Foxc2稳定转染对C3H10T1/2细胞成骨性能的影响

目的:探讨Foxc2基因过表达对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞系C3H10T1/2细胞生物学行为及分化能力的影响.方法:通过慢病毒转染构建Foxc2过表达C3H1OT1/2细胞系,采用实时定量PCR和Western免疫印迹法检测转染后Foxc2蛋白的表达.应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,实时定量PCR和Western免疫印迹法检测过表达Foxc2对成骨、成脂相关基因(Runx2、OPN、OCN、PPARγ)表达的影响,分别通过碱性磷酸酶(ALP)染色和油红染色检测细胞成骨和成脂分化能力.采用SPSS 17.0软件包对数据进行t检验.结果:成功构建Foxc2稳定过表达的C3H10T1/2细胞系,发现Foxc2过表达阻滞细胞于G1期,抑制细胞增殖.在成骨诱导过程中,过表达Foxc2可以显著上调Runx2、OPN、OCN等成骨相关基因的表达.ALP染色显示,Foxc2稳定过表达细胞较对照组细胞染色深.在成脂诱导过程中,过表达Foxc2显著下调PPARγ基因的表达;油红染色显示,成脂分化进程被部分抑制.结论:Foxc2过表达抑制细胞增殖,促进细胞分化.其机制是上调Runx2、OPN、OCN成骨相关基因的表达,下调PPARγ的表达,促进C3H10T1/2细胞的成骨分化,抑制其成脂分化.     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

重组人釉原蛋白及猪釉基质蛋白对人骨髓基质细胞成骨作用的比较

目的比较全长重组人釉原蛋白（recombinant human amelogenin, rhAm）和猪釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）体外诱导人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）成骨分化的作用,探讨rhAm促进hBMSCs成骨的调控机制,为rhAm临床应用提供理论依据。方法经诱导表达并纯化得到25 kDa全长rhAm;利用乙酸法提纯猪EMPs,体外原代培养hBMSCs。采用实时定量PCR及Western印迹法检测不同时间点rhAm和EMPs作用hBMSCs后成骨因子（Runx2、ALP、COL-I）的变化,观察时效关系。采用碱性磷酸酶和茜素红染色检测2种蛋白对hBMSCs成骨矿化作用的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果体外培养获得原代hBMSCs。实时定量PCR、Western印迹及细胞染色结果表明,10 μg/mL rhAm和200 μg/mL EMPs均可明显促进hBMSCs中成骨相关因子的基因及蛋白表达,且这种效果和蛋白作用时间有一定相关性。结论rhAm与EMPs均能明显促进hBMSCs成骨,作用效果具有一定的时间依赖性。     

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。     

姜黄素通过调控Wnt通路改善牙周膜干细胞成骨分化能力

目的:探讨姜黄素对人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响。方法:取第4~6代的PDLCs进行实验,用CCK-8实验检测姜黄素对PDLCs增殖活性影响,通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节染色以及ALP、OCN和Runx2等成骨相关基因的表达水平来探讨姜黄素对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响,同时检测姜黄素对经典Wnt通路及其配体的影响。结果:姜黄素对PDLSCs的增殖能力无影响。与对照组相比较,姜黄素能增加PDLSCs的ALP活性、上调ALP、OCN和Runx2等成骨相关基因的表达、增加矿化结节数量(P<0.05)。姜黄素能阻断Wnt信号通路,但加入Wnt信号通路激动剂(氯化锂)后,PDLSCs的成骨分化能力显著下降。结论:姜黄素能通过抑制Wnt信号通路,增强牙周膜干细胞成骨分化能力。     

不同来源骨髓间充质干细胞成骨能力的比较

目的 比较人不同来源骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的骨向分化能力,为骨组织工程筛选种子细胞提供一定的理论基础.方法 体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JMMSCs);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨来源骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs).流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记,成骨分化诱导后茜素红染色检测细胞矿化能力,成骨分化诱导后qRT-PCR及Western Blot检测细胞成骨相关分子:Runx2、1型胶原(Collagen Type 1,COL-1)、OCN.结果 JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD90、CD105,阴性表达CD34、CD14、CD45.成骨分化诱导21 d后,茜素红染色显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs.成骨诱导7 d、14 d、21 d后,JMMSCs成骨相关分子在基因和蛋白水平上均强于BMMSCs.结论 与BMMSCs相比,JMMSCs成骨分化能力较强,颌骨骨髓可能更适于用作骨组织工程的成体干细胞来源.     

