人卵母细胞孤雌激活获得囊胚国内首报

孤雌激活是对卵母细胞在第二次减数分裂中期（MII）进行刺激，使之保持二倍体状态下发生有丝分裂获得早期胚胎发育。人卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚，可为人类干细胞建系提供崭新的来源，由此产生的胚胎干细胞称为孤雌胚胎干细胞。此研究已在许多哺乳动物物种中进行，如小鼠、牛、猴已获得囊胚，并在小鼠和猴成功进行了干细胞建系，目前成为国科学家的关注与研究热点。     

羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究

目的卵母细胞孤雌激活是胚胎体外生产的一项重要技术。本试验通过乙醇、离子霉素和6-DMAP不同浓度和不同激活时间的优化组合，提高孤雌激活效果和孤雌胚发育能力。方法与结果试验1，体外成熟的卵母细胞经5M离子霉素或7％的乙醇激活5min，然后在6-DMAP中激活4h，6-DMAP的浓度设置为0．5mM、1．0mM、2．0mM和3．0mM；结果表明，浓度为2．0mM和3．0mM6-DMAP激活的卵母细胞卵裂率（37．50％）显著高于其他各组（P〈0．01）。试验2，体外成熟的卵母细胞经5M离子霉素激活5min，然后在2．0mM6-DMAP中激活1h、3h、5h、7h和9h；结果表明，卵母细胞在6-DMAP中激活5h和7h其囊胚率（12．38％和10．48％）显著高于其他各组（P〈0．01）。结论本研究认为Ionomycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇与Ionomycin简单便捷。     

兔卵母细胞的超数排卵与孤雌激活

目的:探索兔卵母细胞的最佳超排方法及孤雌激活的条件,为人-兔异种核移植提供充足的兔卵母细胞. 方法:采用不同剂量的垂体促卵泡素(FSH)对青年兔和经产兔进行超数排卵,获得兔卵母细胞后,以不同强度的直流电脉冲对兔卵母细胞进行孤雌激活. 结果:在排卵总数方面,3个激素组均高于对照组(P＜0.05),且FSH 25 U激素组(31.80±3.27)与FSH 80 U 聚乙烯吡咯酮(PVP)激素组(31.83±3.06)均高于FSH 15 U激素组(15.00±1.58),经产兔优于青年兔(P<0.05);在200 V/mm组孤雌激活兔卵母细胞的卵裂率(85.59%)和4～8细胞期发育率(21.19%)最高,与240 V/mm组(71.43%, 10.48%)之间存在统计学差异(P＜0.05). 结论:FSH 25 U及FSH 80 U PVP方案均能产生最佳超排效果,经产兔优于青年兔;电场强度200 V/mm,脉宽40 μs,2次脉冲、间隔1 s为兔成熟卵母细胞的较理想的激活条件.     

钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人体外成熟卵母细胞孤雌激活作用的研究

目的：探讨钙离子载体A23187或联合嘌呤霉素（puromyein）对人类体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用。方法：收集体外培养成熟的人卵母细胞124枚,根据体外成熟培养的时间分为24、48、72h组。分别采用A23187、A23187联合嘌呤霉素进行孤雌激活,然后应用荧光原位杂交（FISH）技术对孤雌胚胎进行性染色体分析。结果：A23187或联合嘌呤霉素能激活体外成熟的卵母细胞．激活率分别为38．9％、71．8％;二者联合应用能有效地提高孤雌胚胎的发育潜能。随着体外成熟培养的时间延长．A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞激活率呈下降趋势;其中24、48h组成熟的卵母细胞激活率和胚胎发育潜能显高于72h组。FISH对9个孤雌胚胎的性染色体分析示,7个孤雌胚胎为XX,2个为X。结论：钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活人体外成熟卵母细胞．形成的孤雌胚胎核型多数为双倍体。     

不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活的实验观察

目的　建立合适的小鼠卵母细胞孤雌激活方法。方法　取不同卵龄小鼠卵母细胞 ,运用不同浓度的氯化锶和不同强度的电脉冲对其进行活化 ,观察小鼠卵母细胞激活率和体外发育状况。结果　① 14、16和 18h卵龄组卵母细胞经 10mmol LSrCl2 处理后 ,三组的激活率随卵龄的增长而提高 ,分别为 2 1 1%、4 1 8%和 73 7% ,组间差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;卵母细胞离体后在激活前体外培养 3h也能提高其激活率 ,但当卵龄达到一定时 (18h) ,体外培养激活率不再提高。② 5 0、10 0、15 0mmol L三种浓度的SrCl2 均能有效地激活小鼠卵母细胞 ,激活率分别为 5 8 5 %、6 8 95和 70 9% ,与对照组和 1 6mmol L组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。③卵母细胞的激活率随处理时间的延长而提高 ,30、6 0、12 0、2 4 0minSrCl2 处理时间的激活率分别为 4 4 9%、5 6 1%、6 8 9%、77 0 % ,相隔两组之间差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。④ 1 5kV cm ,16 0 μs和 1 0kV cm ,32 0 μs脉冲刺激下的卵母细胞激活率显著高于 1 8kv cm ,90 μs脉冲刺激组 (5 8 5 %vs2 7 1%、6 9 1%vs2 7 1% ,P <0 0 5 ) ,前两组之间差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　小鼠卵母细胞孤雌激活率与卵龄和激活方案有关 ;氯化锶浓度、作用时间和     

