Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0～2 h内逐渐升高,在2～4 h内却逐渐降低;PTHrP在0～2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2～4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。     

牵张应力对Hedgehog通路相关基因和细胞增殖的影响研究

目的：观察牵张力下Hh通路相关基因的表达以及牵张力对成骨细胞增殖的影响,探索机械应力对成骨细胞的调控机制。方法：应用Flexcell4000TM加力系统对大鼠成骨细胞施加0．5Hz,3％、6％和9％的张应变,作用时间4h、12h和24h。用机械通道抑制剂三氯化钆（GdCI。）对成骨细胞进行干预。采用流式细胞技术测定细胞周期分布与细胞增殖变化,定量PCR检测Hedgehog通路相关基因Ihh、Shh、Ptch和Smo的表达。采用SAS8．0软件包对结果进行统计分析。结果：不同强度、不同作用时间的张应变对Ihh表达量的上调作用亦不相同,6％张应变作用24h的对Ihh表达量上调最为明显,其下游基因Ptch和Smo的表达变化与Ihh类似;上述上调Ihh表达的作用均可被GdCl3抑制。;6％同30％牵张力相比,更能促进成骨细胞的增殖。结论：Ihh基因对力学刺激敏感;Ihh基因表达量的变化与成骨细胞的增殖相关。     

IGF-1对体外培养髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的：：研究IGF-1对IL-1β诱导的颞下颌关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法：组织块培养法分离培养人髁突软骨细胞,通过细胞形态观察和免疫细胞化学染色进行鉴定。将培养的细胞分为：对照组、IL-1β组(10μg/L)、 IL-1β+IGF-1组(0、1、10、50、100μg/L), MTT法检测各组细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3以及p38 MAPK/NF-κB蛋白表达变化。结果：人髁突软骨细胞生长状态良好,甲苯胺蓝染色胞质呈深蓝色,II型胶原呈阳性表达。与对照组比较,IL-1β组细胞增殖能力、Bcl-2/Bax比值明显降低,早凋与晚凋细胞百分数、Caspase-3、p38 MAPK/NF-κB蛋白表达均明显增加;与IL-1β组比较,1~100μg/L IGF-1预处理组细胞增殖能力、Bcl-2/Bax比值逐渐上升(P<0.05),细胞凋亡率、Caspase-3、p38 MAPK /NF-κB蛋白表达则逐渐下调(P<0.05),均呈现一定的浓度依赖性。结论：IGF-1可抑制IL-1β诱导的髁突软骨细胞凋亡并减轻p38 MAPK/NF-κB的活化。     

渐进性咬合紊乱大鼠的髁突软骨中Ihh、Smo及Ptch1表达变化

目的 探讨Indian Hedgehog（Ihh）及其受体Smoothened （Smo）和Patched1 （Ptch1）在渐进性咬合紊乱的大鼠髁突软骨-骨改建中的表达变化情况.方法 选用24只8周龄雌性SD大鼠,实验组施以渐进性咬合紊乱,分别于20和24周后取材,苏木精-伊红染色观察组织形态变化,免疫组化及实时定量PCR方法检测Ihh、Smo和Ptch1的表达情况.结果 髁突软骨后部20周实验组明显增厚（F=4.39,P=0.003）,但24周组有所缓解.免疫组化检测24周实验组Ihh的表达水平高于对照组（F=3.78,P=0.02）,而20周实验组Smo的表达水平高于对照组（F=5.16,P=0.04）.实时定量PCR结果显示,20周实验组Ihh （F=7.80,P=0.012）和Smo（F=15.67,P=0.003）的mRNA水平均高于对照组;24周实验组Ihh的mRNA水平表达水平显著高于对照组（F=13.34,P=0.013）,Ptch1的表达差异无统计学意义（F=1.34,P=2.13）.结论 渐进性咬合紊乱促进了大鼠髁突软骨中Ihh及其受体Smo的高表达.     

TNF-α刺激髁突软骨细胞产生白细胞介素-34的研究

目的通过观察TNF-α对髁突软骨细胞分泌白细胞介素-34(IL-34)及表达IL-34 mRNA基因的影响,探讨IL-34在颞下颌关节紊乱病中的致病机制。方法取第三代髁突软骨细胞,培养过程于培养液中加入不同浓度(0、1、10、20、50 ng/m L)的TNF-α培养24 h以及同一浓度(10 ng/m L)TNF-α分别培养1、3、6、10、24 h后,收集培养上清液及细胞,分别用ELISA和RT-PCR方法测定IL-34浓度以及IL-34 mRNA的表达情况。结果 1实验组和对照组髁突软骨细胞上清液中均能检测到IL-34。2TNF-α刺激髁突软骨细胞IL-34mRNA基因表达,并呈正相关关系。结论 TNF-α能刺激髁突软骨细胞产生IL-34。     

ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖及成软骨分化的作用。方法:采用酶消化法提取小鼠髁突软骨细胞并鉴定。体外采用siRNA沉默小鼠髁突软骨细胞中Alk2基因的表达,通过MTT法检测细胞增殖。通过实时定量RT-PCR方法检测软骨细胞标志基因的表达。结果:倒置显微镜观察体外培养的小鼠髁突软骨细胞形态。免疫组化染色显示COLⅠ强阳性,AGGRECAN弱阳性,COLⅡ弱阳性。Pellet培养后实时定量RT-PCR检测发现ColⅡ,ColⅩ和ColⅠ表达上调。证实所分离的细胞是髁突软骨细胞。MTT结果显示Alk2沉默后细胞数量增加,实时定量RT-PCR结果显示Alk2沉默后软骨细胞基因表达下调,并有显著统计学意义。结论:ALK2抑制小鼠髁突软骨细胞的增殖,促进小鼠髁突软骨细胞的成软骨分化。     

rhIL—1β及TGF—β对髁状突软骨细胞增殖影响的研究

目的：探讨rhIL-1β及TGF－β对髁状突软骨细胞增殖的影响。方法：以酶消化法获得兔髁状突软骨细胞。用MTT法及PCNA免疫组化染色检测不同浓度rhIL-1β及TGF－β对体外培养的兔髁状突软骨细胞增殖的影响。结果：MTT检测，rhIL-1β（10，20ng/ml）处理软骨细胞48h后，可明显抑制软骨细胞增殖，经统计学检验，处理3－6d有显著性差异（P＜0．01,t检验）；加入TGF－β（10，20ng/ml)可明显拮抗rhIL-1β对软骨细胞增殖的抑制作用，并且浓度愈高对rhIL-1β的抑制作用愈强。PCNA检测，rhIL-1β处理软骨细胞后PCNA阳性细胞率降低，随rhIL-1β的刺激浓度增加，阳性率明显降低；加入外源性TGF－β可以使PCNA的阳性率提高。结论：rhIL-1β对髁状突软骨细胞增殖具有报制作用，外源性TGF－β对该作用具有明显的拮抗效应。     

rhIL-1β及TGF-β对髁状突软骨细胞增殖影响的研究

目的 :探讨rhIL 1β及TGF β对髁状突软骨细胞增殖的影响。 方法 :以酶消化法获得兔髁状突软骨细胞。用MTT法及PCNA免疫组化染色检测不同浓度rhIL 1β及TGF β对体外培养的兔髁状突软骨细胞增殖的影响。结果 :MTT检测 ,rhIL 1β( 10、2 0ng/ml)处理软骨细胞 4 8h后 ,可明显抑制软骨细胞增殖 ,经统计学检验 ,处理 3～ 6d有显著性差异 (P <0 .0 1,t检验 ) ;加入TGF β( 10、2 0ng/ml)可明显拮抗rhIL 1β对软骨细胞增殖的抑制作用 ,并且浓度愈高对rhIL 1β的抑制作用愈强。PCNA检测 ,rhIL 1β处理软骨细胞后PCNA阳性细胞率降低 ,随rhIL 1β的刺激浓度增加 ,阳性率明显降低 ;加入外源性TGF β可以使PCNA的阳性率提高。 结论 :rhIL 1β对髁状突软骨细胞增殖具有抑制作用 ,外源性TGF β对该作用具有明显的拮抗效应     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

下颌骨髁状突软骨发育中的细胞凋亡及增殖

目的：研究胎儿下颌骨髁状突软骨细胞凋亡及增殖情况。方法：32例胎儿下颌骨髁状软骨标本按胎龄分为两组：A组（13－22周）；B组（23－33周）。采用原位末端标记法（TUNEL）及免疫组织化学法观察胎儿髁状突软骨发育不同时中的细胞凋亡及PCNA的表达，并对表达结果作定量分析。结果：两胎龄组中均有PCNA及TUNEL阳性表。PCNA、TUNEL染色以增殖层阳性细胞率最大，其次为成软骨细胞层，肥大软骨细胞层最小，B组PCNA染色强于A组，A组TUNEL染色强于B超。A组TUNEL／PCNA大于B组，TUNEL／PCNA在肥大软骨细胞层大于成软骨细胞层，增殖层最大小。结论：细胞凋亡与细胞增殖在胎儿颗状突软发育中具有一定意义。     

Indian Hedgehog在牵张力促进成骨细胞增殖中的作用研究

目的观察Hedgehog（Hh）信号在牵张力调控成骨细胞增殖中的作用。方法体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,应用Flexcell 4000TM加力系统施加3%和6%的2种牵张应变。用N端Hedgehog重组蛋白（N-Shh）、Hedgehog通道抑制剂环巴胺（cy）和机械通道抑制剂三氯化钆（GdCl3）对成骨细胞进行干预。分别采用细胞计数、甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和流式细胞仪检测成骨细胞的增殖。采用SAS 8.0软件包对结果进行统计分析。结果在成骨细胞体外培养过程中,牵张力促进了成骨细胞的增殖,以6%牵张应变更显著;牵张力仍能促进经cy处理后的成骨细胞的增殖,但这种促进作用能被GdCl3抑制。结论牵张力促进成骨细胞增殖的作用有一部分是通过上调Ihh的表达实现的。     

