白蛋白包裹微泡介导报告基因转染心肌细胞的实验研究

目的 探讨白蛋白包裹微泡在治疗超声照射下对基因传输的作用。方法 6孔板培养乳鼠心肌细胞，每孔加pcDNA3．1／His／Lacz质粒20μg，加或不加微泡，超声条件为连续波，频率2MHz，机械指数0．25～1．80，照射时间10～300s，48h后计算蓝染细胞百分率和β-半乳糖苷酶活性。结果 与单纯超声质粒组相比，含微泡组蓝染细胞率增加约7倍，报告基因表达定量增加近9倍。机械指数1．50～1．80，照射时间30s～1min，细胞转染效率最高，延长照射时间，转染效率无改变。结论 白蛋白包裹微泡在超声作用下能明显增加基因的传输效率，有可能作为基因治疗的载体。     

载基因微泡介导β-galactosidase质粒转染心肌细胞的对照研究

目的　观察不同的载基因微泡介导体外培养心肌细胞报告基因转染与表达,探讨微泡性质 与浓度在超声破裂微泡介导基因转染过程中的效应。方法　以β galactosidase质粒为报告基因,制备两 种不同性质的载基因微泡,利用诊断性超声破裂微泡进行体外心肌细胞基因转染,测定β galactosidase表 达水平并进行细胞活性检测。结果　超声载基因破裂氟烷气体微泡(PESDA)转染组心肌细胞β galactosidase表达约为单纯质粒转染组80倍(P<0.01),并在一定范围内随微泡浓度增加而增高。超声 破裂载基因PESDA转染组基因表达水平明显高于超声破裂载基因声振白蛋白微泡(ASDA)转染组(P< 0.05),而两组对细胞活性影响却无明显差异(P>0.05)。结论　超声微泡性质及浓度对超声破裂微泡介 导基因转染效率具有重要影响,低能量诊断性超声破裂载基因PESDA较超声破裂载基因ASDA能更为 有效地介导基因转染,是一种安全高效的基因传输方法。     

实时PCR定量分析体内基因转染效率的可行性

为了探索实时PCR技术评价基因转染效率的可行性，利用克隆PCR检测逆转录病毒载体介导的neo基因导入原代成肌细胞的转染效率，同时行实时PCR检测，对二结果进行对比分析；利用线性扩增介导的PCR(LAM—PCR)技术和逆转录病毒5’LTR插入细胞基因组位点的分析，确定单细胞内基因转染的拷贝数。结果显示：①在低转柒率的情况下(＜36％)二的结果相近，但是在高转染率情况下二的结果差别明显；②逆转录病毒载体介导的转染，在原代成肌细胞中为单拷贝基因导入基因组内。结论：实时PCR可以比较精确地估计体内病毒载体介导的基因转染效率；而在体外由于多为高转染率，不适合用此方法进行检测。     

提高逆转录病毒介导造血干细胞基因转染效率的研究策略

造血干细胞因其具有自我更新和多向分化能力而成为基因治疗的理想靶细胞,但由于逆转录病毒介导的造血干细胞基因转染效率低,外源基因表达时间短等,大大影响了造血干细胞基因治疗的临床应用。为克服上述难点,目前的研究策略主要集中在构建新型理想的逆转录病毒载体及从不同的方面优化转染体系,从而提高基因转染效率。     

脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞:筛选理想浓度

背景:siRNA转染是完成RNA干扰的关键一步.目前用于心肌细胞的RNA干扰技术多以质粒为载体转染长链shRNA,其步骤复杂.脂质体转染化学合成短链siRNA是一种操作简便,低毒高效的转染方法,将其应用于心肌细胞转染,有利于RNA干扰技术的推广应用.目的:筛选脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的最佳浓度,以及简单高效的RNA干扰操作方法.方法:应用脂质体siPORT~(TM)>NeoFX~(TM)转染试剂介导5,10,20,30 nmol/L的CY3-Negative siRNA转染心肌细胞,同时设立空白对照组,转染24 h后分别应用荧光显微镜,流式细胞仪检测转染效率和细胞凋亡率,筛选最优浓度.根据优化浓度转染PHB siRNA,48 h后检测蛋白表达验证转染效果.结果与结论:随CY3-Negative siRNA浓度的增加,在荧光显微镜下观察到激发出红色荧光的细胞比例随之增加,流式细胞仪检测出各组平均转染效率也依次增高(P＜0.05),其中30 nmol/L组转染效率最高(P＜0.05),而各实验组与空白对照组之间的细胞凋亡率差异无显著性意义(P＞0.05).将心肌细胞转染30 nmol/L的PHB siRNA,48 h后PHB蛋白表达平均下降74.11%(P＜0.05).实验结果表明,脂质体转染试剂siPORT~(TM) NeoFX~(TM)介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的理想浓度是30 nmol/L.     

