人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及迁移能力的影响

目的探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及迁移能力的影响。方法将人骨肉瘤细胞U2-OS分为阴性对照组(Control组)和实验组(CK药物组),MTT方法与CCK-8方法检测细胞活性及增殖能力,细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测侵袭相关蛋白MMP-9及MMP-2的表达。结果CK能够显著降低U2-OS细胞体外活性及生存率(P0.05);细胞划痕实验及Transwell法证明CK可抑制U2-OS体外迁移能力(P0.05);CK处理后U2-OS细胞的MMP-9及MMP-2表达水平下调(P0.05)。结论人参皂苷CK对骨肿瘤细胞U2-OS的抑制作用与下调MMP-9及MMP-2表达水平相关。     

miR-129-5p靶向调控VCP抑制骨肉瘤细胞体外迁徙侵袭

目的 探讨miR-129-5p是否靶向调控VCP基因抑制骨肉瘤细胞迁徙侵袭.方法 构建miR-129-5p过表达及低表达的慢病毒载体,转染骨肉瘤细胞U2-OS;采用实时荧光定量PCR检测上调及下调miR-129-5p的U2-OS细胞中miR-129-5p的表达量;采用RT-PCR和Western blot技术检测VCP mRNA和蛋白表达;采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁徙、侵袭情况.结果 实时荧光定量PCR结果显示U2-OS细胞中miR-129-5p表达被明显上调或下调;RT-PCR和Western blot检测结果显示:miR-129-5p上调U2-OS细胞组中VCP mRNA和蛋白表达水平显著低于阴性对照细胞组(阴性慢病毒转染);miR-129-5p下调U2-OS细胞组中VCP mRNA和蛋白表达水平显著高于阴性对照细胞组;miR-129-5p上调U2-OS细胞迁徙和侵袭力显著低于阴性对照细胞,miR-129-5p下调的U2-OS细胞迁徙和侵袭力显著高于阴性对照细胞.结论 miR-129-5p靶向调控VCP的表达而抑制骨肉瘤细胞迁徙和侵袭能力.     

Gab2在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及意义

目的:探讨Grb2协同结合蛋白2(Gab2)在人骨肉瘤细胞系中的表达及其与人骨肉瘤细胞侵袭转移的关系。方法:应用小RNA干扰技术,将合成的小RNA干扰质粒转染给人骨肉瘤U2-OS细胞,采用Western blotting和RT-PCR法检测转染后Gab2的蛋白和mRNA表达水平;体外细胞趋化运动实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:Gab2在人骨肉瘤U2-OS细胞系中高表达,且转染Gab2 siRNA后的细胞(Si Gab2/U2-OS)中Gab2蛋白及mRNA的表达水平低于转染scramble siRNA细胞(Scr/U2-OS)和U2-OS;趋化运动实验发现在10μg/L表皮生长因子(EGF)的诱导下Si Gab2/U2-OS细胞的迁移能力较U2-OS和Scr/U2-OS细胞明显下降,差异有统计学意义(P0.01);Si Gab2/U2-OS细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量均比Scr/U2-OS细胞和U2-OS细胞少,Si Gab2/U2-OS细胞的体外侵袭能力显著降低(P0.01)。结论:利用siRNA干扰技术降低Gab2的表达对人骨肉瘤U2-OS细胞的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用。     

穿心莲内酯对骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其机制

目的:探究穿心莲内脂(AG)对人骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其潜在的机制。方法:体外培养人骨肉瘤143B细胞,使用不同浓度(0~20μmol/L)的AG处理143B细胞,分别用结晶紫染色、MTT法和集落形成实验来检测AG对143B细胞增殖的影响。划痕愈合实验检测骨肉瘤143B细胞的迁移能力。Transwell小室实验检测骨肉瘤143B细胞的侵袭能力。Hoechst 33258染色实验和流式细胞术检测AG对骨肉瘤细胞凋亡的影响。不同浓度AG处理后,使用Western blot检测骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的水平。应用Western blot进一步检测Wnt信号通路中的β-catenin及其相关分子c-Myc的表达量。结果:与空白组相比,AG处理组中143B骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.05),且呈浓度依赖性。迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶9(MMP-9)、波形蛋白(vimentin)和Snail蛋白的水平均下调(均P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达量升高,凋亡相关蛋白caspase-3的蛋白水平下降而cleaved caspase-3的蛋白水平升高,同时Wnt信号通路相关蛋白β-catenin和c-Myc的表达水平均明显下调(P<0.01)。结论:穿心莲内酯可能通过抑制Wnt信号通路的活性,从而达到抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭能力,并且促进其凋亡。     

