组织工程心脏瓣膜构建的机遇与挑战

随着组织工程学的发展,构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的研究已取得初步进展,当前TEHV研究的方向主要集中于三个方面种子细胞、生物材料及组织构建.本文就种子细胞的来源、分离、培养和鉴定,生物材料的种类、要求,TEHV的构建方法和构建环境,和TEHV的动物实验和临床应用方面的研究进展做一概述.     

组织工程心脏瓣膜构建的机遇与挑战

随着组织工程学的发展，构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的研究已取得初步进展，当前TEHV研究的方向主要集中于三个方面：种子细胞、生物材料及组织构建。本文就种子细胞的来源、分离、培养和鉴定，生物材料的种类、要求，TEHV的构建方法和构建环境，和TE-HV的动物实验和临床应用方面的研究进展做一概述。     

碱性成纤维细胞生长因子联合骨髓间充质干细胞构建组织工程瓣膜的研究

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合骨髓间充质干细胞(MSCs)构建组织工程瓣膜(TEHV),能否在保证生物学性能不变的前提下,缩短MSCs体外构建TEHV的时间.方法:分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞猪主动脉瓣膜支架上,再进行分组于体外构建TEHV.在培养基中加入5 μg/L的bFGF分别培养7 d、14 d做为实验组A和实验组B,实验组C除培养液中不添加bFGF外,其余同实验组B.对照组为大鼠肌成纤维细胞构建的TEHV.各组TEHV进行形态学观察,DNA和羟脯氨酸含量检测.结果:MSCs表达CD29 (94.82%)和CD44 (93.59%), a-SMA和Vimentin染色阳性,各组TEHV具有相似的形态学结构,DNA和羟脯氨酸含量的差异无统计学意义.结论:采用bFGF联合MSCs能在更短的时间内构建具有相同生物学性能的TEHV,从而缩短TEHV体外构建时间.     

应用犬骨髓间充质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的:将犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）分离、自然扩增后,体外与去细胞猪主动脉瓣复合构成组织工程瓣膜（TEHV）,观察其生长情况,以评价其作为组织工程心脏瓣膜种子细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心及贴壁筛选法分离犬的BMSCs,培养扩增,用免疫组化的方法进行鉴定;采用本实验室方法构建的生物材料———去细胞猪主动脉瓣为支架,种植犬的BMSCs,静态培养710 d;进行组织学切片及扫描、透射电镜观察,并进行机械力学性能检测。结果:分离的BMSCs细胞免疫组化显示SH2、V im entin、α-SMA（+）,CD34、VIII因子、Lam in in（-）,生长扩增能力强,2周内经3代培养即可扩增到（5.57±0.34）×107细胞数量级;组织工程瓣组织学示活组织和细胞外基质（extracellu larm atrix,ECM）形成;扫描电镜见细胞贴附均匀,透射电镜可见分泌活性的肌纤维细胞样细胞（含actin/myosin纤维、胶原纤维、弹性蛋白）;机械力学性能得到保留。结论:使用本方法可以构建成功组织工程心脏瓣膜;BMSCs与去细胞猪主动脉瓣的相容性良好,可以作为种子细胞之一。     

转化生长因子-β_1基因转染构建组织工程瓣膜

目的:转化生长因子(TGF)-β1基因转染细胞,研究对天然支架组织工程瓣膜(TEHV)构建作用.方法:脂质体介导pcDNA3.0/TGF-β1基因载体进入大鼠肌成纤维细胞(MFB),48 h和4周后G418筛选法培养,SABC法检测TGF-β1表达.A组将转基因细胞种植去细胞猪主动脉瓣叶,B组种植未转基因细胞,C组单纯支架,体外培养2周构建TEHV.苏木精-伊红染色、扫描电镜观察,测定羟脯氨酸、DNA含量和最大负荷力.结果:基因转染48 h和4周,MFB瞬时和稳定表达TGF-β1蛋白.A组较B组细胞生长旺盛,胶原分泌较多,力学性能增强.结论:TGF-β1基因转染MFB作为种子细胞,能较好发挥TGF-β1活性,促进TEHV构建.     