GDNF基因体内转染对大鼠面神经损伤后的修复作用

目的：探讨胶质细胞源神经营养因子（GDNF）基因体内转染对大鼠面神经损伤后的修复作用，为基因治疗周围神经损伤提供依据。方法：用脂质体介导pEGFP—GDNF cDNA基因转染受损面神经所支配的面肌，计算损伤侧面神经元的存活率。观察动物触须节律性拂动的恢复情况，检测修复神经的传导速度。结果：面神经损伤后第7d、14d、21d和28d时间段，对照组面神经运动神经元的存活率分别为93．06％、76．06％、72.38％和70．69％，转染组分别为94．00％、84．00％、79．25％和78．06％。转染组第10．4±1．3d鼠触须开始拂动，18．5±1．3d节律性拂动基本恢复正常；对照组13．5±1．2d触须开始拂动，27．3±1．0d节律性拂动基本恢复正常。转染组神经干传导速度恢复率快于对照组。结论：面神经损伤后经脂质体介导GDNF基因体内转染靶器官后，对受损面神经的修复有促进作用。     

siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用

基因阻断技术近年来发展迅速，已成为分子生物学研究的主要技术手段之一。1RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。RNAi最初发现于某些植物中，随后在线虫、果蝇、斑马鱼中相续发现存在RNAi现象。最近，在哺乳动物细胞中的研究也取得满意结果。RNAi作为新兴的基因阻断技术，在人类基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。     

大量心包积液心包腔内置管术的护理

大量心包积液病人往往出现胸闷、气急、端坐呼吸、咳嗽等症状,以往多采用反复心包穿刺抽液或注入药物治疗,但此方法危险性大,病人痛苦。2002年1月～2003年12月,我科对35例大量心包积液病人采用中心静脉导管进行心包腔内置管术及腔内注入药物治疗,取得较好疗效,安全性高,现将有关护理报告如下。     

聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因修复老年大鼠的股骨骨折

目的：为避免病毒载体带来的安全隐患，利用新型的非病毒载体聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因，观察其对老年大鼠骨折愈合过程的影响，以寻找能够有效促进老年骨折愈合的基因治疗方法。 方法：实验于2006—04／2007—04在解放军第二军医大学细胞生物学实验室和实验动物中心完成。①实验分组：取雄性SD大鼠24只，其中20月龄18只随机分为基因治疗组、生理盐水组和空白对照1组3组，4月龄6只为空白对照2组。②实验方法：所有大鼠建立股骨骨折模型，1周后基因治疗组骨折断端经皮注射聚乙烯亚胺和骨形态发生蛋白7基因转染试剂250μL，生理盐水组断端经皮注射相同体积生理盐水，其他2组不加处理。③观察指标：骨折第8周摄X射线片，然后取标本行组织病理切片、I型胶原免疫组化染色，观察各组骨折愈合情况。 结果：24只大鼠均进入结果分析。骨折第8周4月龄大鼠骨折基本愈合，3组老年大鼠骨折均未完全愈合，但X射线片、苏木精-伊红染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色结果显示，与生理盐水组和空白对照1组相比，基因治疗组骨痂明显增多、骨痂骨化过程提前，Ⅰ型胶原染色深、面积较大，说明愈合速度加快、愈合能力改善。 结论：20月龄老年大鼠骨折愈合过程明显延缓，聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白7基因体内转染的方法可以增强老年大鼠骨折修复能力、促进老年大鼠骨折愈合。     

