16S—23S rDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆？…

目的 从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立ＰＣＲ结合ＤＮＡ探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案。方法 根据偶然分支杆菌１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用ＰＣＲ扩增、ＲＦＬＰ和ＤＮＡ斑点杂交技术,对２９例偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定。结果 ２９例偶然分支杆菌临床分离株均被ＰＣＲ扩增出一条约４７０ｂｐ的ＤＮＡ条带,ＤＮＡ探针杂交也出现特     

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的研究以16S-23S rDNA内转录间隔区(intemal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种.方法应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株.结果分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp～450bp范围DNA片段.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的.5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平.结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值.     

16s～23s rDNA间隔区序列聚合酶链反应鉴定术后龟分支杆菌暴发感染

目的　从基因水平上确认深圳市某医院术后暴发感染的致病菌,并建立一套快速的ＰＣＲ方法鉴定龟分支杆菌脓肿亚种。方法　根据分支杆菌的１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成一对引物和龟分支杆菌脓肿亚种ＤＮＡ探针,采用ＰＣＲ 和ＤＮＡ 斑点杂交技术,对５３ 株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ杂交。在此基础上,采用１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增体系检测２５９份临床标本,对部分标本做ＤＮＡ探针斑点杂交反应。结果　５３ 株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株均被扩增出一条特异的３８０ ｂｐ ＤＮＡ 带和出现特异的杂交斑点。２５９ 份临床标本,ＰＣＲ 扩增阳性率为６０－６％ 。结论　在基因水平上确认此次引起院内术后暴发感染的致病菌为龟分支杆菌脓肿亚种。１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增检测体系灵敏、特异,能鉴定龟分支杆菌。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

复方PCR用于分支杆菌菌种鉴定的初步研究

目的　寻找新的、快捷简便的分支杆菌菌种鉴定技术,进一步提高临床结核病诊断的水平。方法 将3套分支杆菌基因组DNA的不同标记引物同时放入一个体系中,并在同一退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对已知标准株和部分临床株进行菌种鉴定。结果 复方PCR方法可将结核复合群中的结核分支杆菌、牛结核分支杆菌与非结核分支杆菌一次性地区分开,特异性达到100%,灵敏度为10ng/反应。结论 复方PCR技术是一种有效而又简捷的分支杆菌诊断方法,可用于临床上分结核与非结核分支杆菌或分支杆菌与非分支杆菌的初步区分。     

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记,制成250bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对90份结核病人,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为100pg。rDNA探针与受试24种分枝杆菌和11种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交,特异性较高。而rDNA探针对90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为80.2%,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64%)。rDNA探针与30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的　应用PCRSSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25株结核分支杆菌敏感分离株用PCRSSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株(87.5%)rpoB基因,19株(59.3%)KatG基因和23株(71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H₃₇Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H₃₇Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究

目的　建立聚合酶链反应 -增强化学发光法 (polymerase chain reaction-enhanced chemilumine cence ,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法。方法 以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针 ,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交。结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fgDNA分子。ECL体系灵敏度为0.5pgDNA分子。采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌。结论 建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成。     

16s—23srDNA间隔区序列聚合酶链反应鉴定术后龟分支杆 …

目的 从基因水平上确认深圳市某医院术后暴发感染的致病 ,并建立一套快速的ＰＣＲ方法鉴定龟分支杆菌脓肿亚种。方法根据分支杆菌的１６￣２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列,设计合成卫对引物和龟分支杆菌脓肿亚种ＤＮＡ探针,采用ＰＣＲ和ＤＮＡ斑点杂交技术,对５３株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ杂交。在此基础上,采用１６￣２３ｓｒＤＮＡＰＣＲ扩增体系检测２５９份标本,对部分标本做ＤＮＡ探针斑点杂交反     

应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株。结果分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交。应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符。结论应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值。     

联合应用表型分析、热休克蛋白65限制性片段长度多态性分析和测序鉴定养鱼水中的非结核分枝杆菌

目的了解养鱼水中非结核分枝杆菌(NTM)的分布情况。方法采集30份市售养鱼水标本,通过分离培养和生化反应初步鉴定,然后从培养菌落中提取DNA,PCR扩增65kD分枝杆菌抗原,扩增产物:(1)分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(PRA);(2)直接测序。结果30份市售养鱼水中29份样本分枝杆菌培养阳性,其中6份样本分别生长出两种形态性状完全不同的菌落,共分离出35株分枝杆菌,表型特征均符合NTM。理化性质、PRA和测序鉴定发现,戈登分枝杆菌8株(23%)、龟-偶然分枝杆菌复合群8株(23%)、日内瓦分枝杆菌9株(26%)、不产色分枝杆菌1株,其余9株未鉴定到种。结论NTM广泛存在于市售养鱼水中,分子生物学方法与常规细菌学鉴定可互相补充,提高鉴定的正确性。     