碱性成纤维细胞生长因子联合间充质干细胞构建组织工程瓣膜的研究

目的:探讨采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合间充质干细胞(MSCs)体外构建组织工程瓣膜(TEHV)过程中,MSCs表型特性和基质金属蛋白酶及其抑制物的表达情况.方法:分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞瓣叶支架上.将瓣叶置于含5 ng/ml bFGF的培养液中,培养14 d构建的TEHV作为A组;B组除培养液中不添加bFGF外,其余同A组;C组为大鼠肌成纤维细胞构建TEHV的对照组.RT-PCR检测各组TEHV中α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA的表达.结果:MSCs表达CD29(94.82%)和CD44(93.59%).A组与C组α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA表达比较均差异无统计学意义(P>0.05),但均高于B组(P<0.05).结论:采用bFGF联合MSCs体外构建TEHV过程中,通过bFGF的调控作用,可以使MSCs的表型特性和基质金属蛋白酶及其抑制物表达与肌成纤维细胞相当.     

组织工程心脏瓣膜的体内实验

组织工程心脏瓣膜(TEHV)体内实验是TEHV研究的必经阶段.只有通过体内研究才能客观评价瓣膜功能,瓣膜支架降解及炎症反应情况,为将来应用于临床打下基础.本文对目前的研究成果和进展作一综述.     

组织工程心脏瓣膜的体内实验

组织工程心脏瓣膜(TEHV)体内实验是TEHV研究的必经阶段。只有通过体内研究才能客观评价瓣膜功能，瓣膜支架降解及炎症反应情况，为将来应用于临床打下基础。本文对目前的研究成果和进展作一综述。     

年龄对心脏瓣膜种子细胞体外培养增值的影响

目的在心脏瓣膜构建中,年龄对作为种子细胞的人类间充质干细胞体外增值培养的影响。方法人类间充质干细胞采自不同青少年、中年、老年供体。对三种不同来源干细胞体外增殖能力进行组间比较。同时在三组间进行细胞分化、细胞迁移能力的比较。结果在青少年组,细胞克隆数量显著高于中年组和老年组（P〈0.05）;增殖曲线表明,青少年组和中年组细胞增殖能力显著高于老年组（P〈0.05）。在干细胞定向分化能力和细胞迁移,青少年组和中年组显著高于老年组（P〈0.05）。结论应用老年供体来源间充质干细胞进行自体组织瓣膜工程构建应采取审慎态度。     

人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

取心血管外科手术患者胸骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增后种植在猪去细胞主动脉瓣叶表面2周,观察细胞生长情况;免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况.结果 经体外培养的入骨髓基质干细胞在去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架表面形成一层基本连续的细胞层.认为去细胞猪主动脉瓣叶组织是良好的纤维支架,可用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的.     

组织工程心脏瓣膜支架材料进展

当前应用于临床的瓣膜置换物(生物瓣和机械瓣)都不同程度的存在着一定缺陷。组织工程心脏瓣膜为理想生物瓣膜替代物的出现带来了希望。组织工程心脏瓣膜的构建包括:⑴支架的选材及制备;⑵种子细胞的选择、分离与培养;⑶种子细胞在支架上的种植与培养三部分。现重点综述近年来国内外在组织工程心脏瓣膜支架材料研究上的新进展新突破,展望了支架材料发展的方向和前景。     

犬骨髓间充质干细胞可诱导分化为组织工程瓣间质种子细胞

目的诱导分化骨髓间充质干细胞（BMSC）,探讨BMSC作为组织工程瓣膜的间质种子细胞的可行性。方法分离扩增犬BMSC,定向诱导分化为成纤维细胞,以隐静脉间质细胞为对照,比较两种细胞在形态学、增殖能力、胶原合成,以及两种细胞冻存和复苏率。结果光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,形态为梭形或多角型,血管间质细胞和第2代诱导BMSCs的倍增时间分别为38 h和36 h,诱导后的BMSC的冻存和复苏率、合成胶原能力与血管间质细胞之间无显著差异;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上。免疫组织化学结果显示种植后瓣膜上有间质细胞生长。结论BMSC诱导后可分化为成纤维细胞与静脉来源的间质细胞无显著差别,是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞。     

组织工程心脏瓣膜的研究进展

心脏瓣膜置换术仍然是当前治疗心脏瓣膜病最有效的治疗方法,但目前临床应用的人工心脏瓣膜疗效却不尽如人意。随着组织工程学的兴起与发展,组织工程心脏瓣膜的研究越来越受到关注并成为研究的热点。现对组织工程心脏瓣膜研究在种子细胞的选择、支架材料的选择、瓣膜体外构建方法、动物实验与临床应用等方面取得的进展,进行综述。     

