以金色分枝杆菌为模式菌株筛选抗结核活性化合物可行性研究

目的评估以金色分枝杆菌作为结核分枝杆菌模式菌株筛选抗结核抑制剂的可行性。方法以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv建立细胞水平的抑制剂高通量筛选模型,对本单位化合物库部分样品进行筛选,获得具有抗结核活性的化合物;进一步比较模式菌株金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌及谷氨酸棒状杆菌对具有较强抗结核活性样品的敏感性差异。结果利用基于结核分枝杆菌建立的全细胞筛选模型,从本单位化合物库的5万个样品中筛选得到67个最低抑菌浓度≤5μg/ml的化合物。对金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌有抑制活性的样品分别有22个(32.84%)、10个(14.93%)、12个(17.91%)和6个(8.96%),其中抑菌活性与抗结核活性差异在4倍以内的样品分别有16个(72.73%)、5个(50%)、7个(58.33%)和3个(50%)。结论相对于其他3种模式菌株,金色分枝杆菌对本单位样品库化合物的敏感性与结核分枝杆菌的最为接近,以金色分枝杆菌为模式菌株开展抑制剂筛选研究更有可能获得具有抗结核活性的化合物。     

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型,筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂,获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,pET28a表达质粒为载体,将alr基因克隆至pET28a,构建pET28a::alr重组表达质粒,表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶;通过测定反应产物NADH在340 nm处光密度变化速率,检测酶反应活性,构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型;应用该模型对化合物库进行筛选;测定活性化合物IC50以及对结核分枝杆菌的MIC。结果成功构建了结核分枝杆菌alr基因的表达载体;得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶,测得该酶的比活力为13.53 kU/mg;所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高,符合高通量筛选的要求;通过对70 000个化合物进行筛选,得到了5个活性较高的化合物,其中,IMB-XZ5对结核分枝杆菌的MIC为4~8μg/ml,且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。     

以蛋白激酶A为靶点的抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

目的 建立以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型,应用该模型筛选具有特异性酶活抑制活性的微生物发酵液粗提物样品。 方法 以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,扩增目的基因片段 pknA,构建表达载体 pET43.1a-pknA,在大肠杆菌中克隆表达了重组 MTB PknA 蛋白;采用三步级联的反应方法,利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸这一反应最大吸光值波长的变化,建立和优化蛋白激酶 A 抑制剂高通量药物筛选模型。 结果 成功构建了表达载体 pET43.1a-pknA;建立了稳定灵敏,可用于靶向结核分枝杆菌蛋白激酶 A 的抗结核药物高通量筛选模型;利用该模型对4000个微生物发酵液粗提物样品进行筛选,最终得到21个抑制蛋白激酶 A 活性的阳性样品,阳性率0.53%;以耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌为检定菌,平板纸片法检测阳性样品的抗分枝杆菌活性,然后对阳性样品的细胞毒性和酶活抑制特异性进行评价后,最终得到8个阳性样品,其中 I10AA-02916、I09AA-02717、I09AB-02729、I08AB-00801这4个阳性样品酶活抑制特异性、抗菌活性均较好,且细胞毒性较低。 结论 建立了高稳定性的以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型,应用该模型所得到的发酵液阳性样品值得进一步研究。     

以肽脱甲酰基酶为靶点的抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

目的建立以肽脱甲酰基酶(PDF)为靶点的抗结核药物高通量筛选模型,应用该模型筛选得到活性微生物发酵液粗提物样品。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增肽脱甲酰基酶的基因片段def,构建表达载体pET-28a-def,表达并纯化结核分枝杆菌PDF酶;基于PDF水解三肽底物for-Met-Ala-Ser释放出游离NH2,而游离NH2可与荧光胺反应产生荧光的原理,利用测定所产生荧光值的方法,建立高通量药物筛选模型;使用该模型对12400个微生物发酵液粗提物样品进行筛选,同时以耻垢分枝杆菌为检定菌,平板纸片法检测样品的抗菌活性,并检测所得阳性样品的细胞毒性。结果成功构建了表达载体pET-28a-def;所建立的模型稳定可行,可用于以肽脱甲酰基酶为靶点的抗结核药物的高通量筛选;用该模型对12400个微生物发酵液粗提物样品进行筛选,最终得到8个对肽脱甲酰基酶抑制活性和抗耻垢分枝杆菌活性均较好的阳性样品,阳性率0.06%;其中5个样品的细胞毒性较小。结论建立了灵敏度好、稳定性高的结核分枝杆菌肽脱甲酰基酶抑制剂高通量药物筛选模型,应用该模型所得到的阳性样品具有进一步深入研究的意义。     

