侧群细胞在胃癌细胞株中的分布及其致瘤特性

目的 研究侧群细胞的致瘤特性及其在胃癌细胞株和胃癌组织中的分布.方法 用荧光激活细胞分选法分析SGC-7901、MKN28和BGC-823三种胃癌细胞株中的侧群细胞.取36只裸鼠,分为6组,将SOC-7901分离出的侧群细胞和非侧群细胞分别以每只500、5000、50 000的数量接种到裸鼠皮下,8周后观察成瘤情况.实时定量PCR检测胃癌组织和胃癌细胞株中三磷酸腺苷结合转运蛋白超家族成员G2(ABCG2)mRNA的表达,免疫组化法检测胃癌组织中ABCG2蛋白的表达.结果 SGC-7901细胞株中侧群细胞比例为1.0%,BGC-823为1.3%,MKN28则为阴性.从SGC-7901中分离的侧群细胞最少可成瘤细胞数是500/只,非侧群细胞为50000/只.胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823的ABCG2 mRNA相对量高于MKN28(分别为0.162、0.096和0.005).ABCG2 mRNA和蛋白在胃癌和胃炎组织中有不同程度的表达.结论 胃癌细胞株侧群细胞的致瘤能力明显强于非侧群细胞.在胃癌组织和部分胃炎组织中检测到ABCG2的表达,在胃癌细胞株中侧群细胞比例高的细胞株ABCG2表达高.     

人胃癌细胞株MGC-803侧群细胞的分选与生物学特征

目的 从人胃癌细胞株MGC-803中分离侧群(SP)细胞,研究其生物学特征.方法 利用流式细胞分选术(FACS)从MGC-803细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞亚群进行培养,采用克隆形成实验比较两组亚群细胞的体外增殖能力,NOD/SCID鼠成瘤实验检测两组亚群细胞体内成瘤能力.结果 FACS结果显示,细胞株MGC-803中SP细胞亚群占总细胞的0.3％ ～ 1.2％;SP细胞体外克隆形成率为(0.862±0.050)％,非SP细胞体外克隆形成率为(0.325 ±0.207)％,两者比较P＜0.05;SP细胞最低成瘤数量是1×103/只,非SP细胞为5×103/只.结论 人胃癌细胞株MGC-803中存在SP细胞,其生物学特性与干细胞基本符合.     

ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中的表达及意义

目的: 探讨干细胞标志物ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中表达的意义.方法: 应用免疫组化SP方法检测ABCG2在30例肝细胞性肝癌组织和8例癌旁肝硬化组织中的表达、分布, 并采用细胞免疫荧光技术检测ABCG2在两种肝癌细胞株HepG2、PLC/PRF/5中的表达, 采用流式细胞技术测试出两种细胞株中ABCG2阳性细胞的比例.结果: 免疫组化中, ABCG2阳性染色定位于癌细胞胞膜, 部分病例胞质也有分布. 免疫组化显示ABCG2在肝细胞性肝癌组织和癌旁肝硬化组织中的表达阳性率分别为63.33%(19/30)和25%(2/8). ABCG2蛋白在HepG2、PLC/PRF/5这两个肝癌细胞株中均有表达, HepG2中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质中, 而在PLC/PRF/5中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质和细胞膜上. PLC/PRF/5细胞株中, 通过流式细胞仪能检测出表达ABCG2的细胞( P<0.05), 而在HepG2细胞株中, 通过流式细胞仪不能检测出表达ABCG2的细胞.结论: ABCG2在肝细胞性肝癌的发生发展过程中可能起着非常重要的作用, 有可能成为临床治疗肝细胞性肝癌的分子靶标.     

人胰腺癌细胞系SW1990中肿瘤干细胞样侧群细胞的分离及生物学特性研究

目的 从人胰腺癌细胞系SW1990中分离肿瘤干细胞样侧群(side population,SP)细胞,并进一步研究其生物学特性.方法 细胞常规培养后应用Hoechst 33342和PI染色、荧光激发流式细胞仪检测并分选SP细胞,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪分析干细胞标志物CD133的表达,克隆平板测定细胞克隆形成能力,Western blot检测细胞ABC超家族成员G2(ABCG2)蛋白表达.结果 人胰腺癌细胞系SW1990中SP细胞比例为2.70%,可完全被维拉帕米阻断.培养9 d后,SP细胞的A492值为2.1,克隆形成率为(38.7±6.8)%,CD133阳性率为69.63%,均显著高于非SP细胞的0.5,(15.5±2.8)%,16.71%;SP细胞ABCG2表达也较非SP细胞强.结论 胰腺癌细胞系SW1990存在SP细胞.     