miR-335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响

目的 体外研究大鼠牙囊干细胞成骨分化能力,以及miR 335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响。 方法 双向差速法体外分离培养大鼠牙囊干细胞,进行成骨诱导。用茜素红染色检测成骨分化的能力,进而用qRT-PCR检测miR-335的表达,并且在瞬时转染miR-335 mimics和inhibitor后成骨诱导,用PCR和Western Blot的方法检测成骨能力的改变。 结果 双向差速法培养的牙囊干细胞具有成骨样细胞分化能力。成骨诱导的牙囊干细胞中miR-335表达降低,转染mimics后成骨能力降低,转染inhibitor后成骨能力升高。 结论 在体外条件miR-335可以抑制牙囊干细胞成骨分化。     

同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞生物学性能的比较

目的：比较同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞的生物学性能。方法：分别分离培养同一个体来源正常牙周膜干细胞（hPDLSCs）及炎性牙周膜干细胞（i－hPDLSCs）。流式细胞仪鉴定两种干细胞表面抗原标记;MTT法、克隆形成率检测并比较两者的增殖能力;茜素红染色及油红O染色检测并比较其分化能力;RT－PCR检测成骨相关基因COL－1、Runx－2、BSP－mRNA及成脂相关基因LPL与PPAR γmRNA的表达水平。结果：i－hPDLSCs及hPDLSCs均具有间充质干细胞特性,i－hPDLSCs增殖能力强于hPDLSCs,但分化能力明显弱于hPDLSCs（P＜0．05）;两者成脂能力比较无统计学差异（P＞0．05）。结论：炎症微环境对牙周膜干细胞的生物学性能有一定的影响。     

miRNA-31对糖尿病小鼠来源骨髓间 充质干细胞体外成骨分化的影响

目的:探讨miRNA-31这一微小RNA对糖尿病小鼠来源骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成骨分化的影响。方法:采用高糖高脂饮食加链脲佐菌素腹腔注射诱导建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型,造模8周后,在体外原代分离培养BMSCs,检测其miRNA-31和成骨分化情况,并与正常对照组比较。再将糖尿病小鼠来源的BMSCs体外分别转染miRNA-31模拟物和miRNA-31抑制剂,再检测比较2种BMSCs的体外成骨分化能力。结果:糖尿病小鼠造模成功8周后,micro CT检测结果显示与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠明显骨密度降低,呈现典型骨质疏松。将糖尿病小鼠来源BMSCs体外培养后,发现与对照组相比,其成骨分化能力降低,miRNA-31表达升高。而转染miRNA-31抑制剂后可部分解除糖尿病微环境对BMSCs成骨分化的抑制。结论:糖尿病微环境下BMSCs高表达miRNA-31,并可抑制BMSCs的成骨分化。     

不同管径二氧化钛纳米管对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的:研究不同管径二氧化钛纳米管(TNTs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学行为的影响。方法:阳极氧化法分别制备管径30、100和200 nm的TNTs,MTT法检测细胞在材料表面粘附及增殖情况,碱性磷酸酶活性、胶原分泌量和细胞外基质矿化水平检测来评估细胞的成骨分化能力。结果:30 nm的TNTs促进BMSCs的早期粘附和增殖,但是其后期细胞增殖和成骨分化能力同对照组相比没有明显的统计学差异;200 nm的TNTs明显促进了BMSCs的成骨分化,但是其细胞粘附和增殖明显受到了抑制;100 nm的TNTs上BMSCs的早期粘附和增殖受到了轻微的抑制,但是随着时间的推移,其细胞增殖迎头赶上,而且其成骨分化能力显著大于对照组。结论:最适BMSCs生物学活性的应该是100 nm的TNTs。     

Evaluation of Biocompatibility and Osteogenic Potential of Tricalcium Silicate–based Cements Using Human Bone Marrow–derived Mesenchymal Stem Cells

Introduction

The success of endodontic regeneration lies in the appropriate combination of stem cells and bioactive materials. Several novel dental materials are available on the market in this regard. Hence, the current study aimed to evaluate the proliferation, differentiation, and osteogenic potential of human bone marrow–derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) onto biomaterials like ProRoot MTA (MTA; Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK), Biodentine (BD; Septodont, Saint Maur de Fosses, France), and EndoSequence Root Repair Material (ERRM; Brasseler USA, Savannah, GA).