基于吩噻嗪类化合物的新型抗结核小分子化合物的设计、合成及活性研究

目的 借助计算机虚拟筛选技术设计并合成新型抗结核小分子化合物.方法 以氯丙嗪为模板分子,利用Discovery studio 3.0构建相应的3D药效团模型,并对虚拟化合物库进行筛选;对筛选结果进行手动择优选择,化学合成目标化合物并进行体外抗结核分枝杆菌的活性评价.结果 筛选得到活性化合物15个,并合成其中13个,其中化合物9(多巴胺)在体外对结核分枝杆菌表现出中等强度的抑制作用,MIC为8.0 μg/ml.结论 通过药效团的方法筛选得到了结构较吩噻嗪类化合物简单的抗结核活性小分子多巴胺,该化合物作为抗结核分枝杆菌的先导化合物,较吩噻嗪类具有更大的结构修饰空间.     

结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。     

以结核分枝杆菌H_(37)Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型;用此模型筛选莽草酸脱氢酶抑制剂;进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响。方法表达并纯化结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶;利用还原型辅酶II(NADPH)在溶液中的光吸收,测定酶的活性,构建了该酶抑制剂的高通量筛选模型;用Z′因子法评价该模型的可靠性,并对5万余个化合物进行筛选;测定了各抑制剂的IC50并对抑制剂6186050的酶抑制动力学进行了研究;用菌液稀释法评价了抑制剂对某些临床分离菌株包括耐药菌株的影响。结果得到了重组莽草酸脱氢酶;测得比活力为20987U/mg,所建的莽草酸脱氢酶高通量筛选模型Z′因子为0.76,符合高通量筛选的要求;对5万余个化合物进行筛选得到9个抑制率较高的化合物;抑制剂6186050为竞争性可逆抑制剂;抑制剂6230384和6186050对海分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)都是32μg/ml。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶抑制剂高通量药物筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂可能具有抑菌活性。     

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

目的筛选结核分枝杆菌FtsZ的特异性抑制剂,为抗结核药物的研发提供先导化合物。方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选,获得能够抑制FtsZ的化合物202E,对其进行IC50以及分子水平活性测定,并利用DS 4.0软件将化合物202E与FtsZ的活性位点进行对接。结果化合物202E能够抑制结核分枝杆菌FtsZ的GTP酶活性,其IC50为15.46μmol/L。202E还能够抑制FtsZ蛋白的聚合。通过分子对接,发现202E能够与FtsZ的GTP结合位点结合,抑制FtsZ的GTP酶活性。结论化合物202E是活性较好的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂。     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量.方法 利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实.利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛...     

结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究

目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌（ＴＢ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ｐＭＴ－７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０，并用以转化耻垢分枝杆菌及大肠杆菌，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的ＨＳＰ７０；以重组耻垢分枝杆菌分别经皮下及腹腔免疫小鼠，用淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ法检测巨噬细胞吞噬活性，并检测血清中特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体。结果ＴＢＨＳＰ７０能在分枝杆菌中表达，表达量占菌体总蛋白量的１０％，不能在大肠杆菌中表达；重组耻垢分枝杆菌以１０６ＣＦＵ的剂量经皮下免疫小鼠后，可使小鼠脾淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）和腹腔巨噬细胞吞噬活性增高（Ｐ＜０．０５），并能刺激机体产生特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体，腹腔免疫激发的抗体滴度较皮下免疫为低，而ＳＩ无明显改变。结论构建的表达质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０能在耻垢分枝杆菌中表达ＨＳＰ７０，该重组菌具有较强的免疫原性。     