羟基喜树碱富集结肠肿瘤干细胞样群体的初步研究

背景:肿瘤干细胞是临床上肿瘤耐药的主要机制,识别并靶向肿瘤干细胞为肿瘤治疗的研究带来了新的思路。目的:探讨在体外以化疗药物富集结肠肿瘤干细胞样群体的可行性。方法:应用前期实验中以药物浓度递增诱导法建立的羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT,免疫荧光标记干细胞表面抗原CD133,Hoechst33342/PI双染流式细胞仪检测、分选侧群(SP)细胞,实时PCR检测干细胞相关和多药耐药相关基因表达。结果:亲代细胞株SW1116中CD133阳性群体和SP群体分别仅占2%和1%,耐药细胞株SW1116/HCPT中则高达7%和61%,多药耐药基因MDR1抑制剂维拉帕米可使两组SP群体均下降至接近0水平。SW1116/HCPT细胞SP群体中干细胞相关基因CD133、Nanog和多药耐药相关基因MDR1、MRP1、MRP2、MRP6 mRNA表达水平较非SP群体显著上调(P0.05)。结论:HCPT药物浓度递增诱导法可成功富集结肠肿瘤干细胞样群体,其SP亚群中存在于细胞相关和多药耐药相关基因高表达。     

三氧化二砷抗胃癌作用机制的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对人胃癌细胞株MKN-28抑制生长及诱导凋亡的生物学效应。方法采用光镜观察、溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)还原法、流式细胞仪(FCM)检测法检测As2O3在不同作用时间、不同给药浓度时对MKN-28细胞生长的影响。结果MKN-28细胞经As2O3作用后,细胞增殖受到明显抑制,而且呈浓度-作用时间依赖关系。流式细胞仪检测结果显示DNA直方图上出现典型的亚二倍体凋亡峰,细胞周期分析发现药物作用后MKN-28细胞的生长周期受到明显阻滞。结论As2O3既能有效地抑制人胃癌细胞株MKN-28的生长,又能诱导该细胞凋亡,而且呈浓度依赖性和作用时间依赖性。     

Kruppel样因子4在胃癌细胞中的表达及KLF4基因启动子区的生物信息学分析

目的检测Kruppel样因子KLF4基因在人胃癌细胞株MKN-45及人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1的表达情况,并应用生物信息学方法分析KLF4基因启动子区序列,预测胃癌发生中其涉及的转录调控因子。方法采用实时荧光定量PCR方法检测MKN-45及GES-1中KLF4mRNA的表达;利用多种在线软件获取并分析人KLF4基因启动子序列,预测其转录因子结合位点和胃癌组织中相关的转录因子。结果实时定量PCR检测结果显示:KLF4 mRNA在人胃癌细胞株MKN-45中的表达低于在人正常胃黏膜细胞株GES-1中的表达(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)(P<0.01);KLF4基因启动子序列全长为4 915 bp,共涉及183个转录因子结合位点,在胃癌中异常表达的转录因子有17个,包括AP-1、AP-2、HIF-1、SP3等。结论 KLF4 mRNA在胃癌细胞株MKN-45中表达下调,生物信息学分析提示在胃癌发生中AP-1、AP-2、HIF-1、SP3转录因子等可能参与调控KLF4的表达。     

阿霉素干预与肾上腺皮质癌干细胞标志物的表达

目的 探讨阿霉素(ADM)干预下人肾上腺皮质癌裸鼠模型干细胞标志CD133、ABCG2的表达及意义.方法 SW-13细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,ADM体内干预后原代培养获得ADM组细胞株,未予干预直接原代培养获得对照组细胞株.用单细胞成克隆技术检测细胞的增殖能力,免疫组化法和流式细胞法检测肿瘤干细胞标志物CD133、ABCG2的表达.结果 ADM组细胞株的克隆形成率高于对照组(P＜0.05);流式细胞法和免疫组化法提示ABCG2在两组细胞中均有阳性表达,ADM组细胞株的流式细胞表达率高于对照组细胞株(P＜0.05);以上两种方法均表明CD133在两组中阴性表达.结论 ADM组细胞具有一定的肿瘤干细胞特征,ABCG2参与肾上腺皮质癌细胞耐药机制,可能为分子靶向治疗的潜在靶点.     