c-fos反义基因转染对缺血缺氧心肌细胞的保护作用

目的：探讨c-fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用.方法：实验于2002年在第三军医大学西南医院烧伤研究所完成.Wistar大鼠125只,正常对照组15只：未经缺血缺氧处理;非转染组45只：10%烧伤大鼠血清＋缺氧（体积分数为0.01的氧）;转染组45只：先转染,然后[10%烧伤大鼠血清＋缺氧（体积分数为0.01的氧）]处理.转染组和非转染组均按照时相点不同又分为1,3,7 h三个时相点组,每组15只.烧伤血清采自30%全身体表面积Ⅲ度烫伤Wistar大鼠（20只）.采用含体积分数为0.01氧的混和气体作为缺氧模型,采用基因重组技术构建c-fos反义基因重组体,由脂质体胺试剂介导心肌细胞转染,缺氧复合烧伤血清处理后1,3,7 h不同时相点采用反转录-多聚酶联反应检测c-fos mRNA的表达变化,检测c-fos蛋白、肌钙蛋白-T和β-微管蛋白的表达变化采用蛋白免疫印迹法.结果：105只大鼠进入结果分析.对照组、转染组1,3,7 h三个时相点及非转染组1,3,7 h三个时相点各15只,另外20只用于制备烧伤血清.①c-fos蛋白表达：非转染组显著表达,3 h达到最高峰,非转染组高于转染组（46.3&;#177;3.06,34.3&;#177;2.06,P＜0.01）.②肌钙蛋白-T和β-微管蛋白的表达：与正常对照组比较,非转染组肌钙蛋白-T和β-微管蛋白表达显著下降,7 h降至最低水平,非转染组低于转染组（肌钙蛋白-T：25.1&;#177;3.06,34.3&;#177;2.06;β-微管蛋白：44.8&;#177;3.17,66.5&;#177;3.14,P＜0.01）.结论：缺氧复合烧伤血清处理产生的c-fos会引起心肌细胞损伤,当在缺氧复合烧伤血清处理前转染c-fos反义基因后,心肌细胞肌钙蛋白-T和β-微管蛋白表达较单纯缺氧复合烧伤处理心肌细胞显著回升,表明c-fos反义基因转染能有效抑制心肌细胞肌钙蛋白-T和β-微管蛋白的表达下降,从而对缺血缺氧心肌细胞起保护作用.     

Ultrasound-mediated transfection of canine myocardium by intravenous administration of cationic microbubble-linked plasmid DNA.

We tested the hypothesis that targeted disruption of cationic microbubble-linked plasmid DNA, using diagnostic ultrasound, may aid transfection of large animal myocardium. Plasmid DNA encoding for CAT (pCAT, chloramphenicol acetyltransferase) was bound to a novel cationic microbubble containing MRX-225 for intravenous administration, and 16 dogs in 4 groups variously received this conjugate or plasmid only, or were exposed to ultrasound. Histochemical staining and enzyme-linked immunosorbent assay analysis showed CAT activity in the myocardium of only those animals that received microbubble-linked DNA and were exposed to ultrasound. Thus, disruption of cationic-linked, low-dose plasmid systems by diagnostic ultrasound may facilitate transfection of large animal hearts.     

