML中高表达的新基因CMLAP,为进一步研究CML发生发展的分子生物学机制奠定基础。     

Characterization of radioactive metabolites of 5-HT2A receptor PET ligand [18F]altanserin in human and rodent

This study was performed to identify and characterize the radiometabolites of the serotonin 5-HT2A receptor ligand [18F]altanserin in supporting quantification of the target receptors by positron emission tomography. In analogy to its analog ketanserin, we postulated 4-(4-fluorobenzoyl)piperidine (FBP) and altanserinol for the previously observed two polar radiometabolites, corresponding to dealkylation at the piperidine nitrogen and reduction at the ketone, respectively. To test this hypothesis and characterize the in vivo and in vitro behavior of the radiometabolites, we synthesized nonradioactive authentic compounds altanserinol, 1-(4-fluorophenyl)-1-(piperidin-4-yl)methanol (FBPOH), and isolated nonradioactive FBP metabolite from monkey plasma. [18F]Altanserinol was obtained by NaBH4 reduction of [18F]altanserin, followed by acid hydrolysis. Identification of radiometabolites was carried out by high performance liquid chromatography and thin layer chromatography comparison of the radioactive plasma after injection of tracers with five authentic compounds. Human studies revealed that at least four radiometabolites, one identified as [18F]altanserinol, resulted from reduction of the ketone functionality. The N-dealkylation product [18F]FBP was not detectable; however, a radiometabolite of FBP was present in plasma after administration of [18F]altanserin. Monkey studies showed nonradioactive FBP was converted rapidly to a less polar metabolite. In rat, altanserin and altanserinol were converted to each other in vivo, and all the radiometabolites likely penetrated the blood-brain barrier and entered the brain. Displacement binding of altanserin to cloned serotonin 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, and 5-HT7 receptors showed Ki values of 0.3, 6.0, 1,756, and 15 nM; the binding of FBP and altanserinol to these four 5-HT subtypes was negligible. We conclude from these studies that the radiometabolites of [18F]altanserin from N-dealkylation and ketone reduction should not interfere with specific receptor quantification in an equilibrium paradigm.     

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点

目的：检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性，探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点，从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索。方法：采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT基因第2内含子多态性VNTR片段，克隆并鉴定，以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验，以确定该片段是否存在蛋白结合位点。结果和结论：hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点，该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物，蛋白结合的关键位点处于42bp重复单元c端的典型E-box基序(CACGTG)，但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元。此外，利用第6内含子内上游的VNTR(VNTR6-1st)的重复单元做为探针，结果发现该38bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合，从而提示了不同VNTR序列功能的多样性。     

重组人蛋白C在CHO/dhfr+细胞中的表达与分析

目的 :人蛋白C具有重要的抗凝功能 ,与复发性血栓性疾病、蛋白C缺陷症、创伤等有重要关系。血源蛋白C成本高、工艺复杂且存在纯度、稳定性、安全性等问题 ,研制重组人蛋白C具有必要性。目前尚无此类产品上市。本研究拟从人肝细胞中克隆蛋白C的cDNA ,构建人蛋白C的哺乳动物细胞表达载体 ,实现重组人蛋白C在CHO dhfr 中的表达。方法 :用RT_PCR从人胎肝细胞mRNA中扩增人蛋白C的全长cDNA片段 ,将之克隆入pGEM_T载体并测序。目的片段插入真核表达载体pIRESneo以构建重组表达质粒。磷酸钙共沉淀法转染CHO dhfr 细胞 ,G4 18筛选抗性克隆。Western印迹法检测细胞培养上清。HitrapQ进行色谱纯化。表达产物经蛙蛇蛇毒激活后以APTT法测定抗凝活性。结果 :RT_PCR扩增到长 1386bp的DNA片段 ,序列与已报道的人蛋白C一致。所构建的表达质粒pIREShPC转染CHO dhfr 细胞 ,经G4 18加压筛选得到 7株表达细胞。Western印迹法检测发现表达产物能与抗人蛋白C单克隆抗体结合 ,相对分子质量与人蛋白C一致。HitrapQ纯化重组蛋白回收率 >6 0 %。表达产物抗凝活性略低于天然人蛋白C。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

H5N1型流感病毒M1蛋白的基因克隆与表达

目的：克隆、表达A型H5N1流感病毒基质蛋白M1,为研制新的流感快速检测方法奠定基础。方法：应用PCR方法扩增M1的全基因序列,克隆至PET32a载体上,经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21（DE23）,经IPTG诱导表达M1蛋白后,对其表达产物进行SDS-Page和Western Bloting分析。结果：SDS-Page电泳显示M1蛋白在BL21（DE23）大肠杆菌中成功表达,Western Bloting分析显示表达产物可以与M1多克隆抗体发生特异性反应。结论：成功克隆和表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,为进一步制备高滴度单克隆抗体、研制新的流感检测方法奠定了基础。