肺腺癌癌旁组织及胚胎肺的基因表达谱研究

目的 利用基因芯片技术研究肺腺癌组织、癌旁组织及胚胎肺组织中的基因表达差异。方法 分别抽取肺腺癌组织、癌旁组织和胚胎肺组织的总RNA,并纯化mRNA。采用逆转录的方法,制成cDNA链,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后做探针,与含有1152条人类全长基因芯片进行杂交。以ScanArray 4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,并用计算机处理和分析。结果 4例肺腺癌组织和癌旁组织标本中,共同表达差异基因25个,其中上调基因3个,下调基因22个;胚胎肺组织和癌旁组织标本中,表达差异基因316个,其中上调基因192个,下调基因124个;胚胎肺组织和癌旁组织中表达差异基因与肺腺癌组织和癌旁组织比较,共同表达差异基因16个,其中上调基因12个,下调基因4个。结论 肺腺癌与癌旁组织共同表达差异的25个基因可能与肺癌的发生、发展有关;胚胎肺组织与癌旁组织表达差异的316个基因与生长发育环境有关;胚胎肺组织和癌旁组织与肺腺癌组织和癌旁组织共表达差异的16个基因可能与早期肺腺癌启动有关。     

肺癌耐药相关基因在肺癌组织和肺癌细胞株中的表达

背景与目的：我们已经通过抑制消减杂交技术发现了一条新的长494bp的肺癌耐药相关基因片段,并克隆了它的全长cDNA序列。本研究旨在研究该肺癌耐药相关基因（lung cancer drug resistance-related gene,LCDRG）在肺癌组织、癌旁组织及5种肺癌细胞株中的表达。方法：应用半定量RT－PCR检测38例肺癌组织、12例癌旁组织和5种肺癌细胞株中该基因的表达。结果：肺癌组织中LCDRG mRNA的表达明显高于癌旁组织（P＜0．001）,但在肺腺癌和鳞癌之间差异无统计学意义。该基因在肺腺癌细胞株SPC－A－1和A549、大细胞肺癌细胞株H460、小细胞肺癌细胞株H446和SH77中的表达依次递减。结论：LCDRG是一条肺癌相关基因,该基因可能与肺癌的发生、发展密切相关。     

BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞中60个肺癌相关基因的表达研究

目的：研究永生化人支气管上皮细胞（BEP2D）和α粒子辐射诱发BEP2D细胞后形成的恶性转化细胞（R15Hp35T-2)中60个肺癌相关基因的表达谱。方法：首先搜集了60个肺癌相关的基因，经扩增和纯化后，用Cartesian PixSys550 cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。然后提取BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞的RNA，经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中的cDNA进行杂交。结果：与BEP2D细胞相比，R15Hp35T-2细胞中上调表达的基因有27个，下调表达的基因有7个。大部分抑癌基因的mRNA丰度在2种细胞中表达相似；而大多数癌基因和生长因子类基因的mRNA丰度在R15Hp35T-2细胞中高表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮恶性转化细胞中，癌基因及生长因子类基因可能共同促进了细胞的转化。     

肺癌中FHIT基因异常甲基化及其蛋白表达的意义

目的：检测肺癌组织FHIT蛋白表达及基因异常甲基化，探讨其在肺癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组化SP法和甲基化特异性PCR（MSP）检测肺癌组织与癌旁组织（n=60）中FHIT蛋白表达和基因异常甲基化情况，并对基因甲基化扩增产物进行测序，对60例患者随访调查。结果：FHIT蛋白在癌旁组织的阳性表达明显高于癌组织，二者差异存在统计学意义（76．7％vs50．0％，P〈0．05）；FHIT基因异常甲基化在癌组织中的发生率明显高于癌旁组织，二者差异存在统计学意义（68．3％vs35．0％，P〈0．001）；FHIT基因甲基化的发生率在FHIT蛋白阴性患者中高于阳性表达者（83．3％vs53．5％，P〈0．05）；FHIT蛋白表达及基因甲基化发生率均与性别、年龄、吸烟状况、组织学类型、大体分型、TNM分期及淋巴结转移无关（P〉0．05）；FHIT蛋白阳性表达患者生存率高于阴性表达者（P〈0．05），FHIT蛋白是影响无瘤生存时间的危险因素（P〈0．001）。结论：肺癌中FHIT基因异常甲基化频繁发生，FHIT蛋白表达明显下调，FHIT在肺癌的发生发展中可能具有重要的作用，FHIT蛋白可以作为判断患者预后的重要指标。     