改良载体提高大鼠成肌细胞移植效率

目的:观察含1g/L透明质酸钠的F12培养基能否提高成肌细胞移植效率和促进组织修复。方法:实验于2003-9/2004-10在四川大学华西医院修复重建实验室完成。①选取5月龄SD大鼠84只,建立胫前肌的深度冻伤的动物模型。②术后第10天,再次手术暴露冻伤肌组织。随机分为4组:取42只,左侧胫前肌注射以含1g/L透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞为左侧成肌细胞组;右侧胫前肌注射以F12培养基为载体的成肌细胞为右侧成肌细胞组;另42只,左侧注射含1g/L透明质酸钠的F12培养基溶液为培养液组;右侧不予注射为空白组。③各组分别于术后第2,5,9天,2,4,8,12周取材观察肌质量变化及组织学改变;于术后第2,5,9天进行磷酸肌酸激酶及同工酶测试。结果:84只大鼠均进入结果分析。①各组胫前肌肌质量变化:术后第2天和第5天,空白组肌质量最轻(P<0.05),其余组间差异无显著性(P>0.05)。术后第9天及第2,4,8,12周,左、右侧成肌细胞组肌质量明显高于培养液组和空白组(P<0.05),而左、右侧成肌细胞组之间、培养液组和空白组之间差异无显著性(P>0.05)。②组织学观察:两组移植细胞均分化形成肌纤维,参与组织修复。透明质酸钠还促进早期小血管的再生。③磷酸肌酸激酶及磷酸肌酸激酶同工酶含量:运用两种载体的成肌细胞移植,冻伤组织中的磷酸肌酸激酶及同工酶活性明显增高(P<0.05),显示移植细胞在冻伤局部增殖、分化参与受损组织的修复,以含透明质酸钠溶液为载体的移植组成肌细胞参与修复的总体活性较高。结论:成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用,以透明质酸钠的溶液为载体可以提高成肌细胞移植效率。     

改良载体提高大鼠成肌细胞移植效率

目的：观察含1g／L透明质酸钠的F12培养基能否提高成肌细胞移植效率和促进组织修复。方法：实验于2003—9／2004—10在四川大学华西医院修复重建实验室完成。①选取5月龄SD大鼠84只，建立胫前肌的深度冻伤的动物模型。②术后第10天，再次手术暴露冻伤肌组织。随机分为4组：取42只．左侧胫前肌注射以含1g／L透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞为左侧成肌细胞组；右侧胫前肌注射以F12培养基为载体的成肌细胞为右侧成肌细胞组；另42只，左侧注射含1g／L透明质酸钠的F12培养基溶液为培养液组；右侧不予注射为空白组。③各组分别于术后第2，5，9天，2，4，8，12周取材观察肌质量变化及组织学改变；于术后第2，5，9天进行磷酸肌酸激酶及同工酶测试。结果：84只大鼠均进人结果分析。①各组胫前肌肌质量变化：术后第2天和第5天，空白组肌质量最轻（P〈0．05），其余组间差异无显著性（P〉0．05）。术后第9天及第2，4，8，12周，左、右侧成肌细胞组肌质量明显高于培养液组和空白组（P〈0．05），而左、右侧成肌细胞组之间、培养液组和空白组之间差异无显著性（P〉0．05）。②组织学观察：两组移植细胞均分化形成肌纤维，参与组织修复。透明质酸钠还促进早期小血管的再生。③磷酸肌酸激酶及磷酸肌酸激酶同工酶含量：运用两种载体的成肌细胞移植，冻伤组织中的磷酸肌酸激酶及同工酶活性明显增高（P〈0．05），显示移植细胞在冻伤局部增殖、分化参与受损组织的修复，以含透明质酸钠溶液为载体的移植组成肌细胞参与修复的总体活性较高。结论：成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用，以透明质酸钠的溶液为载体可以提高成肌细胞移植效率。     

The effects of plasmid copy number and sequence context upon transfection efficiency.

It is known that large P1 artificial chromosome (PAC) vectors exhibit reduced transfection efficiency in comparison to small plasmid vectors. We investigated the dynamics of this effect, by comparing expression from a small plasmid (4.7 kb) and a PAC vector (111 kb) containing the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) reporter gene under the control of a P(CMV) promoter. EGFP expression was detected by fluorescence activated cell sorting (FACS). We found that the lower transfection efficiency of PAC vectors represents both a smaller percentage of cells expressing the transgene, and a lower level of expression per cell. We have shown that the lower number of plasmid molecules administered per cell in a PAC transfection does not explain this effect, and that this effect does not act in trans. Surprisingly, dilution of a reporter construct with an irrelevant plasmid did not appear to compromise transfection efficiency; in fact, a dilution of 1/10 slightly enhanced transfection. Therefore, it seems that the plasmid content of a liposome-DNA complex need not be 100% reporter construct for optimum transfection efficiency. This discovery has potential practical utility in a number of applications.     