小鼠孤雌激活胚胎细胞因子分泌水平研究现状

孤雌激活是指MII期卵母细胞通过人工刺激（化学或物理等方法）激活,完成第二次的减数分裂、卵裂从而形成早期胚胎。此过程不需精子刺激,故也叫孤雌生殖。近年来,孤雌生殖技术是生殖生物学研究的热点之一,是一种无性生殖技术,在创建胚胎干细胞系方面有重要的作用。在遗传学研究中,因小鼠与人类的遗传学背景相似,故常被用作哺乳类实验动物。本综述即是关于小鼠孤雌激活胚胎细胞因子分泌水平的研究。     

骨髓间充质干细胞条件培养液对小鼠卵母细胞的孤雌激活作用

目的 研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)条件培养液对小鼠MII卵母细胞的孤雌激活作用及胚胎发育能力.方法 分离、培养小鼠MSC,获取MSC条件培养液(conditioned medium of MSC,CM).通过促排技术获取小鼠MII卵母细胞,分别采用CM、7%乙醇、IVF方法激活,体视显微镜下观察原核形成及囊胚形成率.在CM激活后不同时间点,利用α/β-tubulin抗体标记纺锤体,激光共聚焦显微镜下观察有/无细胞松弛素B(CB)存在时纺锤体的运动变化.结果 CM可以激活小鼠MII卵母细胞,最佳刺激时间为40 min,激活率达到95.4%,囊胚形成率为62%,与7%乙醇组比较无显著差异,但明显低于IVF组(95.4%vs.100%;62%vs.88%,P＜0.01).CB可以抑制纺锤体的旋转,阻止第二极体的排出,促进二倍体孤雌胚形成,提高囊胚形成率(62%vs.9%,P＜0.01).结论 CM能有效激活小鼠MⅡ卵母细胞并促进孤雌发育.     

卵母细胞人工孤雌激活研究进展

孤雌激活是指处于第二次减数分裂中期卵母细胞不经过雄性配子的作用,而在某些理化因素的刺激下恢复并完成减数分裂,进行有丝分裂发育到胚胎的过程。卵母细胞的激活是以Ca2 为第二信使,成熟促进因子(MPF)、细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、细胞静止因子(CSF)等细胞因子灭活综合作用的结果。人工孤雌激活方法包括物理性激活和化学性激活以及联合激活方法,人卵母细胞的孤雌激活多以化学激活为主。孤雌激活的效果与激活方法、卵母细胞的卵龄、来源和培养条件等有关。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活

目的 探讨一种有效的孤雌激活方法。方法 用乙醇、Ca^2＋载体A23187分别联合6-二甲氨基嘌呤对小鼠卵母细胞进行孤雌激活。结果 7％乙醇卵母细胞活化率、囊胚形成率分别达80.88％、10.29％、;5μmol/L Ca^2＋A23187卵母细胞活率、囊胚形成率分别达86.88％、11.48％。两者差异无显著性。结论 应用乙醇、Ca^2＋载体A23187联合6-二甲氨基嘌呤处理小鼠卵母细胞,均可实现小鼠卵母细胞孤雌发育。     