副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的GTF和ORF4的功能与相互作用的研究

目的 研究副血链球菌(Streptococcus parasanguis)fap1-orf4基因座位编码的葡糖基转移酶(GTF)和开放阅读框架(ORF)4是否参与菌毛相关蛋白1(Fap1)的糖基化与成熟以及两种蛋白质之间的相互作用.方法 采用基因置换技术构建副血链球菌gtf和orf4突变株,并利用互补分析和Western blot检测副血链球菌Fap1的表达水平,用以评价GTF和ORF4在Fap1的糖基化和成熟的作用,另外采用酵母双杂交技术、GST pulldown技术检测GTF和ORF4两种蛋白质的相互作用.结果 (1)副血链球菌gtf和orf4的突变株呈现相同表型,成熟的相对分子质量(M)约220×103的Fap1被高相对分子质量不成熟的Fap1(Mr约360×103)所取代.互补分析显示pVPT-GFP-gtf和pVPT-GFP-orf4能使突变株恢复表达成熟的Fap1;(2)酵母双杂交技术的划线试验显示共转化子AH109/pAD-gtf+pBD-orf4和AH109/pAD-00f4+pBD-gtf均能在营养缺陷的选择性培养基SD-LTHA上生长,而共转化子AH109/pAD+pBD-orf4、AH109/pAD+pBD-gtf、AH109/pBD+pAD-orf4、AH109/pBD+pAD-gtf不能在营养缺陷的培养基上生长;酵母双杂交技术的X-α-ga1试验显示共转化子AH109/pAD+pBD-orf4和AH109/pAD-orf4+pBD-gtf呈现蓝色.(3)GST pull down技术进一步证实GTF和ORF4两种蛋白质之间存在直接的相互作用.结论 副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的GTF和ORF4之间存在相互作用,GTF和ORF4组成复合物是Fap1成熟与糖基化所必需的.     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4＋CD25＋、CD8＋CD28＋淋巴细胞的变化及与病毒载量的关系

目的：研究慢性乙型肝炎患者外周血CD4＋CD25＋、CD8＋CD28＋淋巴细胞的表达变化及与病毒载量的关系。方法：利用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者外周血CD4＋CD25＋、CD8＋CD28＋淋巴细胞的表达率和绝对数,并与正常对照组30例进行比较;荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者HBV核酸的载量,并与CD4＋CD25＋、CD8＋CD28＋淋巴细胞的表达进行相关分析。结果：慢性乙型肝炎患者的CD4＋CD25＋表达率和细胞数分别为（15.60±5.86）%和（0.34±0.13）×109/L,明显高于正常对照组（P〈0.01）;而CD4＋CD25-、CD8＋CD28＋为（21.13±5.32）%、（0.47±0.19）×109/L和（9.49±2.57）%、（0.21±0.07）×109/L,均低于正常对照组（均P〈0.01）;不同病毒载量的慢性乙型肝炎患者CD4＋CD25＋T细胞与病毒载量均呈正相关（r分别为0.552、0.588,P均〈0.01）,而CD8＋CD28＋T细胞与病毒载量均无相关性（r分别0.275、-0.092,P均〉0.05）。结论：慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞（CD8＋CD28＋）减少,免疫调节细胞的增加与慢性乙型肝炎患者病毒长期存在,病程迁延不愈有关。     

单片MRI测量人体腹盆腔内脏脂肪的最优位置

目的：确定单片MRI测量中国人体内脏脂肪含量的最优位置。方法：以51名健康中国人（男性27名,年龄28．89±16．56岁,BMI为23．19±3．08;女性24名,年龄47．33±19．06岁,BMI为22．38±2．53）为研究对象,采用腹盆腔连续1cm厚MR／扫描的方法,获得精确的内脏脂肪体积。以第4-5腰椎间隙水平面作为参照平面．将其下7cm到其上15cm范围内每一张MRI影像中的内脏脂肪面积和总的腹盆腔内脏脂肪体积进行Pearson相关分析、偏相关分析和多元逐步回归分析。结果：男性在参照平面上10cm,女性在参照平面上8cm处的内脏脂肪面积与总内脏脂肪体积相关性最强（相关系数分别为0．982和0．938,P〈0．01）。用两个最佳预测体积的断面作为自变量所建立的预测内脏脂肪含量的回归方程为：V（cm3）=404．421＋22．576×Area＋8（女性,RZ=-0．88,SEE=254．12cm3）;V（cm3）=1273．011＋23．64×Area＋10（男性,Rz=-0．964,SEE=216．28cm3）。结论：采用单片MRI面积分析中国人体内脏脂肪时的最佳测量位置是第4-5腰椎平面上10cm（男性）和其上8cm平面（女性）。     