组织工程在心血管病治疗中的应用

组织工程学是将细胞生物学和材料学、工程学相结合进行体外构建组织或器官的新兴学科。其基本原理是将体外培养、扩增的,具有特定生物学功能的种子细胞与可降解材料相结合,形成细胞-材料复合物,在体外培养一定时间后植入体内用以修复替代病损的组织器官。组织工程学在心血管病治疗中主要应用于组织工程心脏瓣膜、组织工程血管和组织工程心肌三个方面。分述如下。1组织工程心脏瓣膜临床上应用的人造心脏瓣膜(机械瓣,生物瓣)可有效改善血流动力学,提高患者生存质量,但存在不同程度的缺陷:机械瓣需终身抗凝,易致出血、栓塞和感染;同种异体瓣有…     

组织工程心脏瓣膜研究近况

目前临床使用的人工心脏瓣膜不论是机械瓣还是生物瓣 ,都有其自身无法克服的缺点 ,因而影响了瓣膜的耐久性和远期疗效。随着组织工程学的兴起 ,构建组织工程心脏瓣膜的研究已取得了初步进展。本文综述近年来组织工程心脏瓣膜研究进展情况 ,并从基质材料、种植细胞及动物实验各方面探讨构建组织工程心脏瓣膜的必要性、可行性及前景。     

心脏瓣膜组织工程研究新进展

瓣膜置换术是目前临床上治疗心脏瓣膜病的最终手段。但临床应用的各种人工心脏瓣膜在持久性和远期疗效上,都存在着难以克服的缺陷。而随着组织工程技术的发展,组织工程瓣膜以良好的组织相容性、经久耐用且具有生物活性等多方面的优势而成为近年来心脏外科领域的研究热点之一。现综述了近年来国外组织工程心脏瓣膜在瓣膜材料、培养方式及种子细胞等方面的最新进展并展望了该领域的研究未来。     

心瓣膜组织工程中种子细胞原代联合培养的实验研究

目的：探讨体外原代联合培养、扩增,鉴定同一来源的人血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的方法,为组织工程心脏瓣膜的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取冠状动脉旁路移植术中剩余大隐静脉3cm～8cm,组织块培养法原代培养混合血管细胞,DMEM培养液培养、扩增混合血管细胞。倒置显微镜、免疫组化方法对内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞,呈现内皮样细胞、成纤维样细胞混合生长的特征。免疫细胞化学检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白、成纤维细胞纤维连接蛋白相关抗原呈阳性反应。细胞经3～4次传代,细胞数量可增殖达到8×10~6～10×10~6。结论：使用组织块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞,三种细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程心脏瓣膜种子细胞的足够数量。     

生物蛋白胶-牙髓干细胞构建三维支架的生物相容性

目的构建牙髓干细胞-生物蛋白胶支架的三维培养体系,研究牙髓干细胞在生物蛋白胶中的生物相容性。方法体外复苏牙髓干细胞并复合进入生物蛋白胶中培养,通过CCK-8检测提取液对细胞增长情况的影响,并通过细胞的矿化情况进一步分析生物蛋白胶的生物特性。结果冻存的牙髓干细胞经免疫荧光染色具备干细胞的特性,细胞包埋于生物蛋白胶内可见三维培养下细胞状态更加伸展,更加模拟自然生长,细胞形态典型,2 w后生物蛋白胶可完全降解,牙髓干细胞矿化诱导结果较典型。结论生物蛋白胶是一种适宜的组织工程牙髓种子细胞载体。     

聚乙二醇载药缓释微球复合去细胞瓣制备组织工程心脏瓣膜支架

目的:制备聚乙二醇(PEG)载药缓释微球复合去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)支架。方法:制备PEG微球,电镜观察粒径。去细胞瓣与PEG微球偶联,吸附转化生长因子(TGF-β1)。行ELISA检测,分子生物学、形态学和生物力学检测。结果:PEG微球粒径(42.72+3.48)nm。酶联免疫吸附检测示缓释效果明显,7dTGF-β1释放率67.22%,PEG微球的TGF-β1包封率为82.01%。与单纯去细胞瓣膜比较,复合支架羟脯氨酸含量和DNA含量无显著变化,形态学检测显示复合支架细胞外基质联合紧密,胶原纤维结构紧凑,且瓣叶生物力学性能提高。结论:制备PEGTGF-β1缓释微球去细胞瓣复合支架可行。     

体外诱导胚胎干细胞源性表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导来源于胚胎干细胞的表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的可行性及条件,为寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论胚胎干细胞源性表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。