腺病毒介导的BMP9过表达抑制人骨肉瘤细胞系143B的增殖与迁移

目的 探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)过表达对人骨肉瘤细胞系143B的生物学行为的影响.方法 用RTPCR和Western blot检测骨肉瘤细胞系中BMP9的内源性表达,用表达BMP9的腺病毒重组体(adBMP9)感染内源性表达BMP9相对较低的骨肉瘤细胞系,Transwell法检测细胞侵袭,划痕愈合实验检测细胞迁移,MTT法和结晶紫染色法检测细胞的增殖,Hoechst 33258染色法检测凋亡,平板集落形成实验检测集落形成能力.结果 adBMP9可以明显减弱骨肉瘤细胞系143B的增殖、迁移、侵袭及集落形成能力(P＜0.05),并促进细胞凋亡.结论 adBMP9能抑制人骨肉瘤细胞系143B的增殖和迁移,促进细胞凋亡.     

反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭和迁移的抑制作用

目的:探讨微小RNA-196a(miR-196a)在胰腺癌细胞系中表达状况及反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞生物学行为的影响。方法:miR-196a采用实时荧光定量PCR检测。人工化学合成反义miR-196a并转染PANC-1细胞。CCK-8法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡情况。通过划痕损伤实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验检测PANC-1细胞侵袭和迁移能力。构建野生型及突变型核因子κB抑制蛋白α(NFKBIA)3'UTR的萤光素酶报告载体,检测海肾萤光素酶的相对活性以验证miR-196a对NFKBIAmRNA的作用靶点。结果:人胰腺癌细胞系中miR-196a呈高表达;转染反义miR-196a后,PANC-1细胞miR-196a表达下降,其细胞增殖和凋亡无显著改变(P>0.05);而转染反义miR-196a组中通过Transwell小室的细胞数明显低于各对照组(P<0.01)。与各对照组相比,共转染野生型NFKBIA的3'UTR和反义miR-196a可使海肾萤光素酶相对活性显著提高。结论:miR-196a可能是癌微RNA(oncomiR)之一,有望成为人胰腺癌基因治疗的候选靶点。     

miR-30a抑制人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力

目的探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B侵袭、迁移和细胞活力的影响。方法过表达或抑制miR-30a分别处理人骨肉瘤细胞143B。划痕实验观察细胞划痕愈合能力;Transwell实验检测143B细胞迁移和侵袭能力;MTT实验检测细胞活力;定量PCR实验确认过表达miR-30a腺病毒有效性并且检测RUNX2 mRNA表达;Western blot检测细胞中RUNX2总蛋白表达。结果过表达miR-30a抑制了骨肉瘤细胞143B迁移和侵袭(P0.05),在72 h时,miR-30a明显抑制细胞活力(P0.01);抑制miR-30a的内源性表达后,143B细胞的迁移和侵袭能力增加(P0.05),细胞活力也表现出上升水平(P0.01);同时过表达miR-30a可以抑制RUNX2的蛋白表达,抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表达增加(P0.05)。荧光素酶活性检测,miR-30a可以靶向于RUNX2(P0.01)。结论 miR-30a抑制骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力,其作用可以能是通过抑制RUNX2的表达来实现。     