PCT、Fb和CRP检测在感染性疾病诊断中的应用

目的：探讨降钙素原（PCT）、纤维蛋白原（n）、C反应蛋白（CRP）检测在早期细菌性感染的诊断价值。方法：采用半定量的胶体金免疫结合法检测血清PCT,磁珠凝固法检测血浆Fb,免疫荧光比色法测定全血CRP水平。分别对细菌感染组91例,非细菌感染组108例,非感染组40例（对照组）进行PCT、Fb和CRP的测定。并同时检测白细胞计数和分类。结果：以血清PCT〉10．5ng／ml、Fb〉4．Og／L、CRP〉8．0mg／L为阳性阈值,细菌感染组PCT的阳性率为98．9％、浓度分别为（O．5～〈2．0）、（2．0～〈10）ng／ml、≥10ng／ml三个级别间;Fb的阳性率为93．4％,浓度为（6．19±1．44）g／L;CRP的阳性率为100％,浓度为（150．5±56．6）mg／L。非细菌感染组PCT的阳性率为18．5％,浓度为（0．5-〈2．0）ng／ml;Fb的阳性率为48．1％,浓度为（4．01±1．18）g／L;CRP的阳性率为47．2％,浓度为（48．9±5．61）mg／L。细菌感染组PCT阳性率明显高于非细菌感染组（P〈0．01）;n、CRP水平明显高于非细菌感染组（P〈0．01,P〈0．01）。非细菌感染组Fb、CRP水平明显高于非感染组（2．58±0．32）g／L（P〈0．01）,Cae（14．5±0．3）mg／L（P〈0．01）。结论：PCT、Fb、CRP联检可作为早期细菌性感染的敏感诊断指标,指导临床合理用药和治疗。     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

401例染色体多态性引起生殖异常分析

目的分析染色体多态性与不孕不育患者之间临床效应关系。方法对4541例不孕不育患者进行常规外周血染色体核型分析。结果 4541例不孕不育患者检出染色体多态401例,检出率8.83%。其中inv(9)105例,inv(1)1例,inv(10)1例,1qh+8例,16qh+5例,大Y79例,小Y2例,Y长臂缺失1例,inv(Y)2例,13号大随体29例,14号大随体37例,15号大随体37例,21号大随体53例,22号大随体41例。患者临床表现为无精子症者5例,占1.25%,精子密度10×106/ml 50例,占12.47%;反复自发流产、胎儿停止发育275例,占68.58%;畸形儿分娩史43例,占10.72%;智力低下、发育异常5例,占1.25%;男性或女性生殖器发育不良12例,占2.99%;不孕11例,占2.74%。结论染色体多态性与生殖异常存在明显的关系,不能忽视其临床效应。     