结核分枝杆菌Km基因突变与耐卡那霉素药物的研究

目的　分析结核分枝杆菌(T.M)耐卡那霉素(KM)和(Km)基因突变情况。方法 通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析127株分枝杆菌临床分离株耐KM情况和Km基因的变化。结果 药敏试验卡那霉素耐药率为35.4%(45/127),127株分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。45株耐卡那霉素分离株中,12株(26.6%)Km基因SSCP泳动异常。结论 T.M对抗结核二线药物中的KM药物已出现耐药,其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的Km基因突变所致。     

PCR测序和基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种的应用研究

目的 评价2种分枝杆菌菌种快速鉴定方法的临床应用价值。方法 分别用16S～23S rDNA转录间隔序列（ITS）PCR-直接测序和基于16S rRNA基因的基因芯片检测21株分枝杆菌标准菌株和50株临床分离株。结果 21株分枝杆菌标准株中,ITS PCR测序法将18株准确鉴定到种,结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌菌株只能鉴定到结核分枝杆菌复合群,海分枝杆菌无法鉴别是海分枝杆菌还是溃疡分枝杆菌;芯片法正确鉴定16株,1株胃分枝杆菌鉴定为堪萨斯分枝杆菌,3株不在芯片检测范围内。50株临床菌株中, 47株2种方法结果一致,1株不在芯片检测范围内。结论 基因芯片鉴定分枝杆菌快速、特异,准确性高,临床常规开展应用需要进一步研究。     

延边州结核分枝杆菌DNA指纹图谱特征分析

目的　建立延边州结核分枝杆菌IS6110 RFLP指纹图谱 ,并分析朝鲜、汉两族的图谱特征。方法 97株结核分枝杆菌分离株 ,提取DNA ,经酶切 ,电泳 ,Southem转印 ,探针杂交 ,发光自显影技术得到IS6110 RFLP图谱;按其指纹图谱特征的同源性高低进行分析。结果 延边州结核分枝杆菌IS6110拷贝数目平均为 13个;57.7%菌株可成簇 ,具有“北京基因型”特征;IS6110 RFLP图谱特征分布无地域差异 ,无民族差异。结论 延边州结核分枝杆菌分离株同北京分离株有较近的亲缘关系 ,但其多态性较高。     

术后龟分支杆菌脓肿亚种的暴发感染

目的研究深圳某医院发生的一起术后暴发感染的致病菌。方法按照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》和《伯杰细菌鉴定手册》第九版,以及《实用临床细菌学检验与进展》介绍的方法,对９７例切口分泌物标本进行细菌培养。在分离出非结核分支杆菌的基础上,以标准株龟分支杆菌龟亚种、龟分支杆菌脓肿亚种和偶然分支杆菌作对照,对临床分离株进行了菌型鉴定。结果从９７例切口分泌物中分离出２６株抗酸染色阳性的速生长非结核分支杆菌,在分离出非结核分支杆菌的基础上,加上医院收集的１５株共４１株,鉴定为龟分支杆菌脓肿亚种。结论此次院内术后暴发感染是由龟分支杆菌脓肿亚种引起的。     

分支杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析

目的　建立分支杆菌的 16SrDNA序列分析的方法 ,采用该方法鉴定临床结核分支杆菌分离株。方法　用PCR从重庆某医院的肺部感染病人的痰标本中分得的 2 9株分支杆菌菌株中扩增 16SrRNA基因 (16SrDNA)的 5′端片段 (～5 0 0bp) ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行分类与鉴定。结果　有 14株的 16SrDNA序列分别与已知结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriatuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌、新金色分支杆菌、氯酚红分支杆菌、龟分支杆菌或脓肿分支杆菌的序列完全相同。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;部分分离株的 16SrDNA在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列。用临床分离株的 16SrDNA序列与已知的分支杆菌 16SrDNA序列构建的系统发育树 ,结果提示某些菌株可能是与已知分支杆菌密切相关的新种或是它们的亚种。结论　 16SrDNA序列分析鉴定分支杆菌是一种快速、可靠、成本较低的方法 ;重庆地区非结核分支杆菌感染的种类与其它地区的报告有明显不同