基因表达谱芯片胃癌差异表达基因的筛选

目的:利用基因表达谱芯片研究胃癌组织中差异表达的基因,从多基因角度研究胃癌发生的分子机制.方法:抽提6例胃癌组织和相应的癌旁组织的总RNA,反转录成cDNA同时进行标记.将标记的cDNA与基因表达谱芯片杂交,经过芯片的扫描和数据处理,分析出胃癌组织和癌旁组织之间差异表达的基因.结果:通过对胃癌组织和癌旁组织的基因表达谱的比较分析,发现在胃癌组织中表达差异＞2倍的基因共有696个,其中表达上调的基因318个,表达下调的基因378个.差异表达的基因主要参与信号转导、免疫反应和细胞运动等生物学过程.结论:胃癌组织与癌旁组织的表达谱存在较大差异,利用基因表达谱芯片可筛选出胃癌差异表达的基因,从而有利于在临床上对肿瘤的诊断和治疗.     

肺癌变基因表达差异cDNA微阵列的研究

背景与目的：肺癌发病率和死亡率均较高,其发病的分子机制尚不清楚。本实验旨在研究人肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织及淋巴结转移癌组织的基因差异表达情况,寻找肺癌组织中相对高表达基因,为肺癌的早期诊断和治疗提供可能的理论依据。方法：将新鲜肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织及淋巴结转移癌组织用液氮速冻,提取总的RNA后逆转录标记cDNA探针,与含588个基因的cDNA微阵列膜杂交,通过放射自显影、灰度扫描杂交信号强弱获得差异表达基因。结果：肺癌组织中差异表达的基因有40个,其中早期生长反应蛋白1(early growth response protein 1,EGR1)、分泌性凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis related protein 1．SARP1)等36个基因表达上调,诱导骨髓白细胞分化蛋白1(myeloid cell leukemia protein 1,MCL1)等4个基因表达下调,以癌基因／抑癌基因、细胞周期调节、生长因子及凋亡相关基因上调为主;癌旁组织有33个差异表达基因,基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等20个基因上调,而下调的基因有MCLI、内皮素2(endothelin 2,ET2)等13个;转移淋巴结组织有21个基因表达差异,CD40受体相关因子1(CD40 receptor-associated factor 1,CRAF1)等15个基因下调。而上调的基因仅有6个,主要以细胞粘附分子、基质金属蛋白酶、胶原蛋白等上调为主。结论：EGR1、SARP1等基因可能是肺癌变的关键基因,MMP-9、血小板反应蛋白2(thombospondin 2．TSP2)等基因可能在肺癌浸润和转移中起重要作用。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建

目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.     

新的肺癌候选癌基因RAP2B的鉴定和功能研究初探

背景与目的 RAP2B是我们实验室构建的中国人肺鳞癌差异表达cDNA文库中高表达的基因之一.作为具有保守结构域的Ras超家族成员,RAP2B基因在肿瘤发生发展中的作用仍属未知.本文拟初步探讨RAP2B基因在肺癌中的作用及其机制.方法 应用半定量RT-PCR方法检测了27例手术切除的肺鳞癌肿瘤组织和相应的癌旁组织中RAP2B基因的表达;结合生物信息学分析克隆全长ORF区并转染大鼠Rat1细胞,观察转化灶形成情况;采用NF-kappaB信号通路特异的报告基因观察RAP2B基因对NF-kappaB通路的影响.结果 RAP2B mRNA在约67%(18/27)的肺鳞癌配对组织中肿瘤较癌旁组织高表达;成功构建了RAP2B的真核表达质粒;平板转化实验显示转染RAP2B基因的细胞出现明显转化灶;通路报告基因分析显示RAP2B能够明显激活NF-kappaB通路.结论 RAP2B基因在肺癌患者的肿瘤组织高表达,在体外具有恶性转化Rat1细胞能力,提示其为候选癌基因,并且可能通过激活NF-kappaB信号通路在肺癌发生发展中发挥作用.     