人未受精及受精未分裂卵母细胞超微结构研究

目的 应用透射电子显微镜观察人未受精及受精未分裂卵母细胞的超微结构,分析卵母细胞受精失败、受精后不分裂的原因.方法 分别将收集的体外受精(in vitro fertilization,IVF)及卵胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)时受精失败、受精未分裂的卵母细胞进行固定、脱水、包埋、超薄切片,透射电子显微镜下观察超微结构.结果 常规IVF受精失败成熟卵母细胞主要呈现的超微结构:①透明带正常,但卵膜下未见皮质颗粒,精核呈浓缩状态,周围未见线粒体、滑面内质网(SER)泡等细胞器围绕;②透明带为异常紧密状结构,卵膜下有一层线形排列皮质颗粒,线粒体为其主要的细胞器,缺少SER集合管、SER泡等细胞器,有时可见透明带内存在顶体完整的精于.ICSI时未受精的第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞呈现的超微结构:①可见卵膜下一层线形排列皮质颗粒,SER集合管、SER泡常与线粒体相连;注射的精子已褪去核膜,部分染色质已去浓缩;②皮质颗粒极少或分散存在,未在卵黄膜下排列;缺乏线粒体、SER集合管等细胞器或者线粒体孤立存在.受精未分裂卵母细胞呈现的超微结构:卵周隙内可见皮质颗粒排放的皮质内容物,线粒体数量少,胞质内有许多小脂滴填满的脂褐体;环纹片层(annulate lamellae,AL)异常聚集且成丛分布于胞浆中.结论 常规IVF卵胞质中细胞器异常分布导致卵母细胞胞质不成熟影响其受精能力;透明带结构异常及诱导顶体反应缺陷可导致精子穿透障碍;卵母细胞激活失败与ICSI受精失败有关;脂褐体的出现及AL异常聚集与受精卵不分裂有关.     

三种不同来源人未成熟卵母细胞的体外成熟

目的：探讨三种不同来源的人未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）的差异。方法：共获得未成熟卵母细胞1055枚,包括卵丘复合物（OCC）613枚和裸卵（DO）442枚。其中OCC分为自然周期组、孕晚期组和IVM纽;DO分为自然周期组、孕晚期组和超促排卵纽。所有未成熟卵母细胞在IVM培养体系体外培养成熟后,卵母细胞胞浆内单精子注射（ICSI）受精序贯培养,除IVM组行第2或第3天胚胎移植外,其余均培养至囊胚阶段。分别比较OCC和DO各组未成熟卵母细胞的成熟率、成熟卵母细胞的受精率、卵裂率;自然周期组和孕晚期组的囊胚形成率。结果：OCC：自然周期组、孕晚期组及IVM组的未成熟卵母细胞体外成熟率分别为79．5％、74．3％和82．2％,孕晚期组与IVM周期组相比具有统计学差异;3组成熟卵母细胞受精率、卵裂率及自然周期组和孕晚期组的囊胚形成率相比无统计学差异,IVM组的移植周期妊娠率为20％。DO：自然周期组、孕晚期组及超促排卵组未成熟卵母细胞体外成熟率超促排卵组最高（86．0％）,明显高于自然周期组（74．5％）和孕晚期组（72．7％）,（P〈0．05和〈0．01）。3组未成熟卵母细胞的成熟率、成熟卵母细胞的受精率、卵裂率、囊胚形成率相比未见统计学差异。结论：孕晚期来源的未成熟卵母细胞在体外同样具有发育潜能;孕晚期的卵母细胞可作为一种供卵来源。     

关于人类基因组密码全面破译的伦理思考

人类基因组密码的破译是人类科学史上的一次革命,同时也带来一系列社会伦理道德的挑战,这些挑战包括基因歧视、基因隐私权的保护、基因治疗的滥用、优生学的担忧等,笔者认为需要制定相关的法律法规来迎接这些挑战。     

人卵母细胞的电脉冲辅助激活

[目的]探讨电脉冲刺激进行人卵母细胞的人工辅助激活的可行性。[方法]不同卵龄和来源的人卵母细胞分为4组,49个新鲜成熟的卵母细胞作为A组,42个常规体外受精(IVF)中未受精的成熟卵母细胞为B组,C组为卵浆内单精子注射(ICSI)后未受精卵母细胞57个,D组为体外培养48h的ICSI后未受精卵母细胞37个,所有卵母细胞以直流电脉冲刺激2次,观察电脉冲刺激后卵母细胞激活和胚胎发育情况。[结果]A组卵母细胞激活率为43％(21/49),与B、C、D3组相比偏低,差异具有统计学意义(P均<0.05),A组中激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体(IPN+2PB),而C组和D组则以二原核二极体(2PN+2PB)占多数。A、B、C组激活后卵母细胞分裂率分别为81％(17/21),83％(24/29)和88％(38/43),较D组(19％,5/26)显著增加(P<0.01),在电脉冲刺激后第3天,A、B、C组分别有18％(3/17),29％(7/24),31％(11/35)的胚胎发育到8-细胞阶段。[结论]不同来源和卵龄的人卵母细胞在电脉冲刺激后表现为不同的激活类型和胚胎发育情况,直流电脉冲作为一种有效的卵母细胞人工激活方法可以应用于辅助受精。     