肿瘤显像剂S^11C-甲基-L-半胱氨酸的细胞摄取机制研究

目的探讨肿瘤细胞摄取S^11C-甲基-L-半胱氨酸（^11C-MCYS）的机制。方法将Hepal-6肝癌细胞分为Na^＋依赖组（NaCl组）及非Na^＋依赖组（氯化胆碱组）进行氨基酸转运实验。每组又分为对照组、L-氨基酸转运载体抑制剂2-氨基二环．2,2,1-庚烷-2-羧酸（BCH）组、转运系统A和ASC的抑制剂α-甲基-氨基异丁酸（MeAIB）组、MeAIB＋丝氨酸组,分别加入^11C-MCYS（400μl0．925MBq／ml）、^11C—MCYS（200μl1．85MBq／ml）＋阻滞剂BCH（200μl 15mmol／L）、^11C-MCYS（200μl1．85MBq／ml）＋阻滞剂MeAIB（200Ixl15mmol／L）以及“C．MCYS（200斗11．85MBq／ml）＋阻滞剂MeAIB＋丝氨酸（200斗l15mmol／L）。作用4min后终止培养应用1计数仪测量细胞放射性活度。将Hepal一6肝癌细胞分为5组,各组均加入200μl^11C—MCYS（1．85MBq／ml）后分别加入50、100、200、300、350μmol／L浓度不等的MCYS进行竞争抑制实验。培养4min后终止培养应用γ计数仪测量细胞放射性活度。结果无论是否有Na^＋存在,对照组、BCH组、MeAIB及MeAIB＋丝氨酸组对^11C—MCYS摄取的差异均无统计学意义（均P〉0．05）。MeAIB组和MeAIB＋丝氨酸组中的NaCl组细胞放射性活性与氯化胆碱组相比差异均无统计学意义（18958．18±97．32比20582．27±196．32,18385．24±122．96比21620比±131．41,均P〉0．05）,两者均不能抑制Na^＋非依赖性氨基酸转运载体的转运。而BCH组中的NaCl组细胞放射性活性高于氯化胆碱组（2587．21±＋30．25比2340．61±21．09,P〈0．05）,可见BCH能明显抑制Na^＋非依赖性氨基酸转运体对^11C-MCYS的转运。不同浓度MCYS（50～350μmol／L）作用下肿瘤细胞对^11C-MCYS摄取差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论肿瘤细胞摄取^11C-MCYS是通过非Na^＋依赖的L-氨基酸转运系统进行转运的,极少涉及氨基酸转运系统A和ASC。     

应用酵母双杂交系统发现hALR与Na,K-ATPase间的相互作用

目的:采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质, 探讨ALR的作用机理。方法: 构建hALR诱饵质粒pGBKT7-hALR, 醋酸锂法转化AH109酵母菌, 转化菌在SD/-Trp-His培养基上培养及滤纸法β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后, 与人肝cDNA文库质粒预转化的酵母菌Y187进行接合试验, 接合产物在QDO培养基上筛选, 阳性克隆进一步在含X-α-Gal的QDO平板上鉴定, X-α-Gal活性呈阳性的克隆, 进行PCR及酶切鉴定排除完全相同克隆, 进一步进行回交试验排除假阳性, 对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:得到数个阳性克隆, 序列分析结果表明其中1个阳性克隆是Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基部分基因, 长669bp, 3'端非编码区224bp, 编码区长445bp, 编码Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基C端的147个氨基酸残基。结论:应用酵母双杂交系统筛选出Na⁺, K⁺-ATPase与hALR具有相互作用。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

人脐带间充质干细胞治疗老年心肌梗死的CD34＋细胞、Toll样受体2和Toll样受体4的表达水平分析

目的 探讨循环CD34＋细胞（CD34＋）、Toll样受体2（toll like receptor 2, TLR2）和Toll样受体4（toll like receptor 4, TLR4）表达水平对人脐带间充质干细胞治疗老年人陈旧性心肌梗死的影响.方法 采用流式细胞仪检测经皮冠状动脉介入治疗（PCI）＋支架植入术患者（对照组）和PCI＋支架植入术＋人脐带间充质干细胞移植术患者（实验组）循环CD34＋、TLR2和TLR4的表达水平与心肌梗死面积和左心室射血分数（LVEF）的关系.评估CD34＋、TLR2和TLR4对细胞心肌成形术早期预后的影响.结果 对照组行PCI＋支架植入治疗后8周梗死面积为（26.6±3.4）%、LVEF为（38.4±2.8）%;实验组行PCI＋支架植入术＋人脐带间充质干细胞移植治疗后8周梗死面积为（24.2±3.9）%、LVEF为（46.1±1.9）%,两组比较差异均具有统计学意义（P〈0.01）.对照组治疗后8周CD34＋为（0.9±0.2）×109/L,实验组治疗后8周CD34＋为（1.4±0.1）×109/L;对照组治疗后8周TLR2为（5.9±2.2）平均荧光强度（MFI）和TLR4为（3.7±1.8）MFI,PCI＋支架植入术＋人脐带间充质干细胞移植治疗后8周TLR2为（3.6±0.3）MFI和TLR4为（2.2±1.3）MFI.两组患者治疗后8周CD34＋、TLR2和TLR4水平之间有显著差异（P〈0.01）.结论 CD34＋、TLR2和TLR4表达水平变化与人脐带间充质干细胞移植患者心肌梗死面积的缩小和LVEF的改善相关.