肺癌相关基因HLCDG1的克隆和表达分析

背景与目的：比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描结果显示肺癌患者在染色体3p、5q、6q、9p、10q、llp、13q、17p、19p等区域存在高频率的杂合性缺失,提示可能有多个未知的易感基因或抑癌基因与肺癌的发生、发展相关。本研究选用在mRNA差异显示研究中获得的在肺癌组织中表达下调且代表新基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)LXDDl为进一步研究对象,克隆其全长cDNA。方法：采用Northern杂交验证LXDDl在肺癌中的表达差异。并用MTN(Multiple Tissue Northern Blots^TM)膜检测其在正常组织中的表达及其所代表基因的转录本大小;克隆其全长cDNA,并利用生物信息学对该序列进行初步分析;用差异RT-PCR检测新基因在肺癌组织、配对癌旁非癌组织、肺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达。结果：成功地克隆了一个在肺癌中表达下调的新基因。HLCDGl(human lung carcinoma deleted gene 1),GenBank登录号为AF447582,全长cDNA为3．113kb,预测其开放阅读框编码一个含166个氨基酸的跨膜蛋白质。通过电子-聚合酶链反应(electric-polymerase chain reaction,e-PCR)将该基因定位于5q33。结论：HLCDGl基因是一个在肺癌中表达下调的新基因。这提示HLCDGl可能与肺癌的发生、发展相关。     

肺癌患者基质分解素-1基因表达的研究

目的：了解基质分解素－１基因在肺癌中的表达水平。方法：１９例肺癌患者术中取癌组织及癌旁肺组织；提取组织总ＲＮＡ；用逆转录共扩增定量ＰＣＲ方法测定基质分解素－１（ＭＭＰ３）基因表达水平。结果：肺癌组织基质分解素－１基因表达水平明显高于癌现组织。肺癌患者ＭＭＰ３基因表达水平明显高于癌旁肺组织。肺癌患者ＭＭＰ３基因表达水平与肿瘤大小，肿瘤组织学类型无关。结论：基质分解素－１在肺癌的进展中可能起重要作用。     

Identification of genes differentially expressed in human hepatocellular carcinoma by a modified suppression subtractive hybridization method

To identify differentially expressed genes in human HCC in China, we applied a modified SSH method for cDNA subtraction. Such modification has made the method more effective for subtraction. We have obtained 36 and 24 differentially expressed cDNA fragments after modified SSH from 4 paired samples of human HCC and non-HCC tissues, respectively. Reverse Northern blotting analysis was performed to further identify the genes differentially expressed in the HCC and non-HCC tissue samples. There were 25 genes really overexpressed in HCC, and their corresponding encoding molecules may reflect the events of cell accelerated metabolism, proliferation, angiogenesis, anti-apoptosis, tumorigenesis (TLH107, TFH9) and the potential for metastasis. Of the 25 genes overexpressed in HCC, 5 were novel and their full-length cDNAs were cloned. These 5 novel genes are functionally associated with the occurrence and development of HCC according to the Database analysis. In the paired non-HCC tissues, there were 15 genes lowly or not expressed in HCC, and their encoding proteins function as tumor suppressors (TFA3, TFA11), acute-phase reactive proteins, and the blood plasma proteins that are mainly or exclusively synthesized in the liver. The distinct profiles of the differentially expressed genes in HCC and the paired non-HCC tissues have partially reflected the genetic alterations during HCC tumorigenesis. The novel HCC-specific gene TLH6 and the CT antigen encoding gene TLH107 may have diagnostic and therapeutic potentials in HCC and/or other solid cancers.     