慢病毒介导的c-metRNA干扰对人乳头状甲状腺癌K1细胞生物学行为的影响

目的: 探讨c-Met在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达;构建针对人c-met基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察其对K1细胞c-met基因的沉默效应及对细胞生物学行为的影响。方法: 免疫组化方法检测35例乳头状甲状腺癌及25例良性甲状腺疾病手术切除标本中c-Met的表达;构建人c-met基因的RNAi慢病毒载体,应用荧光定量RT-PCR与Western blotting检测其对c-met的干扰效率,应用克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验检测其对细胞克隆形成、周期、迁移、侵袭能力的影响,应用裸鼠模型评估RNA干扰后细胞成瘤能力的影响。结果: c-Met在PTC中的表达明显高于良性甲状腺组织;成功构建了c-met RNAi慢病毒载体,RT-PCR及Western blotting实验显示其对乳头状甲状腺癌K1细胞c-met mRNA 及蛋白表达的抑制均较明显;克隆形成实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测显示c-met RNAi慢病毒载体能够减少S细胞比列;划痕实验及Transwell实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制细胞迁移和侵袭;裸鼠成瘤实验显示RNA干扰后细胞的成瘤能力降低。结论: c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力、细胞周期进程、迁移、侵袭及成瘤能力。     

下调CENP-W对人脑胶质瘤U87细胞的影响

目的:研究下调着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)的表达水平对人脑胶质瘤U87细胞的影响。方法:采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人脑胶质瘤U87细胞CENP-W的表达,采用RT-qPCR和Western blot法评价siRNA的干扰效果,采用MTT法、BrdU实验和平板集落形成实验测定细胞的增殖,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:MTT实验、平板集落形成实验和BrdU实验显示转染siRNA的实验组U87细胞的增殖能力、集落形成能力较空白对照组及阴性对照组明显降低;Transwell实验和划痕实验显示实验组细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组及阴性对照组明显减弱;流式细胞术分析表明实验组细胞的细胞周期被阻滞在G_0/G_1期;实验组细胞凋亡比例较对照组增多(P0.05)。结论:下调CENP-W的表达可抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞的凋亡,提示CENP-W有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

左旋含羞草碱诱导骨肉瘤细胞凋亡作用及机制的体外实验研究

目的体外实验研究左旋含羞草碱诱导骨肉瘤细胞的凋亡作用,并初步探讨其中的分子机制。方法体外培养骨肉瘤细胞系MG-63及U2-OS,给予0 M,100 M,200 M和400 M的左旋含羞草碱处理,同时在400 M的左旋含羞草碱中加入100 mg/m L柠檬酸铁胺(FAC)处理。CCK-8法检测骨肉瘤细胞系增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Hoechst染色法检测细胞核固缩比例,蛋白印迹检测左旋含羞草碱及FAC处理后骨肉瘤细胞DNA损伤修复相关蛋白表达。结果 CCK-8法检测细胞增殖,当左旋含羞草碱浓度为400 M时,MG-63及U2-OS的细胞抑制率可分别达到81.1%±1.6%和76.7%±2.1%;流式细胞术检测发现左旋含羞草碱处理48 h后,MG-63及U2-OS的细胞凋亡率分别为54.1%±12.6%和46.2%±14.7%;Hoechst染色法显示,MG-63及U2-OS的细胞核固缩比例分别为53.8%±10.6%和49.2%±8.3%,而加入FAC后,则可以减弱左旋含羞草碱对骨肉瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用;同时,蛋白印迹检测表明DNA损伤修复的关键蛋白表达水平在左旋含羞草碱及FAC处理后均发生显著改变。结论左旋含羞草碱可以有效抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导骨肉瘤细胞凋亡,其分子机制与左旋含羞草碱的铁螯合作用有关。     

敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶靶向能量代谢逆转骨肉瘤恶性生物学的行为

目的 探讨敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH) 靶向能量代谢对人骨肉瘤143B细胞恶性生物学行为及成骨分化的影响。 方法 Real-time PCR及Western blotting检测PHGDH在成骨细胞hFOB1.19和不同恶性程度骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中的表达。采用脂质体转染法将短发夹RNA（shRNA）-PHGDH重组质粒转染至143B细胞中, Real-time PCR和Western blotting检测PHGDH的表达变化；结晶紫染色法、细胞计数法、CCK-8实验检测细胞增殖；划痕实验检测细胞平行迁移能力，Transwell实验检测细胞垂直迁移及侵袭能力；Annexin V-FITC/PI双染法、DAPI染色法检测细胞凋亡；碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S染色检测成骨分化作用,Western blotting检测成骨分化指标Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OC)的表达情况；Real-time PCR检测能量代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1（(GLUT1）、6-磷酸果糖激酶1（PFK1）、M2型丙酮酸激酶（PKM2）、乳酸脱氢酶A（LDHA)的表达，乳酸检测试剂盒测定乳酸分泌量，三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒检测ATP产生量。 结果 PHGDH在143B细胞中的表达明显高于在hFOB1.19、MG63和TE85细胞中(P<0.01)；转染shRNA-PHGDH重组质粒使143B细胞中的PHGDH表达量降低(P<0.01)、增殖能力降低(P<0.01)、细胞迁移及侵袭能力减低(P<0.01)、凋亡率增高(P<0.01)、ALP染色阳性率增加(P<0.01)、茜素红染色阳性率增加(P＜0.05)、Runx2(P<0.05)和OC的表达增高(P<0.01)、能量代谢相关基因(GLUT1、PFK1、PKM2、LDHA)的表达下调(P<0.01)、乳酸减少(P<0.01)、ATP增多(P<0.05)。 结论 敲低PHGDH可通过能量代谢抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭, 促进其凋亡, 并促进其成骨分化。     

长链非编码RNA TTTY15在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞活力和侵袭的影响

目的:观察长链非编码RNA TTTY15在骨肉瘤组织及细胞株中的表达,并探讨其对骨肉瘤细胞活力和侵袭的影响。方法:应用qPCR法检测11例骨肉瘤组织及其瘤旁组织中TTTY15的水平,同时检测TTTY15在骨肉瘤细胞株(143B、Saos2、MG-63、U2OS和HOS)和人成骨细胞株hFOB1.19中的表达。在表达量最高的细胞株(MG-63)中通过转染小干扰RNA敲减TTTY15的表达,CCK-8法检测TTTY15低表达对细胞活力的影响,流式细胞术检测其对细胞周期的影响,Transwell检测其对细胞侵袭能力的影响,qPCR检测miR-216b-5p和FOXM1 mRNA的表达,Western blot法检测相关蛋白的变化。结果 :与瘤旁正常组织相比,TTTY15在骨肉瘤组织中表达升高(P0.01);与人成骨细胞相比,TTTY15在骨肉瘤细胞株中表达升高(P0.05),其中在MG-63细胞中表达水平最高(P0.01)。敲减TTTY15在MG-63细胞的表达后,细胞活力降低(P0.05),细胞周期被抑制在G_0/G_1期(P0.01),细胞的侵袭能力降低(P0.01),miR-216b-5p mRNA表达水平升高(P0.01),FOXM1的mRNA表达降低(P0.01),同时FOXM1、CDK4、cyclin D1、MMP-2和N-cadherin的蛋白表达降低,而E-cadherin的蛋白表达升高(P0.05)。结论:TTTY15在骨肉瘤组织和细胞株中表达增高,敲减TTTY15的表达可抑制骨肉瘤细胞的活力和侵袭能力,其机制可能与TTTY15低表达导致miR-216b-5p的表达升高,引起FOXM1基因表达下调有关。     

穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响

目的:观察穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响并探讨初步的作用机制。方法:CCK-8法检测不同浓度(0、5、10、20和40μmol/L)的穿心莲内酯对SKOV-3细胞作用不同时间(12、24、36和48h)后,SKOV-3细胞存活率的变化;Transwell法与TUNEL法分别检测SKOV-3细胞侵袭能力与凋亡能力的变化;Western blot法检测p-PI3K、p-Akt与p-mTOR蛋白水平的变化。结果:CCK-8法检测结果显示,随着浓度增加与培养时间延长,穿心莲内酯对SKOV-3细胞存活率的抑制程度增强;采用20μmol/L穿心莲内酯培养SKOV-3细胞36h后,SKOV-3细胞的侵袭数明显降低,凋亡数明显增加(P0.05),p-PI3K、p-Akt与p-mTOR的蛋白水平明显降低(P0.05)。结论:穿心莲内酯能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的活力与侵袭能力,增强凋亡能力,这可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

