重组冠状病毒核衣壳蛋白血清抗体检测

目的 SARS冠状病毒的核衣壳(Nucleocapsid)蛋白(N蛋白)是病毒的主要结构抗原，重组N蛋白可用作抗原检测患者血清中相应抗体。方法 以纯化的目的蛋白N-1，N-2分别包被96孔板，检测正常人群及患者血清中抗SAKS病毒抗体。结果 检测SAKS感染患者血清，N-1阳性检出率为55．68％，N-2阳性检出率为56．82％，与华大基因试剂盒相比符合率分别为90．12％和87．65％。结论 重组核衣壳蛋白可做为检测SARS抗体的抗原蛋白。     

利用蛋白质芯片技术筛查多发性硬化患者的自身抗体

目的用高通量蛋白质芯片技术筛选多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)患者血清中可能存在的自身抗体,为筛选新的疾病辅助性诊断的指标奠定基础。方法 15例MS患者作为疾病组,选取同样数量MS阴性并无其他自身免疫疾病的性别和年龄相匹配的健康人15位作为健康对照组。两组组内随机分为3个小组,血清充分混匀后,采用高通量蛋白质芯片法检测MS患者血清中可能存在的自身抗体。结果通过高通量蛋白质芯片技术检测及与对照组分析比对,共筛出MS患者血清27种自身抗体。其中阳性率较高为SLC16A4、NOL3和DTX1,提示其可能是MS患者血清中特异性自身抗体的靶蛋白。阳性蛋白数量上,MS组高于HC组。功能聚类结果显示,自身抗体主要针对神经相关的蛋白质。结论采用高通量蛋白质芯片技术,可以较为有效筛选出MS血清中的自身抗体的靶抗原,为进一步验证MS相关自身抗体的功能及作用机制奠定了基础。     

应用SELDI技术检测精浆抗精子抗体阳性不育患者精浆中差异蛋白

目的探讨用蛋白质芯片技术筛选精浆抗精子抗体阳性不育患者精浆中蛋白质表达谱，寻找精浆中的差异蛋白。方法采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（SELDI—TOF—MS）和CMl0蛋白质芯片对30例精浆抗精子抗体阳性不育患者精浆和30例健康人精浆的蛋白质谱图进行了检测，使用PBSII—C型蛋白质芯片阅读机读取数据，获得的结果采用CIPHERGEN公司的Biomarker wizard和Biomarker Patterns System软件分析。结果精浆抗精子抗体阳性不育患者与正常人精浆蛋白质谱相比有12个显著差异蛋白质，其中6个蛋白质在患者精浆中高表达，6个蛋白质在患者精浆中低表达。Biomarker Patterns System软件用12个显著差异蛋白质中的2个标志分子建立精浆抗精子抗体阳性不育患者诊断的分类树模型。检测灵敏度为90％、特异性为93．3％。结论实验证明利用蛋白质组学和生物信息学方法可以从精浆中筛选出精浆抗精子抗体阳性不育患者相关的标志蛋白质，而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选精浆中的精浆抗精子抗体阳性不育患者的标志蛋白质是一种有效、快速的工具。     

新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备

目的：分析一个新的人突触相关蛋白(FRCA)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法：从人胎肝文库PCR扩增获得FRCA基因全长cDNA序列；通过生物信息学分析，预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域，并进行了多序列比对；采用固相多肽合成法合成了FRCA抗原多肽，并免疫家兔；用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达。结果：通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，制备兔抗人FRCA多克隆抗体。高效液相色谱检测显示抗体纯度达82．79％，抗体滴度为1：16000，Western blot证实该抗体具有较好的反应性和特异性，免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达。结论：成功制备了新的人突触相关蛋白(FRCA)多克隆抗体。     