兔骨髓干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较

目的:评价两种不同来源的间充质干细胞,即骨髓干细胞(BMSC)和脂肪干细胞(ADSC)的体外成骨能力,为其将来应用于细胞治疗和组织工程研究提供一定的理论依据。方法:分别取同一只兔的髂骨骨髓和腹股沟脂肪作为BMSC和ADSC的来源,分离培养后比较成骨、成脂分化潜能,细胞表面抗原标记物;成骨诱导后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR分析其成骨相关基因的表达情况。结果:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能;在成骨诱导分化后,BMSC有较高的ALP活性和较多的钙结节形成。RT-PCR结果显示:BMSC表达较高的BMP-2、OCN和OPN等成骨基因。结论:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能,ADSC有较好的成脂分化能力,BMSC有较好的成骨分化能力;两者都可以作为组织工程的种子细胞。     

Epigenetic regulation of osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in periodontitis

Periodontitis is an inflammatory disease characterized by alveolar bone loss. Periodontal ligament stem cells (PDLSCs) have osteogenic differentiation potential, which can be influenced by epigenetics regulation in periodontitis. Therefore, this review aimed to shed light on the role of different epigenetic mechanisms in the osteogenic differentiation of PDLSCs and to consider the prospects of their possible therapeutic applications in periodontitis. Databases MEDLINE (through PubMed) and Web of Science were searched for the current knowledge of epigenetics in osteogenic differentiation of PDLSCs using the keywords “periodontal ligament stem cells”, “epigenetic regulation”, “epigenetics”, “osteogenic differentiation”, and “osteogenesis”. All studies introducing epigenetic regulation and PDLSCs were retrieved. This review shows that epigenetic factors like DNMT, KDM6A, HDACi, some miRNAs, and lncRNAs can induce the osteogenic differentiation of PDLSCs in the noninflammatory microenvironment. However, the osteogenic differentiation of PDLSCs is inhibited in the inflammatory microenvironment through the upregulated DNA methylation of osteogenesis-related genes and specific changes in histone modification and noncoding RNA. Epigenetics of osteogenic differentiation of PDLSCs in inflammation exhibits the contrary effect compared with a noninflammatory environment. The application of epigenetic drugs to regulate the abnormal epigenetic status in periodontitis and focus on alveolar bone regeneration is promising.     

大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

外泌体在骨髓间充质干细胞骨向分化及其在牙周再生中的研究进展

外泌体是多种细胞在生理或病理状态下分泌到细胞外的纳米级囊泡,富含蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质,是细胞间信息交流传递和物质交换转移的重要介质。研究证实,外泌体可通过蛋白、miRNAs等调控干细胞的增殖、分化,在免疫应答、炎症反应等过程中均发挥重要的调节作用。本文就炎性环境下不同细胞来源的外泌体生物学性能及其在成骨分化中的作用作一综述,以期为牙周炎所致骨缺损的治疗方法提供参考。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

Tricalcium silicate cements: osteogenic and angiogenic responses of human bone marrow stem cells

Tricalcium silicate cements (TSCs) are used in endodontic procedures to promote wound healing and hard tissue formation. The aim of this study was to evaluate and compare the effect of commonly used TSCs [mineral trioxide aggregate (MTA), Biodentine, and TotalFill] on cellular metabolism and osteogenic/angiogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) in vitro. We tested the null hypothesis of no difference between MTA, Biodentine, and TotalFill in stem cell responses. Cells were subjected to eluates of the tested materials for up to 14 d. Cell viability was evaluated using the 3‐(4,5‐dimethyl‐thiazoyl)‐2,5‐diphenyl‐tetrazolium bromide (MTT) assay. Real‐time PCR was used to determine the levels of expression of the osteogenic factors alkaline phosphatase (ALP), osteoprotegerin (OPG), osteocalcin (OC), and collagen 1A (COL1A1), and the angiogenic factors vascular endothelial growth factor A (VEGFA) and fibroblast growth factor 1 (FGF1). ELISAs were used to measure the levels of VEGFA and ALP in culture supernatants. Mineralization in vitro of hBMSCs was assessed using Alizarin Red staining. The hBMSCs tolerated exposure to TSCs well, with Biodentine showing the most favorable effect on cell viability. Expression of ALP, COL1A1, OPG, and VEGFA were differentially affected by the materials, with Biodentine and TotalFill inducing earlier changes at gene level. Increased mineralization was observed with time, after exposure to all TSCs tested, with MTA showing the greatest effect. The results revealed different responses of hBMSCs to TSCs in vitro.