冷冻对人类成熟及未成熟卵发展潜能的影响

目的：探索冷冻卵子的成熟时期，方法：将153个生发泡期(GV期)人类卵子分为3组，对照组：体外培养至成熟(MⅡ期)，行单精子胞浆内注射(ICSI)，MⅡ期冷冻组：体外成熟至MⅡ，然后将MⅡ期卵子进行冷冻，解冻后将存活的卵子行ICSI；GV期冷冻组：将GV期卵子进行冷冻，解冻后体外培养至MⅡ，然后再行ICSI．用慢速冷冻快速解冻的方法对成熟的和未成熟的卵子进行冷冻和解冻，观察体外成熟情况、解冻后的存活情况、受精情况及胚胎发育情况，结果：体外成熟率：GV期冷冻组51.2％，对照组为70．0％，有显差异；受精率：3组分别为68、0％、33、3%、42.1％，有显差异．对照组的发展潜能要显优于试验组；GV期冷冻组的存活率、受精率优于MⅡ期冷冻组。结论：冷冻会对卵子的发育潜能有1定的损伤，在GV期进行冷冻可降低这种伤害。     

大肠杆菌表达重组人IL-8分离纯化工艺的建立

目的　建立重组人IL - 8(rhIL - 8)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺 ,以便获得高纯度的重组蛋白。方法　将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB10 1,经IPTG诱导进行高效表达。将离心收集到的菌体用超声破壁分离 ,收集包涵体和胞浆 ,其中包涵体部分经变性和复性处理后 ,与胞浆部分合并 ,进行肝素亲和层析柱分离 ,再经离子交换柱和凝胶层析柱过滤 ,得到最终纯品。蛋白纯度用SDS -PAGE鉴定 ,ELISA法检测重组IL - 8含量。检测纯化后重组蛋白的生物学活性和热源质。结果　用大肠杆菌HB10 1表达重组人IL - 8,具有较高的表达量 (2 5mg/ml) ,其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在。经多步柱层析纯化后 ,可获得高纯度的重组IL- 8蛋白 (纯度 >95 % )。该蛋白在体外具有趋化中性粒细胞游走的作用 ,兔温法检测热源质含量符合要求。结论　大肠杆菌可高效表达rhIL - 8,该工艺流程可从大肠杆菌载体中获得具有生物学活性的高纯度rhIL - 8。     

人精子甘露糖受体对地鼠卵母细胞超微结构的影响

目的 研究人精子甘露糖受体(MR)在精卵融合中的作用.方法 去透明带金黄地鼠卵经不同浓度的纯化人精子MR作用后,用透射电子显微镜观察卵母细胞超微结构的变化.结果 MR作用卵母细胞后,卵母细胞内的皮质颗粒(CG)减少,并伴随有CG胞吐现象,同时卵母细胞表面的微绒毛数量减少.结论 MR作用于卵母细胞表面后,可触发CG胞吐,并促使卵母细胞表面微绒毛减少,提示MR在介导精子与卵母细胞识别与融合中起作用.     

未受精人卵母细胞及废弃胚胎线粒体基因的表达

目的检测人卵和胚胎中线粒体基因组的表达,探讨线粒体基因表达水平与卵母细胞发育潜能的关系。方法收集临床常规体外授精(IVF)和单精子卵胞浆内注射(ICSI)不受精的成熟卵母细胞以及不适合移植和冷冻保存的胚胎,单个细胞裂解液制备单个卵母细胞或胚胎总RNA,半定量逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)检测线粒体DNA(mtDNA)编码的5个呼吸链蛋白基因的mRNA含量。结果在所有未受精人卵和胚胎中都检测到了线粒体5种基因的mRNA;未受精人卵ND2、ND5、COⅡ、Cytb、ATP酶6的mRNA含量分别为:(0.38±0.16)、(0.75±0.31)、(0.49±0.22)、(0.74±0.30)(、0.53±0.24),明显低于胚胎中相应5种基因mRNA的含量,其分别为(2.16±0.41)、(3.40±0.53)(、2.40±0.40)(、3.26±0.46)(、2.32±0.42),与胚胎的mRNA含量相比,均P<0.01;三原核胚胎和发育阻滞胚胎的5种基因mRNA水平差异没有显著性意义。结论线粒体基因表达下降可能参与卵母细胞不受精的机制,并与卵母细胞的发育潜能有关。     

卵胞浆内单精子注射后人精子激活鼠卵母细胞能力的研究

目的 :研究各种质量精子的鼠卵母细胞激活能力。方法 :选用 2 0～ 2 5 g昆明种雌性白鼠 ,超排卵取卵细胞 ,用 Percoll密度梯度离心法处理正常精液、少精、弱精、畸精以及冷冻后的正常精液 ,选择优质的精子进行显微注射 ,计算卵母细胞激活率、卵细胞形态正常率。结果 :各种质量精液中优选的精子激活鼠卵母细胞能力差异无显著性 ( P>0 .0 5 )。结论 :人精子激活鼠卵母细胞能力与最初精液状态没有直接的相关性 ,它不受精子数量、活力、运动性及形态的影响