生理和药理浓度下1，25（OH）2D3对软骨细胞增殖、成熟和钙化的影响研究

目的　体外观察生理和不同药理浓度的1,25（OH）2D3对原发性股骨头软骨细胞（femoral chondrocytes,FCs）和继发性髁突软骨细胞（condylar chondrocytes,CCs）增殖、成熟和钙化的影响。方法　通过分离培养1周龄雌性SD仔鼠的FCs和CCs,体外分为6组：（1）空白对照组（不做处理）;（2）溶剂组（0.01%酒精处理）;（3）～（6）分别为0.1、1、10、100 nmol/L 1,25（OH）2D3处理组。各组按相应处理因素处理24 h后通过CCK8检测对2种软骨细胞增殖能力的影响,并对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COLⅡ）以及X型胶原（collagen X,COL X）进行 qRT-PCR和Western blot检测。结果　（1）CCK8检测结果显示,1,25（OH）2D3呈浓度依赖性抑制2种软骨细胞的增殖,且CCs的抑制率较FCs明显;PCNA的qRT-PCR和Western blot检测结果与之基本一致。（2）相对于空白对照组,体外生理浓度（0.1 nmol/L）的1,25（OH）2D3对2种软骨细胞COLⅡ的表达影响差异无统计学意义（P＞0.05）,药理浓度（1、10、100 nmol/L）的1,25（OH）2D3可上调2种软骨细胞COLⅡ的表达,其中FCs最佳浓度在10 nmol/L,而CCs呈浓度依赖性上升。（3）相对于空白对照组,1,25（OH）2D3对2种软骨细胞COL X的mRNA和蛋白水平表达均无统计学意义（P＞0.05）。结论　体外1,25（OH）2D3呈浓度依赖性抑制软骨细胞增殖,药理浓度的1,25（OH）2D3可促进软骨细胞成熟,且其对CCs的影响较FCs显著;而其对2种软骨细胞的钙化无影响。     

Shh及其受体Ptc1、Ptc2在鼠帽状期磨牙的基因表达

目的 观察信号分子Sonic Hedgehog(Shh)及其受体Ptcl、Ptc2在小鼠下颌第一磨牙帽状期的基因表达，以探讨Shh信号路径在牙胚形态发育早期的作用。方法 制备昆明小鼠磨牙形态发育早期标本(E10．5～E15．5)，常规HE染色观察组织形态。免疫组化SP法对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)进行定位研究。原位杂交法分析Shh、Ptcl、Ptc2 mRNA在牙胚中的表达与分布。结果 E14．5，内、外釉上皮，星网状层及牙乳头细胞PCNA阳性，大部分釉结细胞PCNA阴性，少量釉结细胞PCNA阳性。Shh、Ptcl、Ptc2 mRNA在内、外釉上皮、星网状层及釉结中均有表达。结论 在帽状期，信号分子Shh可能经自分泌或旁分泌途径作用于釉结以外的上皮和间充质，促进其增殖。     

Ihh signaling regulates mandibular symphysis development and growth

Symphyseal secondary cartilage is important for mandibular development, but the molecular mechanisms underlying its formation remain largely unknown. Here we asked whether Indian hedgehog (Ihh) regulates symphyseal cartilage development and growth. By embryonic days 16.5 to 18.5, Sox9-expressing chondrocytes formed within condensed Tgfβ-1/Runx2-expressing mesenchymal cells at the prospective symphyseal joint site, and established a growth-plate-like structure with distinct Ihh, collagen X, and osteopontin expression patterns. In post-natal life, mesenchymal cells expressing the Ihh receptor Patched1 were present anterior to the Ihh-expressing secondary cartilage, proliferated, differentiated into chondrocytes, and contributed to anterior growth of alveolar bone. In Ihh-null mice, however, symphyseal development was defective, mainly because of enhanced chondrocyte maturation and reduced proliferation of chondroprogenitor cells. Proliferation was partially restored in dual Ihh;Gli3 mutants, suggesting that Gli3 is normally a negative regulator of symphyseal development. Thus, Ihh signaling is essential for symphyseal cartilage development and anterior mandibular growth.     

甲状旁腺相关蛋白及其受体PTH1R及Ihh信号在鼠胚髁突软骨中的分布特征

目的探讨甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)及其受体PTH1R及Ihh信号在髁突软骨发育过程中的分布特征及意义。方法取E14~18 d鼠胚,以免疫组化及原位杂交染色方法,检测PTH1R抗体及PTHrPI、hh mRNA在下颌髁突软骨发生过程中的分布特征。结果在鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1R主要表达于软骨膜间质细胞、软骨细胞及大部分肥大软骨细胞中,Ihh主要位于肥大软骨细胞上层及其与扁平细胞层交界处,PTHrP及Ihh信号可能通过自分泌和(或)旁分泌作用调控髁突软骨细胞的增殖和分化。结论鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1RI、hh的分布特征与其在生长板分布不同,提示PTHrP可能对髁突全层软骨细胞均具有增殖促进作用。