siRNA沉默TAp73对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭力的作用研究

目的　探讨通过siRNA沉默细胞TAp73蛋白表达对骨肉瘤Saos-2细胞的增殖、周期以及侵袭力的作用研究。 方法 以骨肉瘤Saos-2细胞系为研究对象,设计合成沉默TAp73的siRNA片段,转染入Saos-2细胞,用Western-blot法检测干扰后TAp73蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖,利用流式细胞仪检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力。 结果 Western-blot检测显示siRNA对TAp73蛋白表达有显著下调作用;CCK-8检测实验组细胞增殖明显(P<0.05);细胞周期检测显示细胞处于DNA合成期（S期）的细胞比例上升;穿过人工基底膜的细胞数量也明显增加,由（84.17±1.35）增加为（92.67±2.80 ）(P<0.05)。 结论 抗癌基因TAp73在骨肉瘤的增殖、凋亡和侵袭过程中发挥有重要作用,可能成为控制肿瘤增殖和转移的关键性因素。     

低氧对巨噬细胞外泌体的表达及其对骨肉瘤细胞的化疗抗性影响的体外研究

目的在体外探究低氧对巨噬细胞外泌体分泌的影响及对骨肉瘤细胞顺铂耐药性的改变。方法Transwell侵袭实验检测不同氧浓度(1%O2的低氧与常氧)条件下骨肉瘤细胞MG63对巨噬细胞的趋化能力;在低氧与常氧条件下将MG63与巨噬细胞进行共培养,流式细胞术及RT-PCR检测巨噬细胞的分化;分离纯化来源于不同氧浓度条件下培养的M2型巨噬细胞外泌体,利用透射电镜、纳米粒径、Western blot进行鉴定,双免疫荧光进行示踪MG63对外泌体的摄取;克隆形成实验及流式细胞术检测来源于不同氧浓度下的巨噬细胞外泌体对MG63的增殖、凋亡影响;CCK-8检测来源于不同氧浓度下的巨噬细胞外泌体对MG63顺铂耐药性的影响。结果低氧能够促进骨肉瘤细胞对巨噬细胞的趋化能力,并进一步诱导巨噬细胞向M2型分化;成功分离不同氧浓度下培养的M2巨噬细胞外泌体,且低氧能够显著上调巨噬细胞对外泌体的分泌;低氧能够明显上调巨噬细胞外泌体对骨肉瘤细胞增殖能力的促进作用,抑制骨肉瘤细胞发生凋亡,并上调骨肉细胞对顺铂的耐药性。结论在体外低氧能够促进骨肉瘤细胞对巨噬细胞的趋化能力,并进一步通过诱导巨噬细胞向M2型分化及提高M2型巨噬细胞外泌体的分泌,进而上调骨肉瘤细胞的增殖能力,抑制其凋亡,最终导致骨肉瘤细胞产生顺铂耐药性。     

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞迁移中的作用

 目的: 探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)迁移中的作用。方法: siRNA沉默TRPC1; CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡; 细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测E-钙黏蛋白和vimentin的蛋白表达。结果: TGF-β1刺激细胞后,TGF-β1组细胞的迁移距离大于对照组(P < 0.01)。TGF-β1组和TRPC1沉默组的细胞活力和凋亡与对照组相比差异不显著;与TGF-β1组细胞比较,siRNA和 TGF-β1 共同作用组迁移能力明显降低(P < 0.01)。与 TGF-β1 组相比,siRNA沉默TRPC1和 TGF-β1 共同作用组E-钙黏蛋白的蛋白表达明显降低(P < 0.05),而vimentin的蛋白表达明显增强(P < 0.05)。结论: TRPC1通过调节E-钙黏蛋白和vimentin 的蛋白表达参与了TGF-β1诱导人支气管上皮细胞迁移的过程。