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。     

小鼠PD-1胞外区基因片段表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:原核表达并纯化小鼠PD-1膜外区(以下简称mPD-1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法:原核表达质粒pGEX-4T-1/mPD-1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白的表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。利用蛋白质纯化仪纯化蛋白。使用纯化蛋白免疫日本大耳白兔3次后,分离抗血清,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过细胞免疫荧光方法(CIF)和FCM检测高表达PD-1全长基因的L929细胞。结果:诱导表达并纯化了GST-mPD-1重组蛋白,得到相对分子质量(Mr)约42000的mPD-1蛋白。纯化蛋白免疫动物后,产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶1562500)。CIF和FCM结果显示抗血清与L929细胞表面PD-1有高度的特异性结合活性。结论:成功获得高纯度的mPD-1重组蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的抗体,为将mPD-1蛋白及抗体用于PD-1的生物学研究及抗肿瘤治疗的实验研究奠定了基础。     

人YPEL4基因的原核表达及兔血清多克隆抗体的制备与鉴定

目的通过PCR技术扩增，将YPEIA基因亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体，经酶切及测序鉴定后，转化E．coli BL21大肠杆菌，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy—β—D—thiogalactoside，IPTG）诱导融合蛋白表达。融合蛋白在细菌裂解液的包涵体和上清中都有较高的表达，故取其上清液用谷胱甘肽琼脂糖珠（Glutathione SepharoseTM4B）亲和纯化目的蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，进行WesternBlot检测抗体及其效价。结果获得了高效价的特异性兔抗YPEIA多克隆抗体，为YPEL4基因进一步的功能研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒棘突蛋白的S1蛋白诱导小鼠产生中和抗体的研究

目的 研究SARS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1的免疫原性，为SARS的实验诊断和新型疫苗的研究提供依据。方法 用克隆有哺乳动物细胞密码子优化的SARS-CoV S1基因的质粒pcDNA3．1／S1或P-S1Ig转染293T细胞，用细胞的上清液纯化S1蛋白。以pcDNA3．1／S1质粒对BALB／c小鼠进行2次基因免疫，以纯化的S1蛋白进行加强免疫。用ELISA法检测小鼠抗SARS-CoV的特异性IgG抗体，并在Vero E6细胞上做体外中和实验，检测中和抗体。结果 S1蛋白诱导小鼠产生抗SARS-CoV的特异性抗体；1：1499．68稀释的S1蛋白免疫的小鼠血清可保护50％的细胞对1000TCID50的病毒攻击，而阴性对照血清不能保护细胞对病毒的感染。结论 SAPS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1能有效诱导机体产生具有高效保护作用的中和抗体免疫反应，可望发展成为理想的SARS棘突蛋白亚单位疫苗。     

鸡Rad51蛋白的体外表达与纯化及其抗血清的制备

目的:Rad51蛋白在双链断裂的DNA修复的同源重组中发挥重要作用。因而其过量表达在细胞内的基因操作中被用于在提高基因同源重组的效率。当前在鸡中还未有针对该蛋白的特异性抗体。为此我们对鸡的Rad51进行了体外表达与纯化,并制备了cRad51抗体,为该蛋白质在鸡细胞中的功能研究及探讨其用于鸡细胞中提高同源重组的研究提供有效工具。方法:对鸡Rad51基因进行全长克隆并构建原核表达载体pET-28a(+),用IPTG诱导该蛋白在Rosseta菌株中表达,纯化后注射BALB/c小鼠获得抗体。结果:成功制备鸡Rad51特异多克隆抗体,ELISA显示该抗体血清效价达51 200,该抗体血清可以用于Western等的蛋白检测技术。结论:针对鸡基因产物制备抗体的技术方法有效可行;首次成功获得鸡Rad51蛋白及多克隆抗体,为与该蛋白相关的研究提供了有效工具。     