靶向ING1基因的miR-622真核表达载体在胃癌细胞MKN-45中的鉴定及其功能

目的:研究构建靶向ING1基因的miR-622真核表达载体并验证其转染人胃癌细胞株MKN-45细胞后对ING1基因的干扰效果及其功能.方法:将外源性重组真核表达载体pSuper/miR-622转染到人胃癌细胞株MKN-45内,经G418筛选并建立高表达miR-622的稳定转染胃癌细胞株.稳定表达该miR-622的胃癌细...     

自噬基因Beclin1在人肺腺癌A549细胞系SP及非SP细胞亚群中的表达

目的探讨自噬基因Beclin1在人肺腺癌A549细胞系SP及非SP细胞亚群中的表达。方法用流式细胞学方法分选人肺腺癌A549细胞系中SP细胞及非SP细胞亚群,采用Western印迹方法检测Beclin1蛋白在SP细胞及非SP细胞亚群的表达情况。结果流式细胞学方法成功分选得到SP细胞及非SP细胞亚群,Western印迹检测Beclin1蛋白在SP细胞亚群中的相对表达量为2.795±0.090,在非SP细胞亚群中的相对表达量为3.048±0.124,两组表达量比较差异有统计学意义(t=5.220,P<0.05)。结论自噬相关基因Beclin1在人肺腺癌A549细胞系SP细胞亚群中的表达较非SP细胞下降,这可能与SP细胞亚群具有的肿瘤干细胞特性有关。     

Not All Side Population Cells Contain Cancer Stem-Like Cells in Human Gastric Cancer Cell Lines

Introduction

Side population (SP) cells may play a crucial role in tumorigenesis and the recurrence of cancer. Many kinds of cell lines and tissue have demonstrated presence of SP cells including different gastric cancer cell lines. However, is that true all SP cells contain cancer stem-like cells in gastric cancer cell lines?

Materials and methods

MKN-45 and BGC-823 cells labeled with Hoechst 33342 were chosen to obtain SP cells, then characterized the cancer stem-like properties of SP cells both in vitro and in vivo. Five stemness–related genes expression profiles, including OCT-4, SOX-2, NANOG, CD44 and ATP-binding cassette transporters gene ABCG-2, were tested in SP and MP cells using quantitative real-time RT-PCR. Western blot was chosen to show the difference of protein expression between SP and MP cells. When inoculated into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, SP cells from MKN-45 showed higher tumorigenesis tendency than MP cells, but SP cells from BGC-823 showed same tumorgenesis tendency as MP cells.

Conclusion

SP cells from MKN-45 possess cancer stem cell properties and proved that they were gastric cancer stem-like cells. SP cells from BGC-823 didn’t possess cancer stem cell properties and proved that not all SP cells contain cancer stem-like cells in gastric cancer cell lines.     

正常上皮细胞特异性基因甲基化在胃癌发病机制中的研究

目的探讨正常上皮细胞特异性-1基因（NES1）在胃正常卜皮细胞和胃癌细胞株中的表达及其受甲基化调控的影响。方法分别培养胃癌细胞株MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、AGS（中分化）、MKN-45（低分化）、HGC-27（未分化）和原代正常胃上皮细胞。提取细胞RNA，荧光定量PCR检测NES1在各细胞株中的表达。以不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂5＇-杂氮-2＇-脱氧胞嘧啶（5-azadC）处理胃癌细胞株，荧光定量PCR检测处理后NES1 mRNA表达。同时提取细胞基因组DNA，甲基化修饰后甲基特异性PCR（MSP）分析其CpG岛甲基化状态。结果NES1 mRNA在肿瘤细胞株中的表达较胃正常上皮细胞明显降低。甲基化检测显示，NES1在胃癌细胞株中均存在不同程度的外显子3CpG岛甲基化。NES1表达降低的胃癌细胞株经5-aza-dC去甲基化药物处理后NES1表达均有所上调。结论NES1在一些胃癌细胞株中的低表达与该基因外显子3CpG岛甲基化有关。5-aza-dC可使NESI表达降低的胃癌细胞株重新表达NES1 mRNA，再次证明了NES1基因在胃癌细胞株中的低表达与甲基化有关。NES1基因外显子3甲基化可能是胃癌细胞中NES1表达缺失的分子机制。     