Discovery of differentially expressed genes in human breast cancer using subtracted cDNA libraries and cDNA microarrays

Identifying novel and known genes that are differentially expressed in breast cancer has important implications in understanding the biology of breast tumorigenesis and developing new diagnostic and therapeutic agents. In this study we have combined two powerful technologies, PCR-based cDNA subtraction and cDNA microarray, as a high throughput methodology designed to identify cDNA clones that are breast tumor- and tissue-specific and are overexpressed in breast tumors. Approximately 2000 cDNA clones generated from the subtracted breast tumor library were arrayed on the microarray chips. The arrayed target cDNAs were then hybridized with 30 pairs of fluorescent-labeled cDNA probes generated from breast tumors and normal tissues to determine the tissue distribution and tumor specificity. cDNA clones showing overexpression in breast tumors by microarray were further analysed by DNA sequencing, GenBank and EST database searches, and quantitative real time PCR. We identified several known genes, including mammaglobin, cytokeratin 19, fibronectin, and hair-specific type II keratin, which have previously been shown to be overexpressed in breast tumors and may play an important role in the malignance of breast. We also discovered B726P which appears to be an isoform of NY-BR-1, a breast tissue-specific gene. Two additional clones discovered, B709P and GABA(A) receptor pi subunit, were not previously described for their overexpression profile in breast tumors. Thus, combining PCR-based cDNA subtraction and cDNA microarray allowed for an efficient way to identify and validate genes with elevated mRNA expression levels in breast cancer that may potentially be involved in breast cancer progression. These differentially expressed genes may be of potential utility as therapeutic and diagnostic targets for breast cancer.     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的：认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生,发展的分子机制。但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意,本实验应用抑制消减杂交技术筛选入肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法：以肾癌组织mRNA为检测对象（Tester)。正常肾组织mRNA为驱赶者（Driver)。构建cDNA消减文库,随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析。对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置,用Northern blot,半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果：文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q^22,4q^15.3,9q^34,22q^11.2。已在GenBank中登录（BM181083,BI784487,BI863835,BI863386）,对其中28、170号克隆用Northern杂交,半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论：抑制消减杂交技术是筛选,克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长,研究基因功能提供了实验基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库，筛选后挑选阳性克隆进行测序，并在Gen Bank数据库中进行同源性比较，最后经RT－PCR验证。结果 成功克隆10个差异基因片段，其中2个为新基因（GenBank登录号分别为：C20：AF363068；C34：AY032661）。结论 抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

哈萨克族食管癌差异表达基因的研究

 目的 筛选并克隆在哈萨克族食管鳞癌与正常食管组织之间差异表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析，构建哈族食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织之间差异表达的cDNA消减文库；(2)克隆、鉴定食管癌组织特异表达的基因；(3)登录Genbank．运用Blastn程序进行同源性分析。结果 成功构建了消减效率高的哈族食管鳞癌cDNA消成文库．对其中6个克隆的插入cDNA片断进行测序，经检索Genbank表明：这些差异表达基因与跨膜受体、乳腺癌转录因子、蛋白剪接基因及染色体1、8不同区域有较高的同源性。结论 通过抑制性消减杂交技术构建了哈族食管鳞癌cDNA消减文库，并分析鉴定了部分差异表达基因，为进一步筛选鉴定食菅鳞癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等提供了依据。     

Identification of differentially expressed genes in immortalized human bronchial epithelial cell line as a model for in vitro study of lung carcinogenesis

Suppression subtractive hybridization (SSH) was applied to identify differentially expressed genes in the SV40LT immortalized human bronchial epithelial cell line Y-BE, with normal human bronchial epithelial cells (HBEC) as a control. Two cDNA libraries of up- and downregulated genes were generated, comprising 218 known genes and 131 unknown genes in total. The expression of 22 clones from the 2 libraries was investigated by Northern blot analysis, and 86.4% (19/22) of them showed differential expression between Y-BE cells and HBEC. Although the Y-BE cells are nontumorigenic in nude mice, Comparative genomic hybridization (CGH) detected some DNA imbalances in Y-BE cells that were similar to lung cancer cells. Our data demonstrate that the studied cell line Y-BE and SSH is a reliable approach for identifying new genes that are associated with immortalization and early tumor development that may help to understand the pathogenesis of lung cancer.