Enhanced nuclear import and transfection efficiency of plasmid DNA using streptavidin-fused importin-beta.

In order to enhance the nuclear import of exogenous genes, novel plasmid DNA/importin-beta conjugates, which consist of a biotinylated plasmid DNA and a recombinant streptavidin-fused importin-beta, were prepared. The spacer length between plasmid DNA and biotin and the number of introduced biotin were adjusted. The microinjection of plasmid DNA/importin-beta conjugates into the cytoplasm of NIH3T3 cells resulted in the nuclear localization of conjugates and the higher expression efficiency, compared to intact plasmid DNA alone. These results indicate that plasmid DNA/importin-beta conjugates would be an important tool to enhance the nuclear localization of exogenous DNA in non-viral gene delivery system.     

Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances naked plasmid DNA transfection in rabbit Achilles tendons in vivo

The study was to investigate the probability of increasing the transfection of the gene in tendons by ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD), and to search for the most suitable transfection conditions. A mixture of microbubbles and enhanced green fluorescent protein (EGFP) plasmids was injected into rabbit Achilles tendons by different administration routes and the tendons were ultrasound pulse by different ultrasonic conditions in order to determine the most appropriate conditions. Then, the rabbits were divided into four groups: (1) ultrasound + microbubbles + plasmid; (2) ultrasound+ plasmid; (3) microbubble + plasmid; (4) plasmid only. EGFP expression in the tendons and other tissues, and the damage to tendon and paratenon were all observed. The results showed that EGFP expression in the tendon was higher by ultrasound pulse with 2 W cm(-2) of output intensity and a 20% duty cycle for 10 min. Local injection was determined to be the better administration route. Among the four groups, EGFP expression in Group 1 was higher than that in other groups. EGFP expression was highest on seventh day, then it gradually decrease over time, and lasted more than 56 days. EGFP expression was not found in other tissues. There was no obvious injury caused by UTMD. Under suitable conditions, it is feasible to use UTMD as a safe and effective gene transfection therapy for tendon injuries.     

Beta-amino ester polymers facilitate in vivo DNA transfection and adjuvant plasmid DNA immunization.

Increased in vivo expression of intramuscularly delivered plasmid DNA will be essential for clinical success in gene therapy and plasmid DNA vaccination. We screened polymers from a library of beta-amino esters for their ability to augment transgene expression as measured by beta-galactosidase activity and cellular immune responses. Among the candidates identified in this screen, poly[(1,6-di(acryloxyethoxy)hexane)-co-(4-aminobutanol)] enhanced plasmid DNA transgene expression by sevenfold (P=0.0001) and its immunogenicity by 70% (P=0.03). We found that polymers with moderately hydrophobic backbones and terminal alcohol groups facilitated transfection most effectively in vivo. We also observed a log-linear correlation (R2=0.93) between peak cellular immune responses and transgene activity in all evaluated polymer-plasmid DNA formulations, clarifying the relationship between immunogenicity and the quantity of expressed antigen.     

超声微泡介导EGFP 质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

目的探讨不同浓度的超声微泡造影剂，在不同声强的超声辐照下，介导DNA质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移奠定基础。方法将培养的RB细胞分别予以超声条件为0．25，0．5，0．75，1．0，1．25W／cm^2，60S的连续波辐照，微泡造影剂浓度为1％，100．4，20％，30％，以筛选出对RB细胞活性无明显抑制的最适超声声强、辐照时间和微泡浓度。根据以上筛选条件，转染EGFP基因入RB细胞，24～48h后，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，并用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测。结果声强〈0．75W／cm^2（60s），以及微泡浓度〈20％时，对RB细胞的活性无明显抑制。当微泡浓度10％，超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2时，介导的DNA质粒对RB细胞转染具有较高的转染效率，明显高于其他实验组。超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2介导的转染效率，在统计学上差异无显著性意义。结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪

目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题.实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应.方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成.①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.大肠杆菌JM109由本室保存.转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品.②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/L G418,确定G418杀死所有细胞的最低浓度(C0).采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率.培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况.结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快.②当G418浓度为600 mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0.③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%.④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布.结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果.