胆汁酸对胃癌细胞株MKN-28生长的影响

胆汁反流是常见现象，其对胃上皮细胞生长的影响尚不明确。目的：探讨胆汁酸体外对胃癌细胞株MKN-28生长的影响。方法：采用Mr丌法测定不同浓度牛磺石胆酸钠（TLC）和甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）对胃癌细胞株MKN．28生长的影响。结果：第1-6d，60-300μmol／LTLC可明显抑制MKN-28细胞生长，且呈剂量依赖性。300μmol／LGCDC干预24h可显著抑制MKN-28细胞生长。结论：脂溶性胆汁酸TLC和水溶性胆汁酸GCDC体外均可直接抑制胃癌细胞生长。     

Angiotensin II Type 1 Receptor Expression in Human Gastric Cancer and Induces MMP2 and MMP9 Expression in MKN-28 Cells

Angiotensin II (Ang II), a main effector peptide in the renin–angiotensin system, acts as a growth-promoting and angiogenic factor via angiotensin II receptor1 (AT1R). In this study, we investigated the expression of angiotensin II type1 receptor (AT1R) in gastric cancer and the effects of Ang II on the expression of MMP2 and MMP9 in the human gastric cancer cell line MKN-28 cells. The expression of the Ang II type I receptor was examined by western and immunocytochemistry in gastric cancer cell lines and detected by real-time PCR and immunohistochemistry in normal and gastric cancer tissues. The expression of MMP2 and MMP9 were detected by real-time PCR and western after treatment with Ang II and/or AT1R antagonist. AT1R were expressed in all human gastric cancer lines and the expression of AT1R was significantly higher in cancer tissues than that in normal gastric tissues (P < 0.01). Furthermore, Ang II promoted the expression of MMP2 and MMP9 in MKN-28 cells, and the stimulatory effects of Ang II could be blocked by AT1R antagonist. These results suggest that AT1R is involved in the progression of gastric cancer and may promote the angiogenesis of gastric cancer cell line (MKN-28), and these effects may be associated with the upregulation of MMP2 and MMP9.     

15-PGDH抑制剂对人胃癌细胞生长和COX-2表达的影响

背景：15-羟基前列腺素脱氧酶（15-PGDH）是前列腺素生物降解的关键酶,对环氧合酶-2（COX-2）具有生理性拮抗作用,其表达减少和活性降低与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。目的：观察15-PGDH选择性抑制剂Cayl0397对人胃癌细胞生长、凋亡和COX-2表达的影响,探讨15．PGDH与COX-2在胃癌中的可能关系以及15-PGDH的抗肿瘤机制。方法：以不同浓度Cay10397干预人胃癌细胞株MKN-28,MTr实验和流式细胞分析检测细胞生长和凋亡情况;RT—PCR和蛋白质印迹法检测凋亡相关基因survivin、bax、bcl—xLmRNA表达以及15-PGDH、COX-2mRNA和蛋白表达。结果：Cayl0397在浓度大于2．5μmol／L、作用时间超过48h的条件下能促进MKN-28细胞增殖（P〈0．05）,但其对MKN-28细胞凋亡无明显影响。经5—20μmol／LCayl0397作用72h的MKN-28细胞,survivin、bcl-xLmRNA表达显著升高（P〈0．05）,baxmRNA以及15-PGDHmRNA和蛋白表达显著降低（P〈0．05）,COX-2mRNA和蛋白表达无明显变化。结论：抑制15-PGDH表达可促进人胃癌细胞增殖,但对COX-2表达无明显影响。15-PGDH可能通过下调抗凋亡基因survivin、bcl-xL表达、上调促凋亡基因bax表达而诱导人胃癌细胞凋亡。     

shRNA沉默干扰HMGA2基因对胃癌细胞株MKN-45的增殖与凋亡的影响

目的:观察小分子RNA(shRNA)沉默后HMG-A2基因在胃癌细胞株MKN-45的表达,并探讨HMGA2基因对胃癌细胞的增殖与凋亡的影响.方法:构建针对人HMGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45.用细胞免疫组化的方法观察转染72h后HMGA2的蛋白表达水平,以MTT比色法、流式细胞术检测转染后MKN-45细胞的生长增殖、凋亡的情况.结果:转染HMGA2-shRNA组的蛋白表达强度(171.34±19.61)明显弱于scrambled组(143.48±19.04)和空白对照组(141.79±18.09,P<0.05),较之scrambled组(5.66%±0.63%)和空白对照组,HMGA2-shRNA组(39.32%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05),HMGA2-shRNA组的凋亡率(39.67%±2.35%)与scrambled组(4.29%±1.33%)和空白对照组(5.05%±1.84%)相比明显增加(P<0.05).结论:靶向HMGA2基因的shRNA可以有效抑制人胃癌MKN-45细胞的生长,并促进细胞的凋亡,HMGA2可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.