兔抗Syk抗体制备和在乳腺癌诊断中的应用

目的：制备兔抗小鼠脾酪氨酸激酶(Syk)抗体，分析其在乳腺癌诊断中的价值。方法：应用重组小鼠Syk蛋白，常规免疫雄性家兔制备抗Syk抗体。用免疫印迹法检测Syk抗体的纯度和特异性。应用免疫组化法，检测乳腺组织中Syk蛋白的表达。结果：用重组小鼠Syk蛋白免疫家兔6wk后，静脉血中抗Syk抗体效价为1：6400(A450=1．03)。将Syk经SDS-PAGE分离，可见1条相对分子质量(Mr)为72000的蛋白条带．与理论值相符。用抗Syk血清做免疫印迹证实，在Mr为72000处有1条明显的带，证明是抗Syk特异性抗体。乳腺组织切片经抗Syk抗体免疫组化染色，在正常乳腺组织细胞胞浆中可见棕黄色颗粒，而浸润性乳腺导管癌组织的细胞浆不着色。结论：制备了高效价、特异性的兔抗Syk抗体。用该抗体检测证实，Syk在正常乳腺组织细胞中呈高表达，在乳腺癌组织细胞中表达缺失。有可能用于乳腺癌的临床诊断。     

单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备

目的：制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白。方法：把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2-8E5质粒DNA，用scFvC66的重链和轻链可变区DNA取代scFv-8E5的重链和轻链可变区DNA，构成表达载体pSTE2-C66-Ap在大肠杆菌中表达，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性。结果：获得一个分子量为75kD的scFvC66-Ap融合蛋白，可结合来自KGla细胞裂解物中的一个分子量约60kD的蛋白质带，其结合功能可通过其碱性磷酸酶活性直接测定。结论：建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的方法，它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

广东2003年末SARS患者冠状病毒抗原抗体动态特征分析

目的分析SARS-IgG、SARS-IgM、核壳蛋白-IgG抗体和核壳蛋白抗原的变化特点并探讨其意义。方法采用酶联免疫方法对2003年末至2004年初新发4例SARS病人的系列血清进行上述4项的滴度检测。结果在病人较早期的血清中可以检测到核壳蛋白抗原，随着抗体水平的升高，抗原含量迅速下降。抗体E升下降快，在最高水平维持时间短，并且除第1例外，其余3例的抗体滴度均小于1：100，核壳蛋白抗体变化规律与总的IgG抗体一致，但滴度更低。结论抗体变化规律与前次流行不同，抗体水平变化快，应注意及时采集标本。抗原检测可作为一种实验室诊断依据。核壳蛋白抗体可考虑用于早期诊断。     

我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达

目的探讨HIV-1gp41抗原表位串联表达蛋白用于HIV抗体检测的可行性。方法用HIV-1gp41蛋白亲和层析柱制备HIV-1感染者血清中的多克隆抗体，用噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘洗，反向吸附非特异性噬菌体。经ELISA鉴定阳性克隆，DNA测序，确定优势表位。将优势表位与文献报道的另一个优势表位串联，克隆人pQE30载体进行蛋白表达。结果成功筛选到位于HIV-1 gp41蛋白上的优势抗原表位(YGPKDAETTAIW)，串联表位(YGPKDAETTAIW-GGGS-SC-SAKFTCTTQI)在pQE30载体中实现可溶性表达。重组蛋白具有良好的抗原性，能与不同的HIV-1抗体阳性血清呈特异反应。结论HIV-1 gp41抗原表位串联表达设计足可行的，串联表位重组蛋白可用于HIV-1抗体检测，但检测灵敏性低于常规方法。     

凝血酶调节蛋白植物凝集素样片段的原核表达及抗体制备

目的：制备凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，TM)抗体。方法：原核表达目的蛋白，将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠。以EVC304包板的cell—ELISA检测抗体滴度，用Western blot和免疫组化鉴定抗体特异性。结果：目的蛋白在大肠杆菌中大量表达形成包涵体，将表达蛋白纯化并复性后免疫小鼠，3次免疫后得抗体效价为1：4000，经加强免疫后抗体效价达到1：8000；特异性较好。结论：在天然TM提取纯化困难的情况下，通过原核表达目的蛋白制备抗体是可行的。     

抗肿瘤转移相关蛋白Memo抗体的制备及组织表达谱分析

目的:制备抗Memo蛋白的特异性抗体,并鉴定其特异性,检测其在小鼠组织中的表达。方法:在大肠杆菌中表达GST-Memo融合蛋白,常规免疫小鼠制备抗体。构建了带有FLAG标签的真核表达载体pcDNA3-FLAG-Memo。用Westernblot检测抗体的特异性。结果:构建了Memo的真核表达载体pcDNA3-FLAG-Memo,制备的抗Memo抗体能特异性地识别Memo蛋白。Westernblot检测表明,Memo蛋白在不同的小鼠组织中都有一定程度的表达。结论:成功地获得抗Memo蛋白的特异性抗体并检测了其组织表达谱,为进一步研究其与恶性肿瘤的转移性、侵袭性的关系及其相关机理的研究提供了重要的制剂。     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a（＋）载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

25kD蛋白在人骨骼肌中的定位及在人其他组织中的表达

25 k D蛋白是一种新的与重症肌无力相关的蛋白质。为了检测该蛋白在人体不同组织中的表达并明确其在人骨骼肌中的亚细胞定位。本研究提取和纯化 2 5 k D蛋白 ,免疫小鼠制备了 2 5 k D蛋白的抗体 ;用免疫印迹方法验证了抗体的特异性并检测2 5 k D蛋白在成年人及胎儿 8种不同组织中的表达 ;用免疫组化和免疫电镜方法明确了 2 5 k D蛋白在骨骼肌中的细胞及亚细胞定位。结果显示 ,2 5 k D蛋白抗体只与肌肉匀浆样品中 2 5 k D蛋白特异性反应。在成年人及胎儿 8种不同组织中 ,2 5 k D蛋白只见于骨骼肌。免疫组化可见在肌膜下和横纹上有不均匀的免疫染色 ;免疫电镜显示在肌膜下有电子致密物沉积 ,肌丝中未见有电子致密物沉积。这些结果表明 :2 5 k D蛋白抗体具有很高的特异性 ,2 5 k D蛋白只表达于人骨骼肌中 ,其亚细胞定位在骨骼肌的肌膜下。     

抗PTD-bcr/abl多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备多克隆抗体并初步用于PTD－bcr/abl融合的研究，为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法 在大肠杆菌中表达PTD－bcr/abl融合蛋白，用所获得的蛋白免疫家兔得到多克隆抗体，并用免疫组化染色，Western-blot等方法进行此抗体的鉴定。结果 （1）表达PTD－bcr/abl融合蛋白。（2）制备了抗PTD－bcr/abl融合蛋白多克隆抗体。（3）并用多克隆抗体以多种方法，检测PTD－bcr/abl融合蛋白，证实此抗体效价高，特异性强。结论 此抗体可用于PTD－bcr/abl融合蛋白的进一步研究。     

血清抗S-100b蛋白自身抗体水平与精神分裂症的关系

运用ELISA技术测定血清抗S-100b蛋白自身抗体,研究精神分裂症与血清抗S-100b蛋白自身抗体的关系。用间接ELISA检测153例正常人、32例连续服抗精神病药物的复发精神分裂症患者、98例入院前至少14天未服抗精神病药物的复发精神分裂症患者（60例完成12周治疗,再次测定抗S-100b蛋白自身抗体）及30例初发精神分裂症患者血清抗S-100b蛋白自身抗体。正常人对照组的血清抗S-100b蛋白自身抗体阳性率为2．6％（4／153）、复发精神分裂症组为44．6％（58／130）、初发精神分裂症组为23．3％（7／30）;连续服药组为40．6％（13／32）、未连续服药组为45．9％（45／98）;60例完成12周治疗的分裂症患者入院时为46．7％（28／60）、12周末为40．0％（24／60）。结果显示,精神分裂症患者血清抗S．100b蛋白自身抗体阳性率明显升高,复发精神分裂症患者入院前是否服药与血清抗S-100b蛋白自身抗体无关,分裂症患者经12周治疗前后血清抗S-100b蛋